Реконструкция кровотока в модели трансплантации сердца брюшной мыши

Резюме

Продемонстрирована новая методика реконструкции кровотока в гетеротопной модели трансплантации сердца брюшной мыши.

Аннотация

Хирургическая техника гетеротопной абдоминальной трансплантации сердца у мышей является стандартной моделью для исследований в области трансплантационной иммунологии. Здесь представлена установленная методика реконструкции модифицированного кровотока в гетеротопической модели абдоминальной трансплантации сердца. Этот метод использует интраторакическую нижнюю полую вену (IIVC) вместо легочной артерии донорского сердца для анастомоза нижней полой вены реципиента. Это облегчает и улучшает показатели успеха при трансплантации брюшного сердца у мышей.

Введение

Хирургическая методика гетеротопной абдоминальной трансплантации сердца у мышей представляет собой стандартную модель для исследований в области трансплантационной иммунологии^1,2,3. Тем не менее, это очень сложно выполнить, и это означает ограничение на широкое использование этой модели^4,5.

При традиционной трансплантации сердца мыши (THTx) донорская аорта и брюшная аорта реципиента анастомозируются, в то время как легочная артерия анастомозируется к реципиенту нижней полой вене^6,7,8.

В этой модифицированной технике трансплантации сердца мыши донорская аорта анастомозируется к брюшной аорте реципиента, а донор IIVC анастомозируется к реципиенту нижней полой вене^(3,4,6) (Рисунок 2 и Рисунок 3).

протокол

Все эксперименты на животных проводились в соответствии с руководящими принципами директивы 2010/63/EU Европейского парламента о защите животных, используемых в научных целях (одобрено Этическим комитетом, #G1071/09).

ПРИМЕЧАНИЕ: Предварительная подготовка, анестезия, послеоперационный уход и мониторинговые работы такие же, как и в традиционных хирургических методах^1,2,4. Мыши BALB/c служили донорами сердца, а C57BL/6J — реципиентами трансплантата. Мыши были в возрасте 8-12 недель, весили ~ 30 г при трансплантации и были размещены в стандартных условиях.

1. Подготовительные шаги

1. Для анестезии давайте мышам ингаляционный изофлуран (2%) до тех пор, пока они не заснут, с последующими внутрибрюшинными инъекциями кетамина (100 мг/кг) + ксилазина (10 мг/кг) + ацепромазина (2 мг/кг). При послеоперационном обезболивание применяют Метамизол (200 мг/кг) п.о. и Карпрофен (5 мг/кг) с.c..
   ПРИМЕЧАНИЕ: Применение антибиотиков было намеренно воздержано, так как эти вещества могут влиять на иммунологические реакции.
2. Для хирургии используйте набор микроскопических инструментов, включая микрона ножницы, микрощипцы, держатель иглы и микро гемостатические зажимы. Также необходима электрохирургическая ручка. Выполняйте швы с использованием нейлонов типов 7/0er, 10/0er и 4/0er.
3. Поместите мышь в коробку для ингаляции изофлурана (2%) в течение 40-60 секунд. Определяют глубину анестезии, сжимая лапу пинцетом. Если наблюдается полное отсутствие реакции на этот раздражитель, переходите к следующему шагу.
4. Как только мышь уснет, взвесьте мышь.
5. Нанесите внутрибрюшинную инъекцию кетамина (100 мг/кг) + ксилазина (10 мг/кг) + ацепромазина (2 мг/кг) анестезированной мыши.
6. Обрежим брюшной мех и положите мышь на операционный стол. Выполните дезинфекцию с использованием повидона йодида 3 раза, затем правильно задрапируйте мышь с помощью фенестрированного хирургического полотенца.

2. Процедура работы донора

1. Используйте ножницы, чтобы разрезать кожу от шеи до нижней части живота и отшелушить весь слой кожи до средней линии обеих подмышечных вмести.
2. С помощью ножниц разрезайте мышцы брюшной стенки и осторожно переместите внутренние органы влево (с м. по мнению оператора). Оберните внутренние органы соленой впитанной марлей, чтобы безопасно обнажить нижнюю полую вену.
3. Используйте шприц 1 мл для введения 0,4 мл раствора гепарина (содержит 500 ЕД гепарина) медленно в нижнюю полую вену и подождите 1 минуту, прежде чем вытащить иглу.
4. Вытащите иглу и используйте микронарезами, чтобы разрезать как нижнюю полую вену, так и брюшную аорту, чтобы ускорить экссангинацию.
5. Используйте ножницы, чтобы открыть грудную полость, выполнив U-образный разрез; полностью обнажают сердце, легкие и все грудные кровеносные сосуды.
   1. Обнажите грудную аорту, отрежьте 1/2 просвета, а затем перережьте легочную вену, чтобы облегчить орошение и дренаж.
   2. Вводят в отверстие грудной аорты оросительную трубку, вводят не менее 2 мл холодного гистидин-триптофана-кетоглутарата раствора кардиоплегии (раствор Custodiol HTK)⁹ до тех пор, пока отток легочной вены не будет полностью очищен и сердце полностью перестанет биться.
6. Вытащите оросительную трубку и отсоедте грудину.
7. Используйте микросульчицы, чтобы удалить тимус и слегка удалить жир вокруг дуги аорты.
8. Используйте прямые и изогнутые щипцы для обнажения и перевязания ствола легочной артерии (с правой стороны дуги аорты) швом 10/0.
9. Используйте микрощипцы для отделения жира и соединительной ткани, прикрепленной к IIVC, обнажите и обложите верхнюю полую вену (на левой стороне дуги аорты) швом 7/0 и используйте микроножницы, чтобы разрезать ее за лигированием.
10. Сделайте шов 7/0 вокруг основания сердца под дугой аорты, IIVC и обеими ушными раковинами. Затем перевязывают ветви легочной артерии и венозные сосуды легких.
11. Используйте микроножницы для трансектирования дуги аорты как можно более дистально, легочных сосудов под лигатурой и IIVC возле диафрагмы. Удалите сердце из грудной клетки.
12. Поместите сердце эксплантированного донора в холодный раствор HTK для кардиоплегии HTK при температуре 4 °C и временно сохраните.

3. Порядок работы получателя

ПРИМЕЧАНИЕ: Начальные этапы операции аналогичны тем, которые были показаны ранее для мыши-донора, включая анестезию и дезинфекцию.

1. Выполнить порез кожи живота поперечно, накрыть органы брюшной полости влажной марлей с использованием физиологического раствора.
2. Используйте микрощипцы, чтобы обнажить нижнюю полую вену и брюшную аорту и освободить их от окружающей жировой ткани.
3. Используйте микрощипцы для лигирования или электрокаутеризации боковых ветвей сосудов (боковых или под веной /аортой) ниже почечных сосудов.
4. Используйте щипцы-зажимы-аппликаторы для размещения двух микрохемостатических зажимов в брюшной части вены/аорты, идущих справа, оставляя расстояние более 1 см для обеих аорты/вен, чтобы обеспечить пространство для построения анастомоза между ними.
5. Используйте микроножницы, чтобы сделать разрез в аорте немного ближе к нижнему зажиму, чем к верхнему зажиму. В качестве альтернативы, используйте иглу 30 G, чтобы сделать небольшое отверстие и открыть его микроножницами.
6. Расположите мышь-получателя так, чтобы аорта была обращена к оператору с полой веной на другой стороне. Затем поместите сердце в брюшную полость и накройте его небольшой мокрой марлевой подушечкой.
7. Используйте шов 10/0 для адаптации и сшивания донорской аорты к аорте реципиента, начинающейся каудально, сделайте узел и продолжайте бегущим швом к верхней части разреза (около 4-5 швов). Затем переверните сердце вправо (с зрения субъекта), снова накройте его и продолжайте шов с левой стороны до достижения каудального конца и завязывайте его.
8. Используйте оросительную трубку для инъекции не менее 0,5 мл раствора кардиоплегии HTK 4 °C для промывки IIVC донора.
9. С помощью микронарезами вырезать круглое отверстие на брюшной нижней полой вене реципиента, которое должно иметь тот же размер донорского просвета IIVC. Разрез должен располагаться над анастомотическим отверстием аорты. Сделайте разрез вен больше, чем разрез аорты.
10. Используйте шов 10/0, чтобы пришить донора IIVC к полой вене реципиента, начиная с каудально. Завяжите узел и выполните бегущий шов до тех пор, пока не будет достигнута верхняя часть разреза. Наложим пять швов и продолжим шов слева. Наконец, завяжите узел в хвостовом углу, и осторожно затяните (будьте осторожны, чтобы не тянуть слишком туго).
11. Поместите небольшие части гемостатической губки вокруг вен и анастомозов аорты.
12. Используйте щипцы-зажимы аппликатора, чтобы удалить сначала нижние, а затем верхние микро-гемостатические зажимы и промыть брюшную полость 38,0 ° C закаленным 0,9% хлоридом натрия.
13. Используйте микрощипцы, чтобы убрать гемостатическую губку.
14. Наблюдайте за сердцебиением пересаженное сердце.
15. Используйте щипцы, чтобы вернуть кишечник обратно в брюшную полость, и двухслойные швы (мышцы живота, за которыми следует кожа), чтобы закрыть брюшную рану швом 4/0.
16. Поместите мышей в камеру рабочей станции контроля кислорода и температуры (например, INVIVO2-400), чтобы обеспечить теплую и богатую кислородом среду для восстановления пересаженного мышей, подождите, пока мыши проснутся.
17. Для послеоперационного обезболивания непосредственно введите Метамизол 200 мг/кг в секунду после операции. Через четыре и 16 часов после операции дают Метамизол 200 мг/кг на ОС+ Карпрофен (5 мг/кг) с.c. При дальнейшем последующем следовании вдавайте карпрофен (5 мг/кг) с.c трансплантированных мышам каждые 24 часа в течение трех последовательных дней после операции.

Результаты

Здесь представлена модифицированная методика гетеротопной абдоминальной трансплантации сердца у мышей, которая была ранее разработана в нашей лаборатории и доказала свою полезность в течение последних 16 лет. Ранее сообщалось, что в общей сложности в 40 случаях анастомоза полой вены к ...

Обсуждение

Хирургическая техника гетеротопной трансплантации брюшного сердца у мышей очень сложна, и это означает ограничение широкого использования этой модели.

Одним из недостатков обычной методики является предельная длина легочной артерии (ПА) донора. Обычно он составляет ок...

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
30G-needles	Braun	456300
acepromazine	CP Pharma	Tranquisol P
BALB/c AnNCrl mice	Charles River. Germany	no catalog number
Bepanthen eye ointment	Haus-Apotheke	PZN 01578675
Bonn Micro Forceps	FST	11083-07
Box for insulation and oxygen supply device	RUSKINN	INVIV
C57BL/6J  mice	Charles River. Germany	no catalog number
Carprofen	Zoetis	Rimadyl 50 mg/ml
CATHETER-FEP 26G	TERUMO	Surflo-W
Clip Applicator Forceps Style	FST	18057-14
Curved forceps	WPI	14114-G
custodiol/HTK	Dr. Franz Köhler Chemie	no catalog numer
Cutasept skin disinfection	VWR	BODL980365
electrosurgical pen	Bovie	CHANGE-A-TIP
gauze pads, cotton swabs	Lohmann-Rauscher	13353
Heating mat	THERMO MAT PRO 30W	HTP-30
Hemostatic sponge	CuraSpon	J1276A
heparine-solution	Haus-Apotheke	PZN 03029820
Ice box	PETZ	No Catalog Number available
Inhalation anesthesia device	GROPPLER	BKGM 0616
insulation and oxygen supply device	RUSKINN	INVIV
isoflurane	CP Pharma	Isofluran CP 1 ml/ml
ketamine	Zoetis	no catalog numer
metamizole	WDT	no catalog numer
Micro scissors	FST	15000-00,15000-10
Micro Serrefine ( Clamp ) Angled / 16 mm	FST	18055-06
Microscope	Leica	LEICAMZ6
Microscope light	SCHOTT	KL2500LED
Saline solution (NaCl 0.9%)	Haus-Apotheke	PZN 06178437
Scissors	Peha Instruments	991083/4
small Petri dish	Sarstedt	833900
Straight forceps	WPI	14113-G
surgical tape	BSN	4120
Suture Tying Forceps - 10 cm	FST	18025-10
Sutures(10-0)	Medtronic	N2540
Sutures(4-0)	ETHILON	V4940H
Sutures(7-0)	ETHILON	1647H
Syringe (0.3 mL)	BD	324826
Syringe (1 mL)	BD	320801
xylazine	Bayer	Rompun