Reconstrução do circuito sanguíneo em um modelo de transplante de coração de rato abdominal

Resumo

Uma nova técnica para reconstrução do circuito sanguíneo em um modelo de transplante de coração de camundongo heterotópico é demonstrada.

Resumo

A técnica cirúrgica de transplante de coração abdominal heterotópico em camundongos é um modelo padrão para pesquisa em imunologia de transplante. Aqui, é apresentada a técnica estabelecida para uma reconstrução modificada do circuito sanguíneo em um modelo de transplante de coração abdominal heterotópico. Este método utiliza a veia cava intratorácica inferior (IIVC) em vez da artéria pulmonar do coração doador para a anastomose para a cava vena inferior do receptor. Está facilitando e melhorando as taxas de sucesso para transplante de coração abdominal em camundongos.

Introdução

A técnica cirúrgica de transplante de coração abdominal heterotópico em camundongos representa um modelo padrão para pesquisa em imunologia de transplante^1,2,3. No entanto, é muito desafiador realizar e isso implica uma restrição ao uso generalizado deste modelo^4,5.

No transplante tradicional de coração de camundongo (THTx), a aorta doadora e a aorta abdominal receptora são anastomosas enquanto a artéria pulmonar é anastomosada para o receptor inferior vena cava^6,7,8.

Nesta técnica modificada de transplante de coração de camundongo, a aorta doadora é anastomosada ao receptor abdominal aorta e o doador IIVC é anastomosado ao receptor vena cava inferior^(3,4,6) ( Figura2 e Figura 3).

Protocolo

Todos os experimentos em animais foram realizados seguindo as diretrizes da diretiva 2010/63/UE do Parlamento Europeu sobre proteção de animais usados para fins científicos (Comitê de Ética aprovado, #G1071/09).

NOTA: O trabalho de preparação preliminar, anestesia, assistência pós-operatória e monitoramento são os mesmos realizados nos métodos cirúrgicos tradicionais^1,2,4. Os camundongos BALB/c serviram como doadores cardíacos e C57BL/6J como receptores de transplante. Os camundongos tinham idade entre 8 e 12 semanas, pesavam~30 g no transplante e estavam alojados em condições padrão.

1. Etapas preparatórias

1. Para anestesia, dê isoflurane inalador de camundongos (2%) até dormirem, seguidos de injeções intraperitoneais de cetamina (100 mg/kg) + xilazina (10 mg/kg) + acepromazina (2 mg/kg). Para analgesia pós-operatória, aplique Metamizol (200 mg/kg) p.o. e Carprofen (5 mg/kg) s.c..
   NOTA: A aplicação de antibióticos foi abstendo-se de propósito, pois essas substâncias podem influenciar as respostas imunológicas.
2. Para cirurgia, use um conjunto de instrumentos microscópicos, incluindo uma micro-tesoura, micro-fórceps, um suporte de agulha e grampos micro hemostáticos. Uma caneta eletrocirúrgica também é necessária. Realize suturas usando tipos de nylon 7/0er, 10/0er e 4/0er.
3. Coloque o mouse em uma caixa para inalação de isoflurane (2%) por 40-60 segundos. Determine a profundidade da anestesia apertando a pata com pinças. Se houver uma completa falta de resposta para este estímulo, vá para o próximo passo.
4. Uma vez que o rato tenha adormecido, pese o rato.
5. Aplique uma injeção intraperitoneal de cetamina (100 mg/kg) + xilazina (10 mg/kg) + acepromazina (2 mg/kg) no rato anestesiado.
6. Corte a pele abdominal e coloque o rato na mesa de operação. Realize a desinfecção usando iodeto povidone por 3 vezes, em seguida, drape adequadamente o rato usando uma toalha cirúrgica fenestrated.

2. Procedimento de operação do doador

1. Use uma tesoura para cortar a pele do pescoço até o abdômen inferior, e retire toda a camada da pele até a linha média de ambas as axilares.
2. Use uma tesoura para cortar os músculos da parede abdominal e mover suavemente as vísceras para a esquerda (da visão do operador). Enrole as vísceras com uma gaze salina imbibed para expor com segurança a cava vena inferior.
3. Use uma seringa de 1 mL para injetar 0,4 mL da solução de heparina (contém heparina U de 500 U) lentamente na cava vena inferior e espere 1 minuto antes de puxar a agulha.
4. Puxe a agulha e use uma micro-tesoura para cortar tanto a veia cava inferior quanto a aorta abdominal para acelerar a exsanguinação.
5. Use uma tesoura para abrir a cavidade torácica realizando um corte em forma de u; expor completamente o coração, pulmões e todos os vasos sanguíneos do tórax.
   1. Expor a aorta torácica, cortar 1/2 do lúmen e, em seguida, cortar a veia pulmonar para facilitar a irrigação e a drenagem.
   2. Insira um tubo de irrigação na abertura da aorta torácica, injete pelo menos 2 mL de 4 °C frio histidine-triptofano-cetoglutarate solução cardioplegia (solução HTK custodiol)⁹ até que o fluxo de veia pulmonar esteja completamente claro e o coração pare completamente de bater.
6. Retire o tubo de irrigação e desprende o esterno.
7. Use micro tesoura para remover o timo e para tirar ligeiramente a gordura ao redor do arco aórtico.
8. Use fórceps retos e curvas para expor e ligar o tronco da arteria pulmonalis (no lado direito do arco aórtico) com uma sutura 10/0.
9. Use micro fórceps para separar a gordura e o tecido conjuntivo ligado ao IIVC, expor e ligar a veia cava superior (no lado esquerdo do arco aórtico) com uma sutura 7/0 e usar micro tesouras para cortá-la atrás da ligadura.
10. Faça uma sutura 7/0 ao redor da base do coração sob o arco aórtico, o IIVC, e ambos os aurículos. Em seguida, liga os ramos da artéria pulmonar e vasos pulmonares venosos.
11. Use micro tesouras para transectar o arco aórtico o mais distal possível, os vasos pulmonares sob a ligadura e o IIVC perto do diafragma. Tire o coração do peito.
12. Coloque o coração do doador explantado em uma solução de cardioplegia HTK fria de 4 °C e preserve temporariamente.

3. Procedimento de operação do destinatário

NOTA: As etapas iniciais de operação são semelhantes às mostradas anteriormente para o rato doador, incluindo anestesia e desinfecção.

1. Realize o corte da pele abdominal de forma transversal, cubra os órgãos abdominais com uma gaze molhada usando solução salina.
2. Use micro fórceps para expor a veia cava inferior e a aorta abdominal e libertá-los do tecido adiposo circundante.
3. Use micro fórceps para ligadurar ou eletrocauterizar vasos laterais (laterais ou sob a veia/aorta) abaixo dos vasos renais.
4. Use fórceps aplicadores de clipe para posicionar dois grampos micro hemostáticos na parte abdominal da veia/aorta provenientes da direita deixando mais de 1 cm de distância para a aorta/veia para garantir espaço para a construção da anastomose entre eles.
5. Use micro tesoura para fazer uma incisão na aorta um pouco mais perto do grampo inferior do que do grampo superior. Alternativamente, use uma agulha de 30 G para fazer um pequeno furo e abra-a com micro tesoura.
6. Posicione o mouse receptor para que a aorta esteja voltada para o operador com a veia cava do outro lado. Em seguida, coloque o coração na cavidade abdominal e cubra-o com uma pequena almofada de gaze molhada.
7. Use uma sutura 10/0 para adaptar e costurar a aorta do doador na aorta receptora começando caudally, fazer um nó e proceder com uma sutura correndo até o topo da incisão (cerca de 4-5 pontos). Em seguida, vire o coração para a direita (do ponto de vista do sujeito), cubra-o novamente e continue a sutura no lado esquerdo até chegar ao final caudal e nó-lo.
8. Use um tubo de irrigação para injetar pelo menos 0,5 mL de solução de cardioplegia HTK de 4 °C para lavar o IIVC do doador.
9. Use micro-tesoura para cortar um orifício redondo na veia cava inferior abdominal do receptor, que deve ter o mesmo tamanho do lúmen IIVC dos doadores. A incisão deve estar localizada acima da abertura anastomótica aórtica. Faça a incisão da veia maior que a incisão aórtica.
10. Use uma sutura 10/0 para costurar o doador IIVC para o receptor vena cava começando caudally. Amarre um nó e realize uma sutura de corrida até que o topo da incisão seja atingido. Use cinco pontos e continue a sutura à esquerda. Por fim, amarre um nó no canto da cauda e aperte cuidadosamente (tenha cuidado para não puxar muito apertado).
11. Coloque as pequenas partes da esponja hemostática ao redor da veia e anastomoses aórticos.
12. Use fórceps aplicadores de clipe para remover primeiro os grampos micro-hemostáticos superiores e enxaguar a cavidade abdominal com 38,0°C temperado 0,9% cloreto de sódio.
13. Use micro fórceps para tirar a esponja hemostática.
14. Observe os batimentos cardíacos do coração transplantado.
15. Use fórceps para colocar os intestinos de volta na cavidade abdominal e suturas de duas camadas (músculos abdominais seguidos pela pele) para fechar a ferida abdominal com uma sutura 4/0.
16. Coloque os ratos em uma câmara de estação de trabalho de controle de oxigênio e temperatura (por exemplo, INVIVO2-400) para fornecer um ambiente quente e rico em oxigênio para os ratos transplantados se recuperarem, esperar que os ratos acordem.
17. Para analgesia pós-operatória, dê diretamente metamizol 200 mg/kg por sistema operacional após a operação. Quatro e 16 horas após a operação dão metamizol 200 mg/kg por os+ Carprofen (5mg/kg) s.c. No acompanhamento posterior, dê Carprofen (5 mg/kg) s.c aos camundongos transplantados a cada 24 horas por três dias consecutivos após a operação.

Resultados

Aqui, é apresentada uma técnica modificada de transplante de coração abdominal heterotópico em camundongos que já foi desenvolvido anteriormente em nosso laboratório e que se mostrou útil nos últimos 16 anos. Anteriormente, foi relatado que no total 40 casos de vena cava para veia cava (grupo V-V) em comparação com 40 casos da artéria pulmonar tradicional para vena cava (grupo P-V) procedimento de anastomose⁴ (Tabela 1) o vaso anastomose levou 20,8±1,3 min no grupo V-...

Discussão

A técnica cirúrgica do transplante de coração abdominal heterotópico em camundongos é muito desafiadora e isso implica uma restrição ao uso generalizado deste modelo.

Uma das desvantagens da técnica convencional é o comprimento limitante da artéria pulmonar do doador (PA). É geralmente de cerca de 2 mm de comprimento, enquanto o comprimento do IIVC do coração doador usado em nosso modelo é geralmente de cerca de 1 cm (Figura 2). Isso significa que, ...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
30G-needles	Braun	456300
acepromazine	CP Pharma	Tranquisol P
BALB/c AnNCrl mice	Charles River. Germany	no catalog number
Bepanthen eye ointment	Haus-Apotheke	PZN 01578675
Bonn Micro Forceps	FST	11083-07
Box for insulation and oxygen supply device	RUSKINN	INVIV
C57BL/6J  mice	Charles River. Germany	no catalog number
Carprofen	Zoetis	Rimadyl 50 mg/ml
CATHETER-FEP 26G	TERUMO	Surflo-W
Clip Applicator Forceps Style	FST	18057-14
Curved forceps	WPI	14114-G
custodiol/HTK	Dr. Franz Köhler Chemie	no catalog numer
Cutasept skin disinfection	VWR	BODL980365
electrosurgical pen	Bovie	CHANGE-A-TIP
gauze pads, cotton swabs	Lohmann-Rauscher	13353
Heating mat	THERMO MAT PRO 30W	HTP-30
Hemostatic sponge	CuraSpon	J1276A
heparine-solution	Haus-Apotheke	PZN 03029820
Ice box	PETZ	No Catalog Number available
Inhalation anesthesia device	GROPPLER	BKGM 0616
insulation and oxygen supply device	RUSKINN	INVIV
isoflurane	CP Pharma	Isofluran CP 1 ml/ml
ketamine	Zoetis	no catalog numer
metamizole	WDT	no catalog numer
Micro scissors	FST	15000-00,15000-10
Micro Serrefine ( Clamp ) Angled / 16 mm	FST	18055-06
Microscope	Leica	LEICAMZ6
Microscope light	SCHOTT	KL2500LED
Saline solution (NaCl 0.9%)	Haus-Apotheke	PZN 06178437
Scissors	Peha Instruments	991083/4
small Petri dish	Sarstedt	833900
Straight forceps	WPI	14113-G
surgical tape	BSN	4120
Suture Tying Forceps - 10 cm	FST	18025-10
Sutures(10-0)	Medtronic	N2540
Sutures(4-0)	ETHILON	V4940H
Sutures(7-0)	ETHILON	1647H
Syringe (0.3 mL)	BD	324826
Syringe (1 mL)	BD	320801
xylazine	Bayer	Rompun