Montagem e Operação de um Dispositivo Acoustofluidic para entrega aprimorada de compostos moleculares às células

Resumo

Este protocolo descreve a montagem e o funcionamento de um dispositivo acoustofluido de baixo custo para rápida entrega molecular às células através de sonoporação induzida por agentes de contraste de ultrassom.

Resumo

A entrega intracelular eficiente de biomoléculas é necessária para uma ampla gama de pesquisas biomédicas e aplicações terapêuticas baseadas em células. Sonoporação mediada por ultrassom é uma técnica emergente para rápida entrega intracelular de biomoléculas. A sonoporação ocorre quando a cavitação de microbolhas cheias de gás forma poros transitórios em membranas celulares próximas, o que permite a absorção rápida de biomoléculas do fluido circundante. As técnicas atuais de sonoporção in vitro de células em suspensão são limitadas pelo rendimento lento, variabilidade nas condições de exposição ao ultrassom para cada célula e alto custo. Para lidar com essas limitações, foi desenvolvido um dispositivo acoustofluido de baixo custo que integra um transdutor de ultrassom em um dispositivo fluido baseado em PDMS para induzir a sonoporação consistente das células à medida que elas fluem pelos canais em combinação com agentes de contraste de ultrassom. O dispositivo é fabricado usando técnicas de fotolitografia padrão para produzir o chip fluido baseado em PDMS. Um transdutor de disco de ultrassom piezo é anexado ao dispositivo e conduzido por um microcontrolador. O conjunto pode ser integrado dentro de uma caixa impressa em 3D para proteção adicional. As células e microbolhas são empurradas através do dispositivo usando uma bomba de seringa ou uma bomba peristáltica conectada à tubulação de PVC. A entrega aprimorada de biomoléculas para células T humanas e células cancerígenas de pulmão é demonstrada com este sistema acoustofluido. Em comparação com as abordagens de tratamento em massa, este sistema acoustofluidic aumenta o rendimento e reduz a variabilidade, o que pode melhorar os métodos de processamento celular para aplicações de pesquisa biomédica e fabricação de terapêuticas baseadas em células.

Introdução

Plataformas virais e não virais têm sido utilizadas para melhorar a entrega molecular às células. A entrega viral (transdução) é uma técnica comum utilizada em terapias baseadas em células que requerem modificação genômica. As limitações com a entrega viral incluem mutagênese insercional potencial, capacidade transgênica limitada e multiplicidade indesejada de infecção^1,2. Portanto, técnicas de entrega molecular não viral estão em desenvolvimento para uma ampla gama de aplicações biomédicas e de pesquisa. Técnicas comuns incluem mecânica, elétrica, hidrodinâmica ou o uso de energia baseada a laser para melhorar a absorção de biomoléculas nas células ³. A eletroporação é uma plataforma de entrega molecular não viral comumente utilizada que tem a capacidade de induzir perfuração transitória na membrana plasmática para a entrega intracelular dos compostos moleculares^4,5,6,7,8,9. No entanto, a perfuração transitória da membrana plasmática é um processo estocástico e a absorção molecular via eletroporação é geralmente dependente da difusão passiva através dos poros da membrana transitória^4,7,8.

Um método alternativo é a utilização de ultrassom para melhor entrega molecular intracelular através da cavitação de agentes de contraste de ultrassom (ou seja, microbolhas cheias de gás). A cavitação de microbolhas induz efeitos de microstreaming na mídia circundante que podem causar perfuração transitória de membranas plasmáticas próximas ("sonoporação") permitindo a rápida absorção intracelular de biomoléculas através de mecanismos de transporte passivos ou ativos^10,11,12. A sonoporação é uma técnica eficaz para a rápida entrega molecular às células, mas essa abordagem muitas vezes requer equipamentos caros e métodos de tratamento em massa que são limitados por menor rendimento e maior variabilidade nas condições de exposição ao ultrassom¹³. Para lidar com essas limitações, os dispositivos aoustofluidos, que permitem a sonoporação consistente das células em suspensão, estão atualmente em desenvolvimento.

Acoustofluidics é um campo em expansão que integra tecnologias de ultrassom e microfluidic para uma ampla variedade de aplicações. Esta abordagem tem sido usada anteriormente para a separação de partículas, aplicando energia contínua de ultrassom para induzir ondas acústicas permanentes dentro dos canais fluidos^14,15,16,17. As partículas são classificadas em diferentes partes do dispositivo com base em uma variedade de propriedades, como tamanho de partícula, densidade e compressão em relação ao médio¹⁶. Tecnologias acoustofluídicas também estão em desenvolvimento para permitir a entrega molecular rápida a uma variedade de tipos de células para aplicações de pesquisa e fabricação de terapias celulares¹⁸. Recentemente, demonstramos uma entrega molecular aprimorada para eritrócitos usando um dispositivo acoustofluido baseado em PDMS¹⁹. Na plataforma acoustofluidic, a dinâmica celular e microbolhas pode ser manipulada para induzir interações físicas que permitem uma entrega aprimorada de biomoléculas. A eficiência e consistência da entrega molecular intracelular pode potencialmente ser aumentada otimizando a distância entre células e microbolhas.

Uma aplicação importante para a sonoporação mediada por aoustofluidic envolve o transporte de biomoléculas para células T humanas primárias. Imunoterápicos baseados na transferência de células T adotivas, como a terapia de células T do Receptor de Antígeno Quimérico (CAR T), estão surgindo rapidamente para o tratamento de várias doenças, incluindo câncer e vírus como o HIV²⁰. A terapia CAR T tem sido particularmente eficaz em pacientes com leucemia linfoblástica aguda pediátrica (LLA), com taxas de remissão completas de 70-90%²¹. No entanto, a fabricação de células T para essas terapias geralmente depende da transdução viral, que é limitada por mutagênese insercional potencial, longos tempos de processamento e desafios de fornecer biomoléculas não genéticas, como proteínas ou pequenas moléculas¹. Métodos de entrega molecular mediados por acoustofluidic podem potencialmente superar essas limitações e melhorar a fabricação de terapias celulares T.

Outra aplicação importante para a sonoporação mediada por austofluidic envolve a entrega intracelular de compostos conservantes, como o trehalose, que protegem as células durante o congelamento e a dessecação. O trehalose é produzido por alguns organismos na natureza e os ajuda a tolerar congelamento e dessacação protegendo suas membranas celulares^22,23. No entanto, o trehalose não é produzido por células mamíferas e é impermeável às membranas celulares de mamíferos. Portanto, técnicas eficazes de entrega molecular, como a sonoporação, são necessárias para alcançar níveis suficientes de trehalose intracelular necessários para proteger membranas celulares internas. Esta abordagem está atualmente em desenvolvimento para preservação seca de vários tipos de células.

Este protocolo fornece uma descrição detalhada da montagem e operação de um sistema aoustofluido relativamente de baixo custo conduzido por um microcontrolador. Os agentes de contraste do ultrassom são utilizados para induzir a sonoporação dentro dos canais fluidos e permitir a entrega molecular rápida para vários tipos de células, incluindo células T e células cancerosas. Este sistema acoustofluidic pode ser usado para uma variedade de aplicações de pesquisa e também pode ser útil como um sistema protótipo para avaliar métodos de sonoporação para melhores processos de fabricação de terapia celular.

Protocolo

Doações de sangue foram coletadas de doadores saudáveis seguindo protocolos aprovados pelo conselho de revisão institucional da Universidade de Louisville.

1. Fabricação de dispositivo acoustofluido

1. Obtenha uma fotomasmamama com um design espiral concêntrico contendo canais com um diâmetro de 500 μm. Um arquivo CAD é fornecido nos arquivos suplementares como exemplo. Uma máscara personalizada pode ser encomendada de um fornecedor comercial ou padronizada usando um escritor de máscaras.
2. Prepare um molde do design em espiral concêntrico em um wafer de silício revestido de fotoresistista usando técnicas de fotolitografia padrão.
   1. Adicione aproximadamente 2 Colheres de Sopa (~30 mL) de SU-8 2100 a um wafer de silício de 100 mm.
   2. Gire o wafer em um spinner a uma velocidade de 150 rpm por 30 s para espalhar o fotoresist, em seguida, aumentar a velocidade para 1.200 rpm para 60 s para produzir uma espessura de 200 μm.
   3. Cure o wafer revestido de fotoresistista em um forno a vácuo de poliimida com uma rampa de 30 minutos para cima e 30 min residir a 115 °C, depois descer por 30 min.
   4. Exponha o wafer revestido de fotoresist para 130 s usando um alinhador de máscara com a máscara da etapa 1.1.
   5. Asse o wafer após a exposição após o mesmo processo descrito na etapa 1.2.3.
   6. Desenvolva o fotoresist na solução de desenvolvedor SU-8 por aproximadamente 8 minutos.
      ATENÇÃO: Use apenas a solução do desenvolvedor em um capô de fumaça química bem ventilado.
3. Silanize o molde para tornar a superfície mais hidrofóbica. Coloque o wafer revestido de fotoresistista em um dessecator e adicione uma gota de 20 μL de cloroilano (C₈H₄Cl₃F₁₃Si). Aplique vácuo na câmara por 30 s, depois sele a câmara e saia durante a noite.
   ATENÇÃO: A cloroilana é muito perigosa e inflamável. A exposição causa queimaduras graves e danos oculares.
4. Combine 54 g de base de polidimethsiloxano (PDMS) e 6 g de agente de cura em um copo e misture vigorosamente e completamente com uma espátula por pelo menos 1 min.
5. Coloque o copo contendo a solução PDMS em um dessecador por aproximadamente 30 minutos ou até que as bolhas de ar remanescentes sejam removidas da solução.
6. Coloque wafer revestido de fotoresistista com os padrões voltados para cima em uma placa de Petri de 150 mm.
7. Despeje a solução PDMS sobre o molde dentro da placa de Petri de 150 mm.
8. Se necessário, coloque a placa de Petri de 150 mm dentro de um desiccador e aplique vácuo até que as bolhas de ar remanescentes desapareçam.
9. Transfira a placa de Petri de 150 mm para um forno de laboratório e asse por 2h a 60 °C para curar o PDMS.
10. Após a cura, remova cuidadosamente o PDMS da placa de Petri, cortando as bordas do wafer usando uma lâmina de barbear.
11. Corte cada dispositivo individual usando uma faca ou lâmina de barbear.
12. Faça furos nas portas de entrada e saída de cada dispositivo usando um soco de biópsia de 2,5 mm.
13. Coloque cada dispositivo PDMS em um asher de plasma com canais expostos (voltados para cima). Aplique tratamento de plasma de oxigênio (100 W para 45 s, 500 mbar O₂) e coloque imediatamente cada dispositivo PDMS em um slide de microscópio de vidro de limão de soda limpo (75 mm x 25 mm x 1 mm) com canais voltados para a superfície do vidro.
14. Deixe os dispositivos se unirem durante a noite à temperatura ambiente.
15. Aplique suavemente silicone na superfície do transdutor piezo de 1 cm de diâmetro com uma espessura de ~1-2mm, depois alinhe cuidadosamente o transdutor com a espiral concêntrica e pressione-o suavemente na parte inferior do slide do microscópio de vidro (lado oposto do dispositivo PDMS).

2. Montagem e operação do sistema acoustofluidic

1. Conecte um microcontrolador a um computador usando um cabo USB A a B. Um indicador LED de energia verde (rotulado PWR) deve acender.
2. Use o programa associado no computador para carregar um programa que gera um sinal de 8 MHz. Um programa de exemplo é fornecido nos F iles suplementares . Após o upload do programa, ele será armazenado na memória do microprocessador e não precisará ser carregado novamente.
3. Soldar um fio de 1" 22G até a extremidade de cada fio no transdutor PZT.
4. Conecte o fio terminal negativo (preto) do transdutor PZT a um pino GND através do fio soldado.
5. Conecte o fio terminal positivo (vermelho) do transdutor PZT ao pino de saída (#9 no programa de exemplo fornecido) através do fio soldado.
6. Opcionalmente, monte o dispositivo acoustofluidic e o microcontrolador em uma caixa impressa em 3D. Os arquivos CAD são fornecidos nos Files upplemental Scomo exemplos. Fios adicionais podem ser conectados a outros pinos microcontroladores para controlar um indicador LED externo e botão de pressão liga/desliga, se desejar.
7. Corte seções de 3-6" do tubo de plástico macio tygon PVC (1/16" ID, 1/8" OD) e empurre a tubulação para as portas de entrada e saída. Pode ser necessário girar a tubulação enquanto aplica pressão até que se encaixe na abertura. Opcionalmente, após inserir o tubo em cada porta, a cola pode ser aplicada na junção para unir o PDMS e a tubulação.
8. Monte o reservatório microfluido de acordo com as instruções do fabricante.
9. Corte uma seção de 3-6" do tubo de plástico macio tygon PVC (1/16" ID, 1/8" OD) e empurre a tubulação sobre a tubulação de 1/32" de ID da tubulação de saída do reservatório microfluido. Opcionalmente, enrole a junção com filme de parafina para evitar vazamentos.
10. Encha uma seringa de 60 mL com ar ambiente (opcionalmente, filtre o ar com um filtro de 0,2-μm) e conecte-o à tubulação de PVC tygon (1/16" ID, 1/8" OD) na lateral do reservatório microfluido.
11. Ajuste a bomba de seringa a uma taxa de 200 mL/h para empurrar as soluções do agente de contraste celular/ultrassom através do dispositivo acoustofluidic a uma taxa de fluxo volumoso de 50 mL/h e colete as amostras da saída do dispositivo acoustofluidic em um tubo de centrífuga de 50mL. Opcionalmente, enxágue o canal antes do tratamento acoustofluido com 15 mL de solução de 70% de etanol para aumentar a esterilidade dos canais fluidos. Além disso, os canais podem ser enxaguados com 15 mL de água desionizada para remover etanol residual no dispositivo antes de bombear células através do sistema.

3. Preparação de agentes de contraste de ultrassom

NOTA: Os agentes de contraste do ultrassom aumentam significativamente a entrega acoustofluidic de compostos moleculares, aumentando transitoriamente a permeabilização das membranas celulares próximas¹⁹. A entrega molecular é muito limitada sem agentes de contraste de ultrassom neste sistema.

1. Prepare uma solução fosfolipílica em um frasco de cintilação de 20mL contendo a seguinte mistura:
   1. Adicione 25 mg de 1,2-distearoyl-sn-gliceo-3-fosfocholina (DSPC).
   2. Adicione 11,6 mg de 1,2-distearoyl-sn-gliceo-3-etilfosforcholina (DSEPC).
   3. Adicione 0,26 mg de 1,2-distearoyl-sn-gliceo-3-fosfoglycerol (DSPG).
   4. Adicione 0,88 mg de estearato de polioximetileno40.
2. Adicione clorofórmio até que todos os fosfolipídios sejam dissolvidos (por exemplo, 3 mL de clorofórmio).
3. Evaporar clorofórmio em um desiccator por 48 h para formar uma película lipídica seca (evaporação sob argônio ou com um evaporador rotativo pode ser usado para acelerar o processo de secagem).
4. Reidratar o filme lipídico com 10 mL de soro fisiológico estéril tamponado com fosfato (PBS).
5. Sonicar a solução lipídica por 3 min a 40% de amplitude para formar uma solução micelar cônica.
6. Após a sonicação armazenar a solução fosfolipídida a 2-6 °C por até 1 mês.
7. Para preparar os agentes de contraste de ultrassom, adicione 200 μL de solução micelar cônica e 600 μL de PBS estéril a um frasco de septo de vidro de 2 mL.
8. Sele o frasco acariciando a tampa.
9. Use uma agulha de 1,5" 20G para encher o espaço da cabeça do frasco com gás decafluorobutano para 30 s.
10. Amalgamar o frasco para 45 s a 4.350 cpm para formar agentes de contraste de ultrassom cheios de gás perfluorobutano.
11. Adicione 25 μL de solução de agente de contraste de ultrassom por 1 mL de solução celular imediatamente antes de bombear a mistura de agente de contraste combinado/célula através do dispositivo acoustofluidic. A solução celular pode ser modificada conforme desejado pelo usuário, mas em nossos estudos a solução celular consistiu em células T primárias na etapa 4.21, e células cancerígenas pulmonares A549 na etapa 5.7, respectivamente.

4. Preparação de Tcélulas primárias

1. Isole as células mononucleares periféricas (PBMCs) de soluções de sangue inteiros e armazene a -150 °C. A separação de gradiente de densidade contendo um substrato é comumente utilizada para separar os PBMCs do sangue inteiro^24,25,26.
2. Descongele o frasco congelado em banho-maria de 37 °C.
3. PbMCs descongelados diluídos 1:10 com PBS em um tubo de centrífuga de 15mL. Cada frasco 1mL contém aproximadamente 10 milhões de PBMCs.
4. A centrífugas diluídas PBMCs a 580 x g para 11 min a 4 °C.
5. Aspire o supernasciente e adicione 13 mL de MACs executando buffer para resuspensar as células.
6. Conte os PBMCs com um contador celular automatizado ou hemócito.
7. Centrifugar os PBMCs novamente a 580 x g por 11 min a 4 °C e aspirar o supernasciente.
8. Adicione 40 μL de tampão de corrida refrigerado por 10 milhões de PBMCs.
9. Para isolar as células T, adicione 10 μL de Pan T-Cell Biotin Antibody Cocktail por 10 milhões de PBMCs.
10. Agitar suavemente os PBMCs e armazenar a solução a 4 °C por 5 min por 10 milhões de células.
11. Adicione 30 μL de buffer de corrida e 20 μL de Pan T-Cell MicroBead Cocktail por 10 milhões de PBMCs.
12. Misture os PBMCs e as contas completamente e incubar por mais 15 min a 4 °C.
13. Adicione buffer de execução para atingir um volume total de 500 μL.
14. Separe as células T primárias com um instrumento de classificação magnética de bancada comercialmente disponível usando a configuração de "separação esgota" seguindo o protocolo do fabricante. Esta etapa deve render entre 5-10 milhões de células T após a classificação celular.
15. Conte células T usando um contador celular automatizado ou hemótmetro.
16. Diluir células T em 10 mL de PBS estéril e centrífuga a 580 x g por 10 min a 4 °C para pelotar as células.
17. Aspire as células T supernascidas e resuspend em 1 mL de PBS.
18. Conte células T usando um contador celular automatizado ou hemócitometro e alíquota de 1 milhão/mL para experimentos.
19. Prepare uma solução de fluoresceína de 1 mg/mL em PBS.
20. Adicione 100 μL de solução de fluoresceína de 1 mg/mL por solução celular T de 1 mL (concentração final de fluoresceína = 100 μg/mL) imediatamente antes do processamento.
21. Adicione 25 μL de solução de agente de contraste de ultrassom, conforme descrito anteriormente na etapa 3.11.
22. Processe alíquotas 1mL de células usando o sistema acoustofluido (ver etapas 2.10-2.11). Esta etapa aumenta a entrega de fluoresceína em células T primárias.
23. Imediatamente após o tratamento, lave as células três vezes via centrifugação a 580 x g por 10 min com 500 μL de PBS para remover fluoresceína extracelular. As células devem ser lavadas dentro de 10 minutos após a adição de solução de fluoresceína.
24. Após a etapa final de lavagem, resuspend as células em 250 μL de PBS e mede a fluorescência no citômetro de fluxo.

5. Preparação de células cancerígenas de pulmão A549

1. Cultura A549 (epitelial basal adenocarcinomômico humano) células em mídia DMEM completa (10% soro bovino fetal, 1% penicilina/estreptomicina) a 37 °C e 5% CO₂ em um frasco de cultura de tecido de fundo plano.
2. Colher células A549 quando atingirem 70-90% de confluência. Aspirar a mídia do frasco e lavar as células uma vez com PBS para remover proteínas séricos.
3. Adicione trippsina (0,25%) EDTA ao frasco e incubar por 5 min a 37 °C. Trippsina é uma enzima digestiva que faz com que as células se desprendem da superfície inferior do frasco de cultura tecidual.
4. Transfira a solução trypsin para um tubo de centrífuga de 15mL e neutralize-o adicionando mídia DMEM completa a uma proporção de 1:3.
5. Pelota as células via centrifugação a 1.500 x g por 5 min a 4 °C.
6. Aspire o supernasal e resuspenha a pelota em uma concentração de 100.000/mL em solução PBS contendo trehalose de 200 mM em frasco cônico de 15 mL.
7. Adicione 25 μL de solução de agente de contraste de ultrassom, conforme descrito anteriormente na etapa 3.11.
8. Processe alíquotas 1mL de células usando o sistema acoustofluido (ver etapas 2.10-2.11). Esta etapa aumenta a entrega de trehalose em células cancerígenas de pulmão A549.
9. Imediatamente após o tratamento, lave as células três vezes via centrifugação com 500 μL de PBS para remover trehalose extracelular. As células devem ser lavadas dentro de 10 minutos após a adição de solução de trehalose.
10. Após a etapa final de lavagem, resuspend as células em 100 μL de PBS.
11. Adicione 11 μL de solução Triton X-100 de 1% às células de lise e solte trehalose intracelular.
12. Vórtice para 15 s, em seguida, incubar por 30 minutos em temperatura ambiente.
13. Vórtice novamente para 15 s, em seguida, medir a concentração de trehalose usando ensaio de trehalose comercialmente disponível seguindo a recomendação do fabricante.

Resultados

Uma imagem do sistema acoustofluido montado dentro de uma caixa impressa em 3D é mostrada na Figura 1. Este protocolo produz um sistema acoustofluido que pode ser usado para melhorar a entrega molecular intracelular em múltiplas linhas celulares usando agentes de contraste de ultrassom.

Figura 2   demonstra maior entrega intracelular de um composto fluorescente, fluoresceína, para células T humanas primárias com...

Discussão

Este protocolo descreve a montagem e o funcionamento de um sistema acoustofluido de baixo custo que melhora a entrega intracelular de biomoléculas para aplicações de pesquisa. Existem vários fatores importantes a serem considerados na montagem e operação deste sistema. O dispositivo acoustofluido é fabricado em PDMS, que é um material biocompatível que pode ser facilmente moldado com dimensões de canal consistentes²⁷. Os canais do dispositivo podem ser enxaguados com 15 mL de solução d...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
Fabrication of Acoustofluidic Device
DOW SYLGARD 184 SILICONE ENCAPSULANT CLEAR 0.5 KG KIT	Ellsworth Adhesives	4019862 (SKU)	https://www.ellsworth.com/products/by-market/consumer-products/encapsulants/silicone/dow-sylgard-184-silicone-encapsulant-clear-0.5-kg-kit/
Harris Uni-Core (2.5 mm)	Electron Microscopy Sciences	69039-25
Microfluidic Reservoir for 15 mL Falcon Tube - S (2/4 port)	Darwin Microfluidics	LVF-KPT-S-2 (SKU)	https://darwin-microfluidics.com/products/15-ml-falcon-tube-microfluidic-reservoir-s-2-4-port
Microscope Slide	VWR	16004-430	https://us.vwr.com/store/product/4646174/vwr-vistavisiontm-microscope-slides-plain-and-frosted-premium
trichlorosilane	Gelest	105732-02-3 (Cas. No.)	Chlorosilane is very hazaradous and flammable. Exposure causes severe burns and eye damage.
Tygon PVC soft plastic tubing (1/16" ID, 1/8" OD)	McMaster-Carr	5233K51 (Part #)	https://www.mcmaster.com/pvc-tubing/soft-tubing-for-air-and-water/
Assembly of Acoustofluidic System
Arduino Uno	Arduino	7630049200050 (Barcode)	https://store.arduino.cc/usa/arduino-uno-rev3
Preparation of Ultrasound Contrast Agents
1,2-distearoyl-sn-glycero-3-ethylphosphocholine (DSEPC)	Avanti Lipids	890703P-25mg (SKU)	https://avantilipids.com/product/890703
1,2-distearoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (DSPC)	Avanti Lipids	850365P-25mg (SKU)	https://avantilipids.com/product/850365
1,2-distearoyl-sn-glycero-3-phosphoglycerol (DSPG)	Avanti Lipids	840465P-25mg (SKU)	https://avantilipids.com/product/840465
APF-140HP (decafluorobutate gas)	FlouroMed	355-25-9 (Cas No.)	http://www.fluoromed.com/products/perfluorodecalin/
DB-338 Amalgamators	COXO		https://www.coxotec.com/coxo/db-338-amalgamators/
polyoxyethylene 40 stearate	Sigma-Aldrich	P3440-250G (SKU)	https://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/p3440?lang=en&region=US&gclid= Cj0KCQjwy8f6BRC7ARIsAPIXOjjj Jh_151mYVEUyLZRavt4re9YQMLS vID64X-1KbO3LUKGjVUwb PDAaAqvOEALw_wcB
Q125 Sonicator	Qsonica	Q125-110 (Ref.)	https://www.sonicator.com/products/q125-sonicator?_pos=1&_sid=406df3776&_ss=r
Preparation of Primarty T Cells
autoMACs running buffer	Miltenyi Biotec	130-091-221 (Order No.)	https://www.miltenyibiotec.com/US-en/products/automacs-running-buffer-macs-separation-buffer.html#gref
Pan T Cell Isolation Kit, human (Pan T-Cell Biotin Antibody Cocktail & Pan T-Cell MicroBead Cocktail)	Miltenyi Biotec	130-096-535 (Order No.)	https://www.miltenyibiotec.com/US-en/products/pan-t-cell-isolation-kit-human.html#130-096-535
magnetic cell sorter (autoMACS Pro Separator)	Miltenyi Biotec	130-092-545 (Order No.)	https://www.miltenyibiotec.com/US-en/products/automacs-pro-separator-starter-kit.html#130-092-545
Preparation of A549 Lung Cancer Cells
Trehalose Assay Kit	Megazyme	K-TREH (Cat. No.)	https://www.megazyme.com/trehalose-assay-kit
Trypan blue (0.4% in aqueous solution Ready-to-Use, sterile)	VWR	97063-702 (Cat. No.)	https://us.vwr.com/store/product/7437427/trypan-blue-0-4-in-aqueous-solution-ready-to-use-sterile