Rekonstruktion des Blutkreislaufs in einem abdominalen Mausherztransplantationsmodell

Zusammenfassung

Eine neuartige Technik zur Rekonstruktion des Blutkreislaufs in einem heterotopen abdominalen Mausherztransplantationsmodell wird demonstriert.

Zusammenfassung

Die Operationstechnik der heterotopen abdominalen Herztransplantation bei Mäusen ist ein Standardmodell für die Forschung in der Transplantationsimmunologie. Hier wird die etablierte Technik für eine modifizierte Blutkreislaufrekonstruktion in einem heterotopen abdominalen Herztransplantationsmodell vorgestellt. Diese Methode verwendet die intrathorakale vena cava inferior (IIVC) anstelle der Lungenarterie des Spenderherzens für die Anastomose zur unteren Hohlvene des Empfängers. Es erleichtert und verbessert die Erfolgsraten für abdominale Herztransplantationen bei Mäusen.

Einleitung

Die Operationstechnik der heterotopen abdominalen Herztransplantation bei Mäusen stellt ein Standardmodell für die Forschung in der Transplantationsimmunologie^{dar 1,2,3}. Es ist jedoch sehr schwierig durchzuführen und dies impliziert eine Einschränkung der weit verbreiteten Verwendung dieses Modells^4,5.

Bei der traditionellen Mausherztransplantation (THTx) werden die Spenderaorta und die Empfängerabentraorta anastomosiert, während die Lungenarterie anastomosiert wird, um die Vena cava inferior des Empfängers zu astomosieren^6,7,8.

Bei dieser modifizierten Mausherztransplantationstechnik wird die Spenderaorta anastomosiert an die Empfänger-Bauchaorta und der Spender IIVC wird an die Empfänger-Vena cava inferior anastomosiert^(3,4,6) ( Abbildung2 und Abbildung 3).

Protokoll

Alle Tierversuche wurden nach den Richtlinien der Richtlinie 2010/63/EU des Europäischen Parlaments zum Schutz von Tieren, die für wissenschaftliche Zwecke verwendet werden, durchgeführt (Ethikausschuss genehmigt, #G1071/09).

HINWEIS: Vorbereitende Vorbereitung, Anästhesie, postoperative Pflege und Überwachungsarbeiten sind die gleichen wie bei traditionellen chirurgischen Methoden^1,2,4. BALB/c-Mäuse dienten als Herzspender und C57BL/6J als Transplantatempfänger. Mäuse waren 8-12 Wochen alt, wogen bei der Transplantation ~ 30 g und wurden unter Standardbedingungen untergebracht.

1. Vorbereitende Schritte

1. Zur Anästhesie geben Mäuse inhalatives Isofluran (2%) bis zum Einschlafen, gefolgt von intraperitonealen Injektionen von Ketamin (100 mg/kg) + Xylazin (10 mg/kg) + Acepromazin (2 mg/kg). Zur postoperativen Analgesie Metamizol (200 mg/kg) p.o. und Carprofen (5 mg/kg) s.c.
   HINWEIS: Auf die Anwendung von Antibiotika wurde absichtlich verzichtet, da diese Substanzen die immunologischen Reaktionen beeinflussen können.
2. Verwenden Sie für die Operation eine Reihe mikroskopischer Instrumente, darunter eine Mikroschere, eine Mikrozange, einen Nadelhalter und mikro hämostatische Klemmen. Ein elektrochirurgischer Stift ist ebenfalls notwendig. Führen Sie Nähte mit 7/0er, 10/0er und 4/0er Nylontypen durch.
3. Legen Sie die Maus in eine Box zur Isofluran-Inhalation (2%) für 40-60 Sekunden. Bestimmen Sie die Tiefe der Anästhesie, indem Sie die Pfote mit einer Pinzette zusammendrücken. Wenn es einen völligen Mangel an Reaktion auf diesen Reiz gibt, fahren Sie mit dem nächsten Schritt fort.
4. Sobald die Maus eingeschlafen ist, wiegen Sie die Maus.
5. Tragen Sie eine intraperitoneale Injektion von Ketamin (100 mg/kg) + Xylazin (10 mg/kg) + Acepromazin (2 mg/kg) auf die betäubte Maus auf.
6. Befestigen Sie das Bauchfell und legen Sie die Maus auf den Operationstisch. Führen Sie die Desinfektion mit Povidoniodid für 3 Mal durch und drapieren Sie die Maus dann ordnungsgemäß mit einem fenestrierten chirurgischen Handtuch.

2. Verfahren der Spenderoperation

1. Verwenden Sie eine Schere, um die Haut vom Hals bis zum Unterbauch zu schneiden, und schälen Sie die gesamte Hautschicht bis zur Mittellinie beider Achselhöhlen ab.
2. Schneiden Sie mit einer Schere die Muskeln der Bauchdecke ab und bewegen Sie die Eingeweide vorsichtig nach links (aus der Sicht des Bedieners). Wickeln Sie die Eingeweide mit einer salzhaltigen Gaze weg, um die vena cava inferior sicher freizulegen.
3. Verwenden Sie eine 1 ml Spritze, um 0,4 ml der Heparinlösung (enthält 500 U Heparin) langsam in die untere Hohlvene zu injizieren und warten Sie 1 Minute, bevor Sie die Nadel herausziehen.
4. Ziehen Sie die Nadel heraus und schneiden Sie mit einer Mikroschere sowohl die Vena cava inferior als auch die Bauchaorta ab, um die Exsanguination zu beschleunigen.
5. Verwenden Sie eine Schere, um die Brusthöhle zu öffnen, indem Sie einen U-förmigen Schnitt durchführen. legen Herz, Lunge und alle Blutgefäße der Brust vollständig frei.
   1. Legen Sie die thorakale Aorta frei, schneiden Sie 1/2 des Lumens und schneiden Sie dann die Lungenvene, um die Bewässerung und Drainage zu erleichtern.
   2. Führen Sie ein Spülrohr in die Öffnung der thorakalen Aorta ein, injizieren Sie mindestens 2 ml 4 °C kalte Histidin-Tryptophan-Ketoglutarat-Kardioplegielösung (Custodiol HTK-Lösung)^9, bis der Lungenvenenabfluss vollständig klar ist und das Herz vollständig aufhört zu schlagen.
6. Ziehen Sie das Bewässerungsrohr heraus und lösen Sie das Brustbein.
7. Verwenden Sie eine Mikroschere, um den Thymus zu entfernen und das Fett um den Aortenbogen leicht zu entfernen.
8. Verwenden Sie eine gerade und gekrümmte Zette, um den Stamm der Arteria pulmonalis (auf der rechten Seite des Aortenbogens) mit einer 10/0-Naht freizulegen und zu ligieren.
9. Verwenden Sie eine Mikrozette, um das fette und bindegewebe am IIVC befestigte Fett und Bindegewebe zu trennen, die obere Hohlvene (auf der linken Seite des Aortenbogens) mit einer 7/0-Naht freizulegen und zu ligieren, und schneiden Sie sie mit einer Mikroschere hinter die Ligatur.
10. Machen Sie eine 7/0-Naht um die Basis des Herzens unter dem Aortenbogen, dem IIVC und beiden Ohrmuscheln. Dann ligaieren Sie die Lungenarterienäste und venösen Lungengefäße.
11. Verwenden Sie eine Mikroschere, um den Aortenbogen so distal wie möglich, die Lungengefäße unter der Ligatur und das IIVC in der Nähe des Zwerchfells zu transektieren. Entfernen Sie das Herz aus der Brust.
12. Das explantierte Spenderherz in eine 4 °C kalte HTK-Kardioplegielösung geben und vorübergehend konservieren.

3. Verfahren für die Empfängeroperation

HINWEIS: Die ersten Operationsschritte ähneln denen, die zuvor für die Spendermaus gezeigt wurden, einschließlich Anästhesie und Desinfektion.

1. Führen Sie die Bauchhaut quer geschnitten durch, bedecken Sie die Bauchorgane mit einer nassen Gaze mit Kochsalzlösung.
2. Verwenden Sie eine Mikrozette, um die Untervene und die Bauchaorta freizulegen und sie vom umgebenden Fettgewebe zu befreien.
3. Verwenden Sie eine Mikrozette, um seitliche Zweiggefäße (seitlich oder unter der Vene / Aorta) unterhalb der Nierengefäße zu ligieren oder zu elektrokauterisieren.
4. Verwenden Sie eine Clip-Applikatorzange, um zwei mikro hämostatische Klemmen am bauchigen Teil der Vene / Aorta von rechts zu positionieren, so dass mehr als 1 cm Abstand für beide Aorta / Vene bleibt, um Platz für den Aufbau der Anastomose zwischen ihnen zu gewährleisten.
5. Verwenden Sie eine Mikroschere, um einen Schnitt in die Aorta etwas näher an der unteren Klemme als an der oberen Klemme zu machen. Alternativ können Sie mit einer 30 G-Nadel ein kleines Loch machen und mit einer Mikroschere öffnen.
6. Positionieren Sie die Empfängermaus so, dass die Aorta dem Bediener mit der Hohlvene auf der anderen Seite zugewandt ist. Dann legen Sie das Herz in die Bauchhöhle und bedecken Sie es mit einem kleinen nassen Mullkissen.
7. Verwenden Sie eine 10/0-Naht, um die Spenderaorta an die Kaudatanute des Empfängers anzupassen und zu nähen, einen Knoten zu machen und mit einer laufenden Naht bis zur Oberseite des Schnitts fortzufahren (ca. 4-5 Stiche). Als nächstes drehen Sie das Herz nach rechts (aus der Sicht des Subjekts), bedecken Es erneut und setzen Sie die Naht auf der linken Seite fort, bis Sie das kaudale Ende erreichen und es knoten.
8. Verwenden Sie ein Bewässerungsröhrchen, um mindestens 0,5 ml 4 °C HTK-Kardioplegielösung zu injizieren, um den IIVC des Spenders zu spülen.
9. Verwenden Sie eine Mikroschere, um ein rundes Loch auf der unteren Hohlvene des Empfängers zu schneiden, das die gleiche Größe wie das IIVC-Lumen des Spenders haben sollte. Der Schnitt sollte sich oberhalb der anastomotischen Aortenöffnung befinden. Machen Sie den Venenschnitt größer als den Aortenschnitt.
10. Verwenden Sie eine 10/0-Naht, um den Spender IIVC an die Vena cava des Empfängers zu nähen, beginnend kaudal. Binden Sie einen Knoten und führen Sie eine laufende Naht durch, bis die Oberseite des Schnitts erreicht ist. Verwenden Sie fünf Stiche und setzen Sie die Naht auf der linken Seite fort. Zum Schluss einen Knoten in der Heckecke binden und vorsichtig festziehen (achten Sie darauf, nicht zu fest zu ziehen).
11. Legen Sie die kleinen Teile des hämostatischen Schwammes um die Vene und Aortenaneastomosen.
12. Verwenden Sie eine Clip-Applikatorzange, um zuerst die unteren und dann die oberen mikro-hämostatischen Klemmen zu entfernen und die Bauchhöhle mit 38,0 ° C temperiertem 0,9% Natriumchlorid zu spülen.
13. Verwenden Sie eine Mikrozette, um den hämostatischen Schwamm zu entfernen.
14. Beobachten Sie den Herzschlag des transplantierten Herzens.
15. Verwenden Sie eine Zette, um den Darm wieder in die Bauchhöhle zu bringen, und zweischichtige Nähte (Bauchmuskeln, gefolgt von Haut), um die Bauchwunde mit einer 4/0-Naht zu schließen.
16. Legen Sie die Mäuse in eine Sauerstoff- und Temperaturkontroll-Arbeitsplatzkammer (z. B. INVIVO2-400), um eine warme und sauerstoffreiche Umgebung für die Transplantatmäuse zu schaffen, um sich zu erholen, warten Sie, bis die Mäuse aufwachen.
17. Bei postoperativer Analgesie metamizol nach der Operation direkt 200 mg/kg pro os verern. Vier und 16 Stunden nach der Operation geben Sie Metamizol 200 mg/kg pro os+ Carprofen (5 mg/kg) s.c. In der weiteren Nachbeobachtung carprofen (5 mg/kg) s.c an den transplantierten Mäusen alle 24 Stunden an drei aufeinanderfolgenden Tagen nach der Operation.

Ergebnisse

Hier wird eine modifizierte Technik der heterotopen abdominalen Herztransplantation bei Mäusen vorgestellt, die zuvor in unserem Labor entwickelt wurde und sich in den letzten 16 Jahren als nützlich erwiesen hat. Zuvor wurde berichtet, dass in insgesamt 40 Fällen von Vena cava zu vena cava (V-V-Gruppe) im Vergleich zu 40 Fällen der traditionellen Lungenarterie zu vena cava (P-V-Gruppe) Anastomose Verfahren⁴ (Tabelle 1) die Gefäßanastomose 20,8±1,3 min in der V-V-Gruppe daue...

Diskussion

Die Operationstechnik der heterotopen abdominalen Herztransplantation bei Mäusen ist sehr anspruchsvoll und impliziert eine Einschränkung der weit verbreiteten Verwendung dieses Modells.

Einer der Nachteile der herkömmlichen Technik ist die begrenzende Länge der Lungenarterie (PA) des Spenders. Es ist in der Regel etwa 2 mm lang, während die Länge des IIVC des spenderherzens, das in unserem Modell verwendet wird, im Allgemeinen etwa 1 cm beträgt (Abbildung 2

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
30G-needles	Braun	456300
acepromazine	CP Pharma	Tranquisol P
BALB/c AnNCrl mice	Charles River. Germany	no catalog number
Bepanthen eye ointment	Haus-Apotheke	PZN 01578675
Bonn Micro Forceps	FST	11083-07
Box for insulation and oxygen supply device	RUSKINN	INVIV
C57BL/6J  mice	Charles River. Germany	no catalog number
Carprofen	Zoetis	Rimadyl 50 mg/ml
CATHETER-FEP 26G	TERUMO	Surflo-W
Clip Applicator Forceps Style	FST	18057-14
Curved forceps	WPI	14114-G
custodiol/HTK	Dr. Franz Köhler Chemie	no catalog numer
Cutasept skin disinfection	VWR	BODL980365
electrosurgical pen	Bovie	CHANGE-A-TIP
gauze pads, cotton swabs	Lohmann-Rauscher	13353
Heating mat	THERMO MAT PRO 30W	HTP-30
Hemostatic sponge	CuraSpon	J1276A
heparine-solution	Haus-Apotheke	PZN 03029820
Ice box	PETZ	No Catalog Number available
Inhalation anesthesia device	GROPPLER	BKGM 0616
insulation and oxygen supply device	RUSKINN	INVIV
isoflurane	CP Pharma	Isofluran CP 1 ml/ml
ketamine	Zoetis	no catalog numer
metamizole	WDT	no catalog numer
Micro scissors	FST	15000-00,15000-10
Micro Serrefine ( Clamp ) Angled / 16 mm	FST	18055-06
Microscope	Leica	LEICAMZ6
Microscope light	SCHOTT	KL2500LED
Saline solution (NaCl 0.9%)	Haus-Apotheke	PZN 06178437
Scissors	Peha Instruments	991083/4
small Petri dish	Sarstedt	833900
Straight forceps	WPI	14113-G
surgical tape	BSN	4120
Suture Tying Forceps - 10 cm	FST	18025-10
Sutures(10-0)	Medtronic	N2540
Sutures(4-0)	ETHILON	V4940H
Sutures(7-0)	ETHILON	1647H
Syringe (0.3 mL)	BD	324826
Syringe (1 mL)	BD	320801
xylazine	Bayer	Rompun