JoVE Logo
Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • النتائج
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

يصف هذا البروتوكول تجميع وتشغيل جهاز acoustofluidic منخفض التكلفة للتسليم الجزيئي السريع للخلايا عن طريق سونوبوبينيد الناجم عن عوامل التباين بالموجات فوق الصوتية.

Abstract

مطلوب تسليم فعال داخل الخلايا من الجزيئات الحيوية لمجموعة واسعة من البحوث الطبية الحيوية والتطبيقات العلاجية القائمة على الخلايا. الموجات فوق الصوتية بوساطة سونوبوينج هو تقنية ناشئة للتسليم السريع داخل الخلايا من الجزيئات الحيوية. يحدث التجويف عندما يشكل تجويف الفقاعات الدقيقة المملوءة بالغاز مساما عابرة في أغشية الخلايا القريبة ، مما يتيح امتصاصا سريعا للجزيئات الحيوية من السائل المحيط. التقنيات الحالية ل سونوبوبينيشن في المختبر من الخلايا في تعليق محدودة من قبل الإنتاجية البطيئة، والتباين في ظروف التعرض بالموجات فوق الصوتية لكل خلية، وارتفاع التكلفة. لمعالجة هذه القيود، تم تطوير جهاز acoustofluidic منخفض التكلفة الذي يدمج محول الموجات فوق الصوتية في جهاز السائل القائم على PDMS للحث على سونوبوديشن متسقة من الخلايا لأنها تتدفق من خلال القنوات بالاشتراك مع وكلاء التباين بالموجات فوق الصوتية. يتم تصنيع الجهاز باستخدام تقنيات التصوير الضوئي القياسية لإنتاج رقاقة السائل المستندة إلى PDMS. يتم إرفاق محول قرص بيزو بالموجات فوق الصوتية بالجهاز ويقوده متحكم دقيق. يمكن دمج التجميع داخل علبة مطبوعة ثلاثية الأبعاد لمزيد من الحماية. يتم دفع الخلايا والفقاعات الدقيقة من خلال الجهاز باستخدام مضخة حقنة أو مضخة معجبة متصلة بأنابيب PVC. ويتجلى تعزيز تسليم الجزيئات الحيوية إلى الخلايا التائية البشرية وخلايا سرطان الرئة مع هذا النظام acoustofluidic. بالمقارنة مع نهج العلاج السائبة ، يزيد هذا النظام acoustofluidic الإنتاجية ويقلل من التباين ، مما يمكن أن يحسن طرق معالجة الخلايا لتطبيقات البحوث الطبية الحيوية وتصنيع العلاجات القائمة على الخلايا.

Introduction

وقد استخدمت منصات الفيروسية وغير الفيروسية لتعزيز التسليم الجزيئي للخلايا. التسليم الفيروسي (النقل) هو تقنية شائعة تستخدم في العلاجات القائمة على الخلايا التي تتطلب التعديل الجينومي. وتشمل القيود مع التسليم الفيروسية تولد الغرز المحتملة، والقدرة المعدلة وراثيا محدودة، وتعدد غير مرغوب فيه من العدوى1،2. لذلك ، يتم تطوير تقنيات التسليم الجزيئي غير الفيروسية لمجموعة واسعة من التطبيقات الطبية الحيوية والبحثية. وتشمل التقنيات الشائعة الميكانيكية والكهربائية والديناميكية المائية، أو استخدام الطاقة القائمة على الليزر لتعزيز امتصاص الجزيئات الحيوية في الخلايا 3. Electroporation هو منصة توصيل جزيئية غير فيروسية شائعة الاستخدام لديها القدرة على إحداث ثقب عابر في غشاء البلازما للتسليم داخل الخلايا للمركبات الجزيئية4و5و6و7و8و9. ومع ذلك ، فإن ثقب عابر لغشاء البلازما هو عملية عشوائية ويعتمد الامتصاص الجزيئي عبر الكهربوئس بشكل عام على الانتشار السلبي عبر مسام الغشاء العابر4و7و8.

وهناك طريقة بديلة هي استخدام الموجات فوق الصوتية لتعزيز التسليم الجزيئي داخل الخلايا عن طريق التجويف من وكلاء التباين بالموجات فوق الصوتية (أي الفقاعات الصغيرة المليئة بالغاز). التجويف Microbubble يحفز آثار microstreaming في وسائل الإعلام المحيطة بها والتي يمكن أن تسبب ثقب عابرة من أغشية البلازما القريبة ("سونوبوبينيشن") السماح امتصاص سريع داخل الخلايا من الجزيئات الحيوية عن طريق آليات النقل السلبي أو النشط10،11،12. Sonoporation هو تقنية فعالة للتسليم الجزيئي السريع للخلايا ، ولكن هذا النهج غالبا ما يتطلب معدات باهظة الثمن وطرق العلاج السائبة التي تحد منها انخفاض الإنتاجية وارتفاع التباين في ظروف التعرض بالموجات فوق الصوتية13. لمعالجة هذه القيود، يجري حاليا تطوير أجهزة acoustofluidic، التي تمكن من وجود سونوبوينيشن متسق للخلايا المعلقة.

Acoustofluidics هو مجال آخذ في التوسع يدمج تقنيات الموجات فوق الصوتية والموجات الدقيقة لمجموعة واسعة من التطبيقات. وقد سبق استخدام هذا النهج لفصل الجسيمات عن طريق تطبيق الطاقة المستمرة بالموجات فوق الصوتية للحث على الموجات الصوتية الدائمة داخل القنوات السائلة14،15،16،17. يتم فرز الجسيمات نحو أجزاء مختلفة من الجهاز استنادا إلى مجموعة متنوعة من الخصائص مثل حجم الجسيمات والكثافة والضغوط بالنسبة إلى المتوسط16. كما أن تقنيات Acoustofluidic قيد التطوير لتمكين التسليم الجزيئي السريع لمجموعة متنوعة من أنواع الخلايا لتطبيقات البحث وتصنيع علاجات الخلايا18. في الآونة الأخيرة، أظهرنا تعزيز التسليم الجزيئي لكريات الدم الحمراء باستخدام جهاز acoustofluidic المستندة إلى PDMS19. في منصة acoustofluidic ، يمكن التلاعب ديناميات الخلية والفقاعات الدقيقة للحث على التفاعلات المادية التي تمكن من تعزيز تسليم الجزيئات الحيوية. يمكن زيادة كفاءة واتساق التسليم الجزيئي داخل الخلايا من خلال تحسين المسافة بين الخلايا والفقاعات الدقيقة.

أحد التطبيقات الهامة ل aoustofluidic بوساطة سونوبوديشن ينطوي على نقل الجزيئات الحيوية إلى الخلايا التائية البشرية الأولية. العلاجات المناعية على أساس نقل الخلايا التائية بالتبني، مثل العلاج مستقبلات مستضد Chimeric T الخلية (CAR T)، تظهر بسرعة لعلاج مختلف الأمراض، بما في ذلك السرطان والفيروسات مثل فيروس نقص المناعة البشرية20. كان العلاج CAR T فعالا بشكل خاص في مرضى سرطان الدم الليمفاوي الحاد للأطفال (ALL) ، مع معدلات مغفرة كاملة من 70-90٪21. ومع ذلك، يعتمد تصنيع الخلايا التائية لهذه العلاجات بشكل عام على النقل الفيروسي الذي يحد منه تكوين الغرز المحتمل، وأوقات المعالجة الطويلة، والتحديات المتمثلة في تقديم الجزيئات الحيوية غير الوراثية مثل البروتينات أو الجزيئات الصغيرة1. يمكن لطرق التوصيل الجزيئي بوساطة Acoustofluidic التغلب على هذه القيود وتحسين تصنيع علاجات الخلايا التائية.

وثمة تطبيق هام آخر لمسألة السونوبونيد بوساطة ألوستوفلويديك ينطوي على تسليم المركبات الحافظة داخل الخلايا، مثل التريهالوز، التي تحمي الخلايا أثناء التجميد وإزالة الكبريت. يتم إنتاج تريهالوز من قبل بعض الكائنات الحية في الطبيعة ويساعدهم على تحمل التجميد و المجفف عن طريق حماية أغشيتهم الخلوية22،23. ومع ذلك ، لا تنتج التريهالوز من قبل خلايا الثدييات وغير منفذة لأغشية خلايا الثدييات. لذلك ، فإن تقنيات التسليم الجزيئي الفعالة ، مثل السونوبوديشن ، ضرورية من أجل تحقيق مستويات تريهالوز كافية داخل الخلايا المطلوبة لحماية الأغشية الخلوية الداخلية. ويجري حاليا تطوير هذا النهج من أجل الحفاظ الجاف على أنواع مختلفة من الخلايا.

يوفر هذا البروتوكول وصفا مفصلا لتجميع وتشغيل نظام acoustofluidic منخفض التكلفة نسبيا مدفوعا بتحكم دقيق. وتستخدم عوامل التباين بالموجات فوق الصوتية للحث على ال سونوبوليشن داخل القنوات السائلة وتمكين التسليم الجزيئي السريع لأنواع مختلفة من الخلايا، بما في ذلك الخلايا التائية والخلايا السرطانية. يمكن استخدام هذا النظام acoustofluidic لمجموعة متنوعة من التطبيقات البحثية، ويمكن أيضا أن تكون مفيدة كنظام نموذجي لتقييم أساليب سونوبوينج لتحسين عمليات تصنيع العلاج بالخلايا.

Protocol

تم جمع تبرعات الدم الكاملة من المتبرعين الأصحاء بعد البروتوكولات التي وافق عليها مجلس المراجعة المؤسسية في جامعة لويز.

1. تصنيع الجهاز acoustofluidic

  1. الحصول على قناع ضوئي مع تصميم حلزوني متحد المركز يحتوي على قنوات بقطر 500 ميكرومتر. يتم توفير ملف CAD في الملفات التكميلية كمثال. يمكن طلب قناع ضوئي مخصص من بائع تجاري أو نقشه باستخدام كاتب قناع.
  2. إعداد قالب من تصميم حلزوني متحد المركز على رقاقة السيليكون المغلفة بحامض ضوئي باستخدام تقنيات التصوير الضوئي القياسية.
    1. أضف ما يقرب من 2 ملعقة كبيرة (~ 30 مل) من SU-8 2100 إلى رقاقة سيليكون 100 مم.
    2. تدور معطف رقاقة على الدوار بسرعة 150 دورة في الدقيقة لمدة 30 ثانية لنشر الكواتر الضوئي، ثم زيادة السرعة إلى 1200 دورة في الدقيقة لمدة 60 ثانية لتسفر عن سمك 200 ميكرومتر.
    3. علاج رقاقة المغلفة بمرسي ضوئي في فرن فراغ polyimide مع منحدر 30 دقيقة و 30 دقيقة يسكن في 115 درجة مئوية، ثم منحدر لأسفل لمدة 30 دقيقة.
    4. يعرض رقاقة الكواتر الضوئي المغلفة لمدة 130 s باستخدام محاذاة قناع مع قناع ضوئي من الخطوة 1.1.
    5. خبز رقاقة بعد التعرض بعد نفس العملية الموصوفة في الخطوة 1.2.3.
    6. تطوير وازالة الصور في SU-8 حل المطور لمدة 8 دقائق تقريبا.
      تنبيه: استخدم فقط محلول المطور في غطاء الدخان الكيميائي جيد التهوية.
  3. Silanize القالب لجعل السطح أكثر الكارهة للماء. ضع رقاقة مغلفة بحامل الكزاز في مجفف وإضافة قطرة 20 ميكرولتر من الكلوروسيلين (C8H4Cl3F13Si). تطبيق فراغ على الغرفة لمدة 30 ق، ثم ختم الغرفة وترك بين عشية وضحاها.
    تنبيه: الكلوروسيلين خطير جدا و قابل للاشتعال. التعرض يسبب حروقا شديدة وتلف العين.
  4. الجمع بين 54 غرام من polydimethsiloxane (PDMS) قاعدة و 6 غرام من عامل علاج في كوب وتخلط بقوة ودقة مع ملعقة لمدة 1 دقيقة على الأقل.
  5. ضع الكوب الذي يحتوي على محلول PDMS في مجفف لمدة 30 دقيقة تقريبا أو حتى تتم إزالة بقايا فقاعات الهواء من المحلول.
  6. ضع رقاقة مغلفة بمرسي ضوئي مع الأنماط التي تواجه التصاعدي في طبق بيتري عيار 150 ملم.
  7. صب حل PDMS على القالب داخل طبق بيتري 150 ملم.
  8. إذا لزم الأمر، ضع طبق بيتري عيار 150 ملم داخل مجفف وطبق فراغ حتى تختفي فقاعات الهواء المتبقية.
  9. نقل طبق بيتري 150 ملم في فرن المختبر وخبز لمدة 2 ساعة في 60 درجة مئوية لعلاج PDMS.
  10. بعد المعالجة، قم بإزالة PDMS بعناية من طبق بيتري عن طريق القطع حول حواف الرقاقة باستخدام شفرة حلاقة.
  11. قطع كل جهاز على حدة باستخدام سكين أو شفرة حلاقة.
  12. ثقب ثقوب من خلال مدخل ومنفذ منافذ كل جهاز باستخدام لكمة خزعة 2.5 ملم.
  13. ضع كل جهاز PDMS في جهاز البلازما مع قنوات مكشوفة (تواجه إلى الأعلى). تطبيق العلاج بلازما الأكسجين (100 واط ل 45 ثانية، 500 mbar O2)ثم وضع فورا كل جهاز PDMS على شريحة المجهر زجاج الجير الصودا نظيفة (75 ملم × 25 ملم × 1 ملم) مع قنوات تواجه سطح الزجاج.
  14. دع الأجهزة ترتبط بين عشية وضحاها في درجة حرارة الغرفة.
  15. ضعي السيليكون برفق على سطح محول بيزو قطره 1 سم بسماكة ~1-2 مم، ثم قم بمحاذاة المحول بعناية مع دوامة متحدة المركز واضغط عليه برفق على الجزء السفلي من شريحة المجهر الزجاجي (الجانب الآخر من جهاز PDMS).

2. تجميع وتشغيل نظام acoustofluidic

  1. قم بتوصيل وحدة تحكم دقيقة بجهاز كمبيوتر باستخدام كبل USB A إلى B. يجب أن يضيء مؤشر LED للطاقة الخضراء (المسمى PWR).
  2. استخدم البرنامج المقترن على الكمبيوتر لتحميل برنامج يولد إشارة MHz 8. يتم توفير برنامج مثال فيiles F التكميلية . بعد تحميل البرنامج، سيتم تخزينه في ذاكرة المعالج الدقيق ولن يحتاج إلى تحميله مرة أخرى.
  3. لحام 1 "22G سلك إلى نهاية كل سلك على محول PZT.
  4. قم بتوصيل السلك الطرفي السالب (الأسود) لمحول PZT إلى دبوس GND عبر السلك اللحام.
  5. قم بتوصيل السلك الطرفي الإيجابي (الأحمر) ل PZT إلى دبوس الإخراج (#9 في برنامج المثال المقدم) عبر السلك اللحام.
  6. اختياريا، قم بتركيب الجهاز المتناوب والمتحكم الدقيق في علبة مطبوعة ثلاثية الأبعاد. يتم توفير CAD الملفات في Supplemental Files كأمثلة. يمكن توصيل أسلاك إضافية بدبابيس متحكمة أخرى للتحكم في مؤشر LED خارجي وزر الضغط على /إيقاف التشغيل إذا رغبت في ذلك.
  7. قطع 3-6 "أقسام من أنابيب البلاستيك الناعمة التيغون PVC (1/16" معرف، 1/8 "OD) ودفع الأنابيب في مدخل ومنافذ. قد يكون من الضروري تدوير الأنابيب مع ممارسة الضغط حتى تناسبها في الفتحة. اختياريا، بعد إدراج الأنابيب في كل منفذ، يمكن تطبيق الغراء عند تقاطع السندات PDMS والأنابيب معا.
  8. تجميع خزان microfluidic وفقا لتعليمات الشركة المصنعة.
  9. قطع قسم 3-6 "من أنابيب البلاستيك الناعمة التيجون PVC (1/16"معرف, 1/8"OD) ودفع الأنابيب على أنابيب معرف 1/32 "من أنابيب إخراج خزان microfluidic. اختياريا، التفاف تقاطع مع فيلم البارافين لمنع التسرب.
  10. املأ حقنة سعة 60 مل بالهواء المحيط (اختياريا، قم بتصفية الهواء بمرشح 0.2-μm) وربطه بأنابيب بولي كلوريد الفينيل التيغون (1/16 بوصة معرف، 1/8 بوصة OD) على جانب الخزان الدقيق.
  11. تعيين مضخة حقنة بمعدل 200 مل / ساعة لدفع حلول عامل تباين الخلية / الموجات فوق الصوتية من خلال الجهاز acoustofluidic بمعدل تدفق حجمي من 50 مل / ساعة وجمع العينات من إخراج الجهاز acoustofluidic في أنبوب الطرد المركزي 50mL. اختياريا، شطف القناة قبل العلاج acoustofluidic مع 15 مل من محلول الإيثانول 70٪ لزيادة عقم قنوات السوائل. بالإضافة إلى ذلك، يمكن شطف القنوات ب 15 مل من الماء المتأين لإزالة الإيثانول المتبقي في الجهاز قبل ضخ الخلايا من خلال النظام.

3. إعداد وكلاء التباين بالموجات فوق الصوتية

ملاحظة: عوامل التباين بالموجات فوق الصوتية تعزز بشكل كبير تسليم acoustofluidic من المركبات الجزيئية عن طريق زيادة عابرة permeabilization من الأغشية الخلوية القريبة19. التسليم الجزيئي محدود جدا دون عوامل التباين بالموجات فوق الصوتية في هذا النظام.

  1. إعداد محلول فوسفولبيد في قارورة التلألؤ 20 مل تحتوي على الخليط التالي:
    1. إضافة 25 ملغ من 1،2-distearoyl-sn-الجليسيرو-3-فوسفوتشولين (DSPC).
    2. إضافة 11.6 ملغ من 1,2-distearoyl-sn-الجليسيرو-3-الإيثيلفوسفوسفولين (DSEPC).
    3. إضافة 0.26 ملغ من 1,2-distearoyl-sn-غليسيرو-3-فوسفوغليسيرول (DSPG).
    4. إضافة 0.88 ملغ من البوليوكسي إيثيلين40 ستيرات.
  2. أضف الكلوروفورم حتى يتم إذابة جميع الفوسفوليبيدات (على سبيل المثال، 3 مل من الكلوروفورم).
  3. تبخر الكلوروفورم في مجفف لمدة 48 ساعة لتشكيل فيلم الدهون الجافة (يمكن استخدام التبخر تحت الأرجون أو مع المبخر الدوار لتسريع عملية التجفيف).
  4. إعادة ترطيب الفيلم الدهون مع 10 مل من المحلول الملحي المعقم الفوسفات العازلة (PBS).
  5. Sonicate حل الدهون لمدة 3 دقائق في 40٪ السعة لتشكيل حل micellar cationic.
  6. بعد تخزين سونيكيشن حل فوسفولبيد في 2-6 درجة مئوية لمدة تصل إلى 1 شهر.
  7. لإعداد عوامل التباين بالموجات فوق الصوتية، أضف 200 ميكرولتر من محلول micellar cationic و 600 ميكرولتر من برنامج تلفزيوني معقم إلى قارورة حاجز زجاجي سعة 2 مل.
  8. ختم القارورة عن طريق تجعيد الغطاء.
  9. استخدام إبرة 1.5 "20G لملء الفضاء رأس قارورة مع غاز ديكافلوروبوتان لمدة 30 s.
  10. دمج القارورة لمدة 45 s في 4,350 cpm لتشكيل عوامل التباين الموجات فوق الصوتية المليئة بالغاز perfluorobutane.
  11. إضافة 25 ميكرولتر من محلول عامل التباين بالموجات فوق الصوتية لكل 1 مل من محلول الخلية مباشرة قبل ضخ مزيج عامل التباين / الخلية المشتركة من خلال الجهاز acoustofluidic. يمكن تعديل محلول الخلية على النحو المطلوب من قبل المستخدم ، ولكن في دراساتنا تألف محلول الخلية من الخلايا التائية الأولية في الخطوة 4.21 ، وخلايا سرطان الرئة A549 في الخطوة 5.7 ، على التوالي.

4. إعداد الخلايا الأساسية

  1. عزل خلايا الدم المحيطية أحادية النوى (PBMCs) من حلول الدم الكامل وتخزينها عند -150 درجة مئوية. يستخدم فصل تدرج الكثافة الذي يحتوي على ركيزة بشكل شائع لفصل PBMCs عن الدم الكامل24و25و26.
  2. تذوب القارورة المجمدة في حمام مائي 37 درجة مئوية.
  3. تمييع PBMCs المذابة 1:10 مع برنامج تلفزيوني في أنبوب الطرد المركزي 15mL. تحتوي كل قارورة سعة 1 مل على ما يقرب من 10 ملايين PBMCs.
  4. أجهزة الطرد المركزي المخففة PBMCs في 580 × ز لمدة 11 دقيقة في 4 درجة مئوية.
  5. أسبيرات supernatant وإضافة 13 مل من MACs تشغيل المخزن المؤقت لإعادة إنفاق الخلايا.
  6. عد PBMCs مع عداد الخلية الآلي أو مقياس الدم.
  7. طرد مركزي PBMCs مرة أخرى في 580 × ز لمدة 11 دقيقة في 4 درجة مئوية ونسف supernatant.
  8. إضافة 40 ميكرولتر من المخزن المؤقت تشغيل المبردة لكل 10 مليون PBMCs.
  9. لعزل الخلايا التائية، أضف 10 ميكرولتر من كوكتيل الأجسام المضادة للبيوتين من Pan T-Cell لكل 10 ملايين PBMCs.
  10. يهيج بلطف PBMCs وتخزين الحل في 4 درجة مئوية لمدة 5 دقائق لكل 10 مليون خلية.
  11. إضافة 30 ميكرولتر من المخزن المؤقت قيد التشغيل و 20 ميكرولتر من كوكتيل Pan T-Cell MicroBead لكل 10 ملايين PBMCs.
  12. اخلط ال PBMCs والخرز جيدا واحتضن لمدة 15 دقيقة إضافية عند 4 درجات مئوية.
  13. إضافة المخزن المؤقت قيد التشغيل للوصول إلى إجمالي حجم 500 ميكرولتر.
  14. فصل الخلايا التائية الأساسية مع أداة الفرز المغناطيسي benchtop المتاحة تجاريا باستخدام إعداد "يستنفد الفصل" بعد بروتوكول الشركة المصنعة. وينبغي أن تسفر هذه الخطوة بين 5-10 مليون خلية تي بعد فرز الخلايا.
  15. عد الخلايا التائية باستخدام عداد الخلايا الآلي أو مقياس الدم.
  16. تمييع الخلايا التائية في 10 مل من برنامج تلفزيوني معقم وطارد مركزي في 580 × ز لمدة 10 دقائق في 4 درجة مئوية لبيليه الخلايا.
  17. يستنشق الخلايا التائية الفائقة وإعادة الإنفاق في 1 مل من برنامج تلفزيوني.
  18. عد الخلايا التائية باستخدام عداد الخلايا الآلي أو مقياس الدم وaliquot 1 مليون / مل للتجارب.
  19. إعداد محلول فلورسين 1 ملغم/مل في برنامج تلفزيوني.
  20. أضف 100 ميكرولتر من محلول فلوريسين 1 ملغم/مل لكل مل واحد من محلول الخلايا التائية (تركيز الفلوريسين النهائي = 100 ميكروغرام/مل) مباشرة قبل المعالجة.
  21. إضافة 25 ميكرولتر من حل عامل التباين بالموجات فوق الصوتية كما هو موضح سابقا في الخطوة 3.11.
  22. معالجة 1mL aliquots من الخلايا باستخدام نظام acoustofluidic (انظر الخطوات 2.10-2.11). هذه الخطوة يعزز تسليم الفلورسين في الخلايا التائية الأولية.
  23. بعد العلاج مباشرة، تغسل الخلايا ثلاث مرات عن طريق الطرد المركزي عند 580 × ز لمدة 10 دقائق مع 500 ميكرولتر من برنامج تلفزيوني لإزالة الفلورسين خارج الخلية. يجب غسل الخلايا في غضون 10 دقائق بعد إضافة محلول الفلورسين.
  24. بعد خطوة الغسيل النهائية، إعادة إنفاق الخلايا في 250 ميكرولتر من برنامج تلفزيوني وقياس الفلورسينس على مقياس التدفق الخلوي.

5. إعداد خلايا سرطان الرئة A549

  1. ثقافة A549 (adenocarcinomic الإنسان الظهارية القاعدية السنخية) الخلايا في وسائل الإعلام DMEM كاملة (10٪ مصل البقر الجنيني، 1٪ البنسلين / العقدية) في 37 درجة مئوية و 5٪ CO2 في قارورة زراعة الأنسجة مسطحة القاع.
  2. حصاد A549 الخلايا عندما تصل إلى التقاء 70-90٪. يستنشق وسائل الإعلام من القارورة وغسل الخلايا مرة واحدة مع برنامج تلفزيوني لإزالة بروتينات المصل.
  3. إضافة تريبسين (0.25٪) EDTA إلى قارورة واحتضان لمدة 5 دقائق في 37 درجة مئوية. التربسين هو إنزيم هضمي يتسبب في انفصال الخلايا عن السطح السفلي لقارورة زراعة الأنسجة.
  4. نقل حل التريبسين إلى أنبوب الطرد المركزي 15mL وتحييده عن طريق إضافة وسائط DMEM كاملة بنسبة 1:3.
  5. بيليه الخلايا عن طريق الطرد المركزي في 1500 × ز لمدة 5 دقائق في 4 درجة مئوية.
  6. اسبير الناطقة و resuspend بيليه بتركيز 100،000/mL في محلول PBS التي تحتوي على 200 mM تريهالوز في قارورة مخروطية 15 مل.
  7. إضافة 25 ميكرولتر من حل عامل التباين بالموجات فوق الصوتية كما هو موضح سابقا في الخطوة 3.11.
  8. معالجة 1mL aliquots من الخلايا باستخدام نظام acoustofluidic (انظر الخطوات 2.10-2.11). هذه الخطوة يعزز تسليم تريهالوز إلى خلايا سرطان الرئة A549.
  9. مباشرة بعد العلاج، وغسل الخلايا ثلاث مرات عن طريق الطرد المركزي مع 500 ميكرولتر من برنامج تلفزيوني لإزالة تريهالوز خارج الخلية. يجب غسل الخلايا في غضون 10 دقائق بعد إضافة محلول تريهالوز.
  10. بعد الخطوة النهائية غسل، إعادة إنفاق الخلايا في 100 ميكرولتر من برنامج تلفزيوني.
  11. إضافة 11 ميكرولتر من 1٪ تريتون X-100 حل للخلايا الليس والإفراج عن تريهالوز داخل الخلايا.
  12. دوامة لمدة 15 ق، ثم احتضان لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة.
  13. دوامة مرة أخرى لمدة 15 ثانية، ثم قياس تركيز تريهالوز باستخدام المقايسة trehalose المتاحة تجاريا بعد توصية الشركة المصنعة.

النتائج

تظهر صورة للنظام acoustofluidic المجمعة داخل حالة مطبوعة ثلاثية الأبعاد في الشكل 1. ينتج هذا البروتوكول نظام acoustofluidic التي يمكن استخدامها لتعزيز التسليم الجزيئي داخل الخلايا في خطوط الخلايا المتعددة باستخدام عوامل التباين بالموجات فوق الصوتية.

الشكل 2

Discussion

يصف هذا البروتوكول تجميع وتشغيل نظام acoustofluidic منخفض التكلفة الذي يعزز التسليم داخل الخلايا للجزيئات الحيوية لتطبيقات البحث. هناك العديد من العوامل الهامة التي يجب مراعاتها عند تجميع وتشغيل هذا النظام. الجهاز acoustofluidic هو ملفقة في PDMS، وهو مادة متوافقة بيولوجيا التي يمكن بسهولة مصبوب مع أبعا...

Disclosures

يمتلك المؤلفان المشاركان MAM و JAK ملكية في DesiCorp والتي قد تستفيد ماليا من المنتجات المتعلقة بهذا البحث.

Acknowledgements

وقد دعم هذا العمل جزئيا بتمويل من المؤسسة الوطنية للعلوم (#1827521 #1827521 #1450370) والمعاهد الوطنية للصحة (U01HL127518). تم توفير خدمات التصوير الضوئي من قبل جامعة لويز مايكرو / نانو مركز التكنولوجيا.

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
Fabrication of Acoustofluidic Device
DOW SYLGARD 184 SILICONE ENCAPSULANT CLEAR 0.5 KG KITEllsworth Adhesives4019862 (SKU)https://www.ellsworth.com/products/by-market/consumer-products/encapsulants/silicone/dow-sylgard-184-silicone-encapsulant-clear-0.5-kg-kit/
Harris Uni-Core (2.5 mm)Electron Microscopy Sciences69039-25
Microfluidic Reservoir for 15 mL Falcon Tube - S (2/4 port)Darwin MicrofluidicsLVF-KPT-S-2 (SKU)https://darwin-microfluidics.com/products/15-ml-falcon-tube-microfluidic-reservoir-s-2-4-port
Microscope SlideVWR16004-430https://us.vwr.com/store/product/4646174/vwr-vistavisiontm-microscope-slides-plain-and-frosted-premium
trichlorosilaneGelest105732-02-3 (Cas. No.)Chlorosilane is very hazaradous and flammable. Exposure causes severe burns and eye damage. 
Tygon PVC soft plastic tubing (1/16" ID, 1/8" OD)McMaster-Carr5233K51 (Part #)https://www.mcmaster.com/pvc-tubing/soft-tubing-for-air-and-water/
Assembly of Acoustofluidic System
Arduino UnoArduino7630049200050 (Barcode)https://store.arduino.cc/usa/arduino-uno-rev3
Preparation of Ultrasound Contrast Agents
1,2-distearoyl-sn-glycero-3-ethylphosphocholine (DSEPC)Avanti Lipids890703P-25mg (SKU)https://avantilipids.com/product/890703
1,2-distearoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (DSPC)Avanti Lipids850365P-25mg (SKU)https://avantilipids.com/product/850365
1,2-distearoyl-sn-glycero-3-phosphoglycerol (DSPG)Avanti Lipids840465P-25mg (SKU)https://avantilipids.com/product/840465
APF-140HP (decafluorobutate gas)FlouroMed355-25-9 (Cas No.)http://www.fluoromed.com/products/perfluorodecalin/
DB-338 Amalgamators COXOhttps://www.coxotec.com/coxo/db-338-amalgamators/
polyoxyethylene 40 stearate Sigma-AldrichP3440-250G (SKU)https://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/p3440?lang=en&region=US&gclid=
Cj0KCQjwy8f6BRC7ARIsAPIXOjjj
Jh_151mYVEUyLZRavt4re9YQMLS
vID64X-1KbO3LUKGjVUwb
PDAaAqvOEALw_wcB
Q125 SonicatorQsonicaQ125-110 (Ref.)https://www.sonicator.com/products/q125-sonicator?_pos=1&_sid=406df3776&_ss=r
Preparation of Primarty T Cells
autoMACs running bufferMiltenyi Biotec130-091-221 (Order No.)https://www.miltenyibiotec.com/US-en/products/automacs-running-buffer-macs-separation-buffer.html#gref
Pan T Cell Isolation Kit, human (Pan T-Cell Biotin Antibody Cocktail & Pan T-Cell MicroBead Cocktail) Miltenyi Biotec130-096-535 (Order No.)https://www.miltenyibiotec.com/US-en/products/pan-t-cell-isolation-kit-human.html#130-096-535
magnetic cell sorter (autoMACS Pro Separator)Miltenyi Biotec130-092-545 (Order No.)https://www.miltenyibiotec.com/US-en/products/automacs-pro-separator-starter-kit.html#130-092-545
Preparation of A549 Lung Cancer Cells
Trehalose Assay Kit MegazymeK-TREH (Cat. No.)https://www.megazyme.com/trehalose-assay-kit
Trypan blue (0.4% in aqueous solution Ready-to-Use, sterile)VWR97063-702 (Cat. No.)https://us.vwr.com/store/product/7437427/trypan-blue-0-4-in-aqueous-solution-ready-to-use-sterile

References

  1. Gardlik, R., et al. Vectors and delivery systems in gene therapy. Medical Science Monitor. 11 (4), 110-121 (2005).
  2. Wahlers, A., et al. Influence of multiplicity of infection and protein stability on retroviral vector-mediated gene expression in hematopoietic cells. Gene Therapy. 8 (6), 477-486 (2001).
  3. Nayerossadat, N., Maedeh, T., Ali, P. A. Viral and nonviral delivery systems for gene delivery. Advanced Biomedical Research. 1, 27 (2012).
  4. Chen, C., Smye, S. W., Robinson, M. P., Evans, J. A. Membrane electroporation theories: a review. Medical & Biological Engineering & Computing. 44 (1-2), 5-14 (2006).
  5. Gehl, J. Electroporation: theory and methods, perspectives for drug delivery, gene therapy and research. Acta Physiologica Scandinavica. 177 (4), 437-447 (2003).
  6. Lin, Y. C., Li, M., Wu, C. C. Simulation and experimental demonstration of the electric field assisted electroporation microchip for in vitro gene delivery enhancement. Lab on a Chip. 4 (2), 104-108 (2004).
  7. Sugar, I. P., Neumann, E. Stochastic model for electric field-induced membrane pores. Electroporation. Biophysical Chemistry. 19 (3), 211-225 (1984).
  8. Weaver, J. C. Electroporation: a general phenomenon for manipulating cells and tissues. Journal of Cellular Biochemistry. 51 (4), 426-435 (1993).
  9. Hashimoto, M., Takemoto, T. Electroporation enables the efficient mRNA delivery into the mouse zygotes and facilitates CRISPR/Cas9-based genome editing. Scientific Reports. 5, 11315 (2015).
  10. Klibanov, A. L. Microbubble contrast agents: targeted ultrasound imaging and ultrasound-assisted drug-delivery applications. Investigative Radiology. 41 (3), 354-362 (2006).
  11. Klibanov, A. L., Shevchenko, T. I., Raju, B. I., Seip, R., Chin, C. T. Ultrasound-triggered release of materials entrapped in microbubble-liposome constructs: a tool for targeted drug delivery. Journal of Controlled Release. 148 (1), 13-17 (2010).
  12. Fan, Z., Kumon, R. E., Deng, C. X. Mechanisms of microbubble-facilitated sonoporation for drug and gene delivery. Therapeutic Delivery. 5 (4), 467-486 (2014).
  13. Secomski, W., et al. In vitro ultrasound experiments: Standing wave and multiple reflections influence on the outcome. Ultrasonics. 77, 203-213 (2017).
  14. Gedge, M., Hill, M. Acoustofluidics 17: theory and applications of surface acoustic wave devices for particle manipulation. Lab on a Chip. 12 (17), 2998-3007 (2012).
  15. Shi, J., et al. Acoustic tweezers: patterning cells and microparticles using standing surface acoustic waves (SSAW). Lab on a Chip. 9 (20), 2890-2895 (2009).
  16. Shi, J., Huang, H., Stratton, Z., Huang, Y., Huang, T. J. Continuous particle separation in a microfluidic channel via standing surface acoustic waves (SSAW). Lab on a Chip. 9 (23), 3354-3359 (2009).
  17. Shields, C. W. t., Cruz, D. F., Ohiri, K. A., Yellen, B. B., Lopez, G. P. Fabrication and operation of acoustofluidic devices supporting bulk acoustic standing waves for sheathless focusing of particles. Journal of Visualized Experiments. (109), e53861 (2016).
  18. Belling, J. N., et al. Acoustofluidic sonoporation for gene delivery to human hematopoietic stem and progenitor cells. Proceedings of the National Academy of Sciences. 117 (20), 10976-10982 (2020).
  19. Centner, C. S., et al. Ultrasound-induced molecular delivery to erythrocytes using a microfluidic system. Biomicrofluidics. 14 (2), 024114 (2020).
  20. Qi, J., Ding, C., Jiang, X., Gao, Y. Advances in developing CAR T-cell therapy for HIV cure. Frontiers in Immunology. 11, 361 (2020).
  21. Annesley, C. E., Summers, C., Ceppi, F., Gardner, R. A. The evolution and future of CAR T cells for B-Cell Acute lymphoblastic leukemia. Clinical Pharmacology & Therapeutics. 103 (4), 591-598 (2018).
  22. Hand, S. C., Menze, M. A. Molecular approaches for improving desiccation tolerance: insights from the brine shrimp Artemia franciscana. Planta. 242 (2), 379-388 (2015).
  23. Zhang, M., et al. Freeze-drying of mammalian cells using trehalose: preservation of DNA integrity. Scientific Reports. 7 (1), 6198 (2017).
  24. Grievink, H. W., Luisman, T., Kluft, C., Moerland, M., Malone, K. E. Comparison of three isolation techniques for human peripheral blood mononuclear cells: Cell recovery and viability, population composition, and cell functionality. Biopreserv Biobank. 14 (5), 410-415 (2016).
  25. Jaatinen, T., Laine, J. Isolation of mononuclear cells from human cord blood by Ficoll-Paque density gradient. Current Protocol in Stem Cell Biology. , (2007).
  26. Ulmer, A. J., Scholz, W., Ernst, M., Brandt, E., Flad, H. D. Isolation and subfractionation of human peripheral blood mononuclear cells (PBMC) by density gradient centrifugation on Percoll. Immunobiology. 166 (3), 238-250 (1984).
  27. Halldorsson, S., Lucumi, E., Gomez-Sjoberg, R., Fleming, R. M. T. Advantages and challenges of microfluidic cell culture in polydimethylsiloxane devices. Biosensors and Bioelectronics. 63, 218-231 (2015).
  28. Helfield, B., Chen, X., Watkins, S. C., Villanueva, F. S. Biophysical insight into mechanisms of sonoporation. Proceedings of the National Academy of Sciences. 113 (36), 9983-9988 (2016).
  29. Hu, Y., Wan, J. M., Yu, A. C. Membrane perforation and recovery dynamics in microbubble-mediated sonoporation. Ultrasound in Medicine and Biology. 39 (12), 2393-2405 (2013).
  30. Kopechek, J. A., et al. Ultrasound targeted microbubble destruction-mediated delivery of a transcription factor decoy inhibits STAT3 signaling and tumor growth. Theranostics. 5 (12), 1378-1387 (2015).
  31. Bhutto, D. F., et al. Effect of molecular weight on sonoporation-mediated uptake in human cells. Ultrasound in Medical Biology. 44 (12), 2662-2672 (2018).
  32. Forbes, M. M., Steinberg, R. L., O'Brien, W. D. Frequency-dependent evaluation of the role of definity in producing sonoporation of Chinese hamster ovary cells. Journal of Ultrasound in Medicine. 30 (1), 61-69 (2011).
  33. Helfield, B., Chen, X., Watkins, S. C., Villanueva, F. S. Biophysical insight into mechanisms of sonoporation. Proceedings of National Academy of Science U. S. A. 113 (36), 9983-9988 (2016).
  34. Miller, D. L., Bao, S., Morris, J. E. Sonoporation of cultured cells in the rotating tube exposure system. Ultrasound in Medical Biology. 25 (1), 143-149 (1999).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

167 acoustofluidics

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved