增强分子化合物输送到细胞的声透流体装置的组装和操作

摘要

该协议描述了低成本声学流体装置的组装和运行，该装置通过超声波对比剂诱导的声波快速分子输送到细胞。

摘要

广泛的生物医学研究和基于细胞的治疗应用需要高效的细胞内生物分子输送。超声波介质是一种新兴的生物分子细胞内快速输送技术。当充满气体的微气泡在附近的细胞膜中形成瞬态孔隙时，就会发生声扑，从而能够从周围液体中快速吸收生物分子。目前悬浮中细胞的体外声波成像技术受到吞吐量缓慢、每个细胞超声波暴露条件下的变异性和高成本的限制。为了解决这些限制，开发出一种低成本的声学流体装置，它结合了基于PDMS的流体装置中的超声波传感器，在与超声波对比剂结合通过通道时诱导细胞的一致声波。该设备是使用标准光刻技术制造的，以生产基于PDMS的流体芯片。超声波皮佐盘传感器连接到设备上，由微控制器驱动。该组件可以集成在 3D 打印的箱子中以获得额外的保护。细胞和微泡使用注射器泵或连接到 PVC 管的渗透泵通过设备。通过这种声毒流体系统，可以证明生物分子能够增强地将生物分子输送到人类T细胞和肺癌细胞。与批量治疗方法相比，这种声毒流体系统可增加产量，降低变异性，从而改进生物医学研究应用和细胞治疗的制造细胞处理方法。

引言

病毒和非病毒平台已被利用，以提高分子输送到细胞。病毒传递（转导）是一种常见的技术，用于细胞为基础的治疗，需要基因组修饰。病毒传播的限制包括潜在的插入性突变，有限的转基因能力，和不^{受欢迎的感染1，2}的多重性。因此，非病毒分子传递技术正在开发广泛的生物医学和研究应用。常见的技术包括机械、电气、流体动力学，或利用激光能量来增强生物分子进入细胞^3。电聚变是一种常用的非病毒分子传递平台，能够诱导等离子体膜中瞬态穿孔，用于分子化合物^{4、5、6、7、8、9}的细胞内输送。然而，等离子体膜的瞬态穿孔是一个随机的过程，通过电聚变的分子吸收通常依赖于在瞬态膜孔隙^4、7、8的被动扩散。

另一种方法是利用超声波通过超声波对比剂（即充满气体的微泡）的空腔增强细胞内分子传递。微泡空腔在周围介质中诱导微流效应，可导致附近等离子体膜（"声像"）的瞬时穿孔，从而通过被动或主动传输机制^10、11、12快速吸收生物分子。声波是快速分子输送到细胞的有效技术，但这种方法往往需要昂贵的设备和批量处理方法，这些方法受到超声波^{暴露条件下产量}较低和变异性较高的限制。为了解决这些限制，声透流体装置目前正在开发中，这种装置能够对悬浮细胞进行一致的声扑。

气流是一个扩展的领域，集成超声波和微流体技术，用于各种应用。这种方法以前曾用于粒子分离，通过应用连续超声波能量诱导流体通道内的站立声波14、15、16、17。粒子根据粒子大小、密度和相对于中^等16的可压缩性等多种特性对设备的不同部分进行排序。声透流技术也在开发中，使各种细胞类型能够快速分子传递，用于研究应用和制造细胞疗法^18。最近，我们使用基于PDMS的声学流体装置¹⁹演示了增强分子传递到红细胞。在声学平台中，可以操纵细胞和微泡动力学来诱导物理相互作用，增强生物分子的传递能力。通过优化细胞和微泡之间的距离，可以潜在地提高细胞内分子传递的效率和一致性。

声毒介质声扑的一个重要应用是将生物分子输送到原发性人类T细胞中。基于收养T细胞转移的免疫疗法，如奇美利安抗原受体T细胞（CAR T）疗法，正在迅速出现，用于治疗各种疾病，包括癌症和艾滋病毒²⁰等病毒。CAR T疗法在小儿急性淋巴细胞白血病（ALL）患者中效果特别显著，完全缓解率为70-90%21。然而，这些疗法的T细胞制造通常取决于病毒转导，这是受潜在的插入突变，漫长的加工时间，以及提供非遗传生物分子的挑战，如蛋白质或小分子¹的限制。以气管为媒介的分子输送方法有可能克服这些限制，改善T细胞疗法的制造。

声毒介质声质的另一个重要应用涉及防腐剂化合物的细胞内输送，如三卤素，在冷冻和干燥期间保护细胞。三卤素是由一些生物在自然界中产生的，通过保护它们的细胞膜^22，23，帮助他们耐受冷冻和干燥。然而，三卤素不是由哺乳动物细胞产生的，并且对哺乳动物细胞膜不透水。因此，为了达到保护内部细胞膜所需的足够细胞内三卤素水平，有必要采用有效的分子传递技术，如声波。目前正在开发这种方法，用于各种细胞类型的干保存。

本协议详细描述了由微控制器驱动的相对低成本的声学流体系统的组装和运行情况。超声对比剂用于在流体通道内诱导声波，并使各种细胞类型（包括T细胞和癌细胞）能够快速分子传递。这种声毒流体系统可用于各种研究应用，也可作为原型系统来评估声扑方法，以改进细胞治疗制造工艺。

研究方案

根据路易斯维尔大学机构审查委员会批准的协议，从健康献血者那里收集了全部献血。

1. 制造声毒流体装置

1. 获得带有同心螺旋设计的光面，包含直径为 500 μm 的通道。以补充文件为例，提供 CAD 文件。定制光标可以从商业供应商订购或使用掩码编写器进行图案。
2. 使用标准光刻技术，在光耐药涂层硅晶片上准备同心螺旋设计的模具。
   1. 在 100 mm 硅晶片中加入约 2 Tbsp（+30 mL）SU-8 2100。
   2. 以 150 rpm 的速度在微调器上旋转晶圆，以 30s 将光分辨率分散，然后将速度提高到 1，200 rpm，60s 的轴线产生 200 μm 的厚度。
   3. 在聚酰胺真空烤箱中处理光复膜涂层晶圆，在 115 °C 下增加 30 分钟，然后向下处理 30 分钟。
   4. 使用与第 1.1 步的光遮光罩对齐器将光复印涂层晶圆暴露在 130s 上。
   5. 按照第 1.2.3 步中描述的相同过程在曝光后烘烤晶圆。
   6. 在 SU-8 开发人员解决方案中开发光刻斯特约 8 分钟。
      警告:仅在通风良好的化学烟气罩中使用开发人员解决方案。
3. 使模具西拉尼化，使表面更疏水。将光耐火涂层晶圆放入干燥器中，加入 20 μL 滴氯硅烷（C₈H₄Cl₃F₁₃Si）。将真空吸尘器涂抹到腔室 30s 上，然后密封腔室并过夜。
   警告:氯西兰是非常危险和易燃的。暴露会导致严重烧伤和眼睛损伤。
4. 将 54 克聚二甲基氧烷 （PDMS） 基和 6 克固化剂混合在杯子中，并大力彻底地与铲子混合至少 1 分钟。
5. 将装有PDMS溶液的杯子放入干燥器中约 30 分钟，或直到从溶液中去除残余气泡。
6. 将光分辨率涂层晶圆与图案朝上放在一个150毫米的培养皿中。
7. 将 PDMS 溶液倒在 150 mm 培养皿内的模具上。
8. 如果需要，将 150 mm Petri 盘放入干燥器中，并使用真空，直到残余气泡消失。
9. 将 150 毫米的 Petri 菜转移到实验室烤箱中，在 60 °C 下烘烤 2 小时，以治愈 PDMS。
10. 固化后，使用剃须刀刀片切开晶圆边缘，小心地从培养皿中取出PDMS。
11. 使用刀或剃刀刀片切割每个设备。
12. 使用 2.5 mm 活检冲孔穿过每个设备的入口和出口端口。
13. 将每个 PDMS 设备放在等离子体中，通道暴露（朝上）。应用氧血浆处理（100 W 45 s， 500 mbar O_2），然后立即将每个 PDMS 设备放在一个干净的苏打石灰玻璃显微镜滑梯 （75 毫米 x 25 毫米 x 1 毫米） 与通道面对玻璃表面.
14. 让设备在室温下隔夜粘合。
15. 轻轻地将硅胶涂抹在厚度为 +1-2mm 的 1 厘米直径的 Piezo 传感器表面，然后小心地将传感器与同心螺旋对齐，并轻轻按压到玻璃显微镜滑动器的底部（PDMS 设备的对面）。

2. 声流体系统的组装和运行

1. 使用 USB A 到 B 电缆将微控制器连接到计算机。绿色电源 LED 指示灯（标有 PWR）应亮起。
2. 使用计算机上的相关程序上传生成 8 MHz 信号的程序。补充Files中提供了一个示例程序。上传程序后，它将存储到微处理器内存中，无需再次上传。
3. 在 PZT 传感器上将一根 1" 22G 电线焊接到每根电线的末端。
4. 通过焊接线将 PZT 传感器的负（黑色）终端导线连接到 GND 销。
5. 通过焊接线将 PZT 传感器的正（红色）终端导线连接到输出销（#9在提供示例程序中）。
6. 可选地将声透流体设备和微控制器安装在 3D 打印的外壳中。CAD 文件以S增强 Files为例提供。其他电线可以连接到其他微控制器销，以控制外部 LED 指示器，如果需要，可以打开/关闭按钮。
7. 切割 3-6" 段 Tygon PVC 软塑料管（1/16" ID，1/8" OD），并将管子推入进气口和出口端口。可能需要在施加压力时旋转管子，直到它适合打开。可选，在将管子插入每个端口后，可以在交汇处涂上胶水，将 PDMS 和管子粘合在一起。
8. 根据制造商的说明组装微流体储层。
9. 切开 3-6" 段 Tygon PVC 软塑料管（1/16" ID，1/8" OD），将管子从微流体储层输出管中推过 1/32" ID 管。可选用石蜡薄膜包裹路口，以防止泄漏。
10. 将 60 mL 注射器填充环境空气（可选，用 0.2μm 滤清器过滤空气），并将其连接到微流体储层侧面的 Tygon PVC 管（1/16" ID，1/8" OD）。
11. 将注射器泵设置为 200 mL/h，以 50 mL/h 的体积流量流速将细胞/超声对比剂解决方案通过声透流器件，并将声透流器设备输出的样品收集到 50mL 离心机管中。可选，在声毒流体治疗前用 15 mL 的 70% 乙醇溶液冲洗通道，以增加流体通道的不育性。此外，通道可以用 15 mL 的去离子水冲洗，以便在通过系统泵送细胞之前去除设备中的残留乙醇。

3. 准备超声波对比剂

注:超声对比剂通过暂时增加附近细胞膜^的渗透性，显著增强分子化合物的声学运载。在这个系统中，没有超声波对比剂，分子传递是非常有限的。

1. 在包含以下混合物的 20mL 闪烁瓶中准备磷脂溶液:
   1. 加入25毫克1，2-脱脂-sn-甘油-3-磷胆碱（DSPC）。
   2. 加入11.6毫克1，2-乙酰-sn-甘油-3-乙基磷酸（DSEPC）。
   3. 加入 0.26 毫克 1，2- 二乙酰 - sn - 甘油 - 3 - 磷甘油 （DSPG） 。
   4. 加入0.88毫克聚氧乙烯40固醇。
2. 加入氯仿，直到溶解所有磷脂（例如，3兆瓦的氯仿）。
3. 蒸发氯仿在干燥器中48小时，形成干脂膜（蒸发下砷或旋转蒸发器可用于加速干燥过程）。
4. 用 10 mL 无菌磷酸盐缓冲盐水 （PBS） 补充脂质薄膜。
5. 将脂质溶液以 40% 的振幅对脂质溶液进行 3 分钟的声波化，形成酸性鼠片溶液。
6. 声波后，磷脂溶液在 2-6 °C 下存储长达 1 个月。
7. 要准备超声波对比剂，在 2 mL 玻璃隔膜小瓶中加入 200 μL 的青紫小鼠溶液和 600 μL 的无菌 PBS。
8. 通过压接盖住小瓶来密封小瓶。
9. 使用 1.5" 20G 针头填充小瓶头空间，使用 30s 的二氟丁烷气体。
10. 在 4，350 cpm 处将小瓶粘合 45 秒，形成全氟丁烷气体填充超声对比剂。
11. 在通过声透流体设备泵送组合对比剂/细胞混合物之前，立即每 1 ML 的细胞溶液添加 25 μL 的超声波对比剂溶液。细胞溶液可以根据用户需要进行修改，但在我们的研究中，细胞溶液分别由第 4.21 步中的原发 T 细胞和步骤 5.7 中的 A549 肺癌细胞组成。

4. 初级细胞的准备

1. 将周围血单核细胞 （PBMCs） 与整个血液溶液分离，储存在 -150 °C 下。 含有基材的密度梯度分离通常用于将全血全息电脑与全血^分离24、25、26。
2. 在 37 °C 水浴中解冻冷冻小瓶。
3. 在 15mL 离心机管中用 PBS 稀释解冻的 PBMC 1:10。每个 1mL 小瓶包含大约 1000 万台 PBMC。
4. 离心机稀释 PBMC 在 580 x g 11 分钟在 4 °C.
5. 吸气超高分子，并添加13兆L的MAC运行缓冲，以重新悬浮细胞。
6. 使用自动电池计数器或血细胞计计算 PBMC。
7. 在 4 °C 下以 580 x g再次离心 11 分钟，并吸气超高。
8. 每 1000 万台 PBMC 添加 40 μL 的冷藏运行缓冲。
9. 要分离T细胞，每1000万台PC中加入10微升的泛T细胞生物素抗体鸡尾酒。
10. 轻轻搅拌 PBMC，将溶液存储在 4 °C 下，每 1000 万个细胞 5 分钟。
11. 每 1000 万台 PBMC 添加 30 μL 的运行缓冲器和 20 μL 的 Pan T 细胞微珠鸡尾酒。
12. 彻底混合 PBMC 和珠子，在 4 °C 下再孵育 15 分钟。
13. 添加运行缓冲，总容量达到 500 μL。
14. 使用制造商协议下的"耗尽分离"设置，将主 T 单元与市售的台式磁性分拣仪器分离。此步骤在细胞分拣后应产生 500-1000 万 T 细胞。
15. 使用自动细胞计数器或血细胞计计算 T 细胞。
16. 将 T 细胞稀释在 10 mL 的无菌 PBS 中，以 580 x g 的离心机在 4 °C 下稀释 10 分钟，以颗粒细胞。
17. 在 1 mL 的 PBS 中吸气超高分子并重新悬浮 T 细胞。
18. 使用自动细胞计数器或血细胞计计算T细胞，并计算100万/mL用于实验。
19. 在 PBS 中准备 1 毫克/mL 荧光素溶液。
20. 在加工前立即每 1 mL T 细胞溶液（最终氟辛浓度 = 100 μg/mL）添加 100 μL 1 毫克/毫升荧光素溶液。
21. 添加 25 μL 超声波对比剂解决方案，如前一步 3.11 中所述。
22. 使用声毒流体系统处理细胞的 1mL 异位素（参见步骤 2.10-2.11）。这一步骤增强了荧光素进入原发T细胞的输送。
23. 治疗后，立即通过离心以 580 x g清洗细胞三次，10 分钟使用 500 μL 的 PBS 去除细胞外荧光素。加入荧光素溶液后，应在10分钟内清洗细胞。
24. 经过最后的清洗步骤后，在 250 μL 的 PBS 中重新悬浮细胞，并测量流细胞计的荧光。

5. A549肺癌细胞的制备

1. 培养A549（腺癌人类骨质疏松基底上皮）细胞在完整的DMEM介质（10%胎儿牛血清，1%青霉素/链霉素）在37°C和5%CO₂在平底组织培养瓶。
2. 当A549细胞达到70-90%的汇流时，收获它们。从烧瓶中吸气介质，用PBS清洗细胞一次，去除血清蛋白。
3. 将试丁鱼（0.25%）EDTA添加到烧瓶中，在37°C下孵育5分钟。 Trypsin 是一种消化酶，它使细胞从组织培养瓶的底部表面分离。
4. 将 trypsin 溶液转移到 15mL 离心机管中，并以 1:3 的比例添加完整的 DMEM 介质来中和它。
5. 在 4 °C 下，通过离心在 1，500 x g下将细胞颗粒 5 分钟。
6. 在 PBS 溶液中，以 100，000/mL 的浓度将超高分子吸气并重新吸管颗粒，其中含有 15 mL 圆锥形小瓶中的 200 m trehalose。
7. 添加 25 μL 超声波对比剂解决方案，如前一步 3.11 中所述。
8. 使用声毒流体系统处理细胞的 1mL 异位素（参见步骤 2.10-2.11）。这一步骤增强了将三卤素输送到A549肺癌细胞中。
9. 治疗后，立即通过离心用500微升的PBS清洗细胞三次，以去除细胞外三卤素。添加三卤素溶液后，应在 10 分钟内清洗细胞。
10. 经过最后的清洗步骤后，在 100 μL 的 PBS 中重新悬回细胞。
11. 加入 11 μL 的 1% Triton X-100 溶液，以解酶细胞并释放细胞内三卤素。
12. 漩涡为15秒，然后在室温下孵育30分钟。
13. Vortex 再次为 15 秒， 然后根据制造商的建议使用市售的三卤糖检测测量三卤素浓度。

结果

图1显示在3D打印外壳内组装的声透流体系统图像。此协议产生声透流体系统，可用于使用超声波对比剂在多个细胞系中增强细胞内分子传递。

图2  与未经治疗的对照组（p<0.05，n=3/组）相比，通过声毒素治疗，将荧光化合物荧光素增强到原发性人类T细胞的细胞内传递。T细胞在PBS中浓度为100万微米/mL，具有100微?...

讨论

本协议描述了低成本声学流体系统的组装和运行，该系统可增强用于研究应用的生物分子的细胞内输送。在组装和操作该系统时，需要考虑几个重要因素。共氟化装置是在PDMS中制造的，PDMS是一种生物相容材料，可以很容易地与一致的通道尺寸²⁷成型。在进行声毒处理之前，设备通道可以用 15 mL 的 70% 乙醇溶液冲洗，以便在与培养细胞配合使用时增加不育性。乙醇清洗后，15 mL 的...

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
Fabrication of Acoustofluidic Device
DOW SYLGARD 184 SILICONE ENCAPSULANT CLEAR 0.5 KG KIT	Ellsworth Adhesives	4019862 (SKU)	https://www.ellsworth.com/products/by-market/consumer-products/encapsulants/silicone/dow-sylgard-184-silicone-encapsulant-clear-0.5-kg-kit/
Harris Uni-Core (2.5 mm)	Electron Microscopy Sciences	69039-25
Microfluidic Reservoir for 15 mL Falcon Tube - S (2/4 port)	Darwin Microfluidics	LVF-KPT-S-2 (SKU)	https://darwin-microfluidics.com/products/15-ml-falcon-tube-microfluidic-reservoir-s-2-4-port
Microscope Slide	VWR	16004-430	https://us.vwr.com/store/product/4646174/vwr-vistavisiontm-microscope-slides-plain-and-frosted-premium
trichlorosilane	Gelest	105732-02-3 (Cas. No.)	Chlorosilane is very hazaradous and flammable. Exposure causes severe burns and eye damage.
Tygon PVC soft plastic tubing (1/16" ID, 1/8" OD)	McMaster-Carr	5233K51 (Part #)	https://www.mcmaster.com/pvc-tubing/soft-tubing-for-air-and-water/
Assembly of Acoustofluidic System
Arduino Uno	Arduino	7630049200050 (Barcode)	https://store.arduino.cc/usa/arduino-uno-rev3
Preparation of Ultrasound Contrast Agents
1,2-distearoyl-sn-glycero-3-ethylphosphocholine (DSEPC)	Avanti Lipids	890703P-25mg (SKU)	https://avantilipids.com/product/890703
1,2-distearoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (DSPC)	Avanti Lipids	850365P-25mg (SKU)	https://avantilipids.com/product/850365
1,2-distearoyl-sn-glycero-3-phosphoglycerol (DSPG)	Avanti Lipids	840465P-25mg (SKU)	https://avantilipids.com/product/840465
APF-140HP (decafluorobutate gas)	FlouroMed	355-25-9 (Cas No.)	http://www.fluoromed.com/products/perfluorodecalin/
DB-338 Amalgamators	COXO		https://www.coxotec.com/coxo/db-338-amalgamators/
polyoxyethylene 40 stearate	Sigma-Aldrich	P3440-250G (SKU)	https://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/p3440?lang=en&region=US&gclid= Cj0KCQjwy8f6BRC7ARIsAPIXOjjj Jh_151mYVEUyLZRavt4re9YQMLS vID64X-1KbO3LUKGjVUwb PDAaAqvOEALw_wcB
Q125 Sonicator	Qsonica	Q125-110 (Ref.)	https://www.sonicator.com/products/q125-sonicator?_pos=1&_sid=406df3776&_ss=r
Preparation of Primarty T Cells
autoMACs running buffer	Miltenyi Biotec	130-091-221 (Order No.)	https://www.miltenyibiotec.com/US-en/products/automacs-running-buffer-macs-separation-buffer.html#gref
Pan T Cell Isolation Kit, human (Pan T-Cell Biotin Antibody Cocktail & Pan T-Cell MicroBead Cocktail)	Miltenyi Biotec	130-096-535 (Order No.)	https://www.miltenyibiotec.com/US-en/products/pan-t-cell-isolation-kit-human.html#130-096-535
magnetic cell sorter (autoMACS Pro Separator)	Miltenyi Biotec	130-092-545 (Order No.)	https://www.miltenyibiotec.com/US-en/products/automacs-pro-separator-starter-kit.html#130-092-545
Preparation of A549 Lung Cancer Cells
Trehalose Assay Kit	Megazyme	K-TREH (Cat. No.)	https://www.megazyme.com/trehalose-assay-kit
Trypan blue (0.4% in aqueous solution Ready-to-Use, sterile)	VWR	97063-702 (Cat. No.)	https://us.vwr.com/store/product/7437427/trypan-blue-0-4-in-aqueous-solution-ready-to-use-sterile