Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • النتائج
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

هنا، نقدم طريقة معدلة TGA لتقدير محتوى اللجنين في الكتلة الحيوية النباتية العشبية. تقدر هذه الطريقة محتوى اللجنين من خلال تشكيل روابط ثيوثير محددة مع اللجنين وتقدم ميزة على طريقة Klason ، لأنها تتطلب عينة صغيرة نسبيا لتقدير محتوى اللجنين.

Abstract

اللجنين هو البوليمر الطبيعي الذي هو البوليمر الثاني الأكثر وفرة على الأرض بعد السليلوز. يتم إيداع اللجنين بشكل رئيسي في جدران الخلايا الثانوية النباتية وهو heteropolymer العطرية تتألف في المقام الأول من ثلاثة monolignols مع أهمية صناعية كبيرة. يلعب اللجنين دورا هاما في نمو النباتات وتنميتها، ويحمي من الضغوط الحيوية والأبايوتية، وفي جودة العلف الحيواني والخشب ومنتجات اللجنين الصناعية. التقدير الدقيق لمحتوى اللجنين ضروري لكل من الفهم الأساسي والإدراك الحيوي لللجنين والتطبيقات الصناعية للكتلة الحيوية. طريقة حمض ثيوغليكوليك (TGA) هي طريقة موثوقة للغاية لتقدير إجمالي محتوى اللجنين في الكتلة الحيوية النباتية. تقدر هذه الطريقة محتوى اللجنين عن طريق تشكيل ثيويثرز مع مجموعات الكحول البنزيل من اللجنين ، والتي هي قابلة للذوبان في الظروف القلوية وغير قابلة للذوبان في الظروف الحمضية. يقدر إجمالي محتوى اللجنين باستخدام منحنى قياسي تم إنشاؤه من اللجنين التجاري من الخيزران.

Introduction

اللجنين هو واحد من المكونات الحيوية الحاملة لجدران الخلايا النباتية وثاني أكثر البوليمرات وفرة على الأرض1. كيميائيا، اللجنين هو heteropolymer مترابطة تتكون من مركبات الفينولية المعقدة عالية الوزن الجزيئي التي تشكل مصدرا طبيعيا متجددا من البوليمرات العطرية وتوليف المواد الحيوية2،3. هذا البوليمر الطبيعي يلعب أدوارا هامة في نمو النبات، والتنمية، والبقاء على قيد الحياة، والدعم الميكانيكي، وصلابة جدار الخلية، ونقل المياه، والنقل المعدني، ومقاومة السكن، والأنسجة وتطوير الأعضاء، وترسب الطاقة، والحماية من الضغوط الحيوية والأحيائية4،5،6،7. ويتكون اللجنين في المقام الأول من ثلاثة monolignols مختلفة: الصنوبرية, سينابيل وp-كوماريل الكحول التي تستمد من مسار بروبانويد الفينيل8,9. كمية اللجنين وتكوين مونومر تختلف على أساس الأنواع النباتية، ونوع الأنسجة / الجهاز، ومراحل مختلفة من تطوير النبات10. يصنف اللجنين على نطاق واسع إلى الخشب اللين والأخشاب الصلبة واللجنين العشبي استنادا إلى المصدر وتكوين أحادي الليجنول. ويتكون الخشب اللين في المقام الأول من الكحول الصنوبرية 95٪ مع 4٪ ف كوماريل و 1٪ سينابيل الكحول. الخشب الصلب والكحول الصنوبرية والسينابيل بنسب متساوية، في حين يتكون اللجنين العشب من نسب مختلفة من الكحول الصنوبرية، سينابيل وب كوماريل11،12. تكوين مونومرات أمر بالغ الأهمية لأنه يحدد قوة اللجنين، والتحلل، وتدهور جدار الخلية، فضلا عن تحديد التركيب الجزيئي، وتفريع، والربط مع السكريات الأخرى13،14.

اكتسبت أبحاث اللجنين أهمية في الأعلاف وصناعات النسيج والصناعات الورقية والإيثانول الحيوي والوقود الحيوي والمنتجات الحيوية بسبب انخفاض تكلفتها ووفرتها العالية15و16. تم استخدام طرق كيميائية مختلفة (مثل بروميد أسيتيل والمنظفات الحمضية وكلاسون وأكسدة البيرمانجانات) جنبا إلى جنب مع طرق مفيدة (على سبيل المثال ، بالقرب من التحليل الطيفي بالأشعة تحت الحمراء (NIR) ، والمنظار بالرنين المغناطيسي النووي (NMR) ، والقياس الطيفي للأشعة فوق البنفسجية (UV) ) لتحديد كمية اللجنين9،17. تصنف طرق تحليل اللجنين بشكل عام على أساس الإشعاع الكهرومغناطيسي وقياس الجاذبية والذوبان. واستند المبدأ وراء تقدير اللجنين عن طريق الإشعاع الكهرومغناطيسي على الخصائص الكيميائية لللجنين التي تمتص الضوء في أطوال موجية محددة. وقدرت هذه النتائج على أساس مبدأ أن اللجنين لديه امتصاص الأشعة فوق البنفسجية أقوى من الكربوهيدرات. في عام 1962، استخدم بولكر وميبرفيلي حبيبات كلوريد البوتاسيوم لتقدير محتوى اللجنين في الخشب18. ومع ذلك، فإن هذه الطريقة لها عيوب في تقدير محتوى اللجنين من العينات العشبية بسبب وجود مركبات فينولية غير اللجنين وعدم وجود معامل انقراض مناسب. في عام 1970، وجد فيرجس وغورينغ أن كمية امتصاص مركب غواياسيل وسيرينغيل كانت عند 280 نانومتر و 270 نانومتر، مما صحح مسألة معامل الانقراض لطريقة بولكر ون سومرفل19. وفي وقت لاحق، استخدم التحليل الطيفي بالأشعة تحت الحمراء، وهو تقنية حساسة للغاية لوصف الفينول، لتقدير اللجنين مع كمية صغيرة من عينات الكتلة الحيوية النباتية. ومن الأمثلة على هذه التكنولوجيا قياس الطيف تحويل فورييه المنتشر. هذه الطريقة، ومع ذلك، يفتقر إلى معيار مناسب مماثل لطريقة الأشعة فوق البنفسجية20. في وقت لاحق، تم تقدير محتوى اللجنين من قبل NIRS (بالقرب من التحليل الطيفي بالأشعة تحت الحمراء) وNMR (التحليل الطيفي بالرنين المغناطيسي النووي). على الرغم من أن هناك عيوب في هذه الأساليب ، فإنها لا تغير التركيب الكيميائي لللجنين ، مع الحفاظ على نقاوته20.

طريقة كلاسون gravimetric هو الأسلوب التحليلي المباشر والأكثر موثوقية لتقدير اللجنين من ينبع الخشبية. أساس تقدير اللجنين gravimetric هو التحلل المائي / solubilization من المركبات غير اللجنين وجمع اللجنين غير القابلة للذوبان لقياس الجاذبية21. في هذه الطريقة ، تتم إزالة الكربوهيدرات عن طريق التحلل المائي للكتلة الحيوية مع تركيز H2SO4 لاستخراج بقايا اللجنين20،22. يعرف محتوى اللجنين المقدر بهذه الطريقة باسم اللجنين غير القابل للذوبان الحمضي أو كلاسون ليجنين. يعتمد تطبيق طريقة Klason على أنواع النباتات ونوع الأنسجة ونوع جدار الخلية. وجود كميات متغيرة من المكونات غير اللجنين مثل العفص والسكريات والبروتينات، ويؤدي إلى اختلافات متناسبة في تقدير محتويات اللجنين حمض غير قابل للذوبان / قابلة للذوبان. وبالتالي ، ينصح فقط طريقة كلاسون لتقدير اللجنين من الكتلة الحيوية عالية المحتوى اللجنين مثل ينبعالخشبية 17،23. أساليب الذوبان مثل بروميد أسيتيل (AcBr) ، اللجنين غير القابل للذوبان الحمضي ، وحمض ثيوجليكوليك (TGA) هي أكثر الطرق استخداما لتقدير محتوى اللجنين من مصادر الكتلة الحيوية النباتية المختلفة. أنشأ كيم وآخرون طريقتين لاستخراج اللجنين عن طريق التشحيم. الطريقة الأولى تستخرج اللجنين كبقايا غير قابلة للذوبان عن طريق السيلولوز اللحم والهيميسيلولوز ، في حين أن الطريقة الثانية تفصل اللجنين في الكسر القابل للذوبان ، تاركة السليلوز والهيميسيلولوز كبقايا غير قابلة للحل24.

أساليب مماثلة تستخدم في تقدير اللجنين على أساس قابلية الذوبان هي حمض ثيوغليكوليك (TGA) وبروميد أسيتيل (AcBr) أساليب25. كل من أساليب TGA وبروميد أسيتيل تقدير محتوى اللجنين عن طريق قياس امتصاص اللجنين solubilized في 280 نانومتر; ومع ذلك، فإن طريقة AcBr تحط من xylans أثناء عملية اللجنين solubilization ويظهر زيادة كاذبة في محتوى اللجنين26. طريقة ثيوجليكولات (TGA) هي الطريقة الأكثر موثوقية ، لأنها تعتمد على ارتباط محدد مع مجموعات ثيوثير من مجموعات الكحول البنزيل من اللجنين مع TGA. يتم تسريع اللجنين المقيد TGA في ظل ظروف حمضية باستخدام HCl ، ويقدر محتوى اللجنين باستخدام امتصاصه عند 280 نانومتر27. أسلوب TGA له مزايا إضافية من تعديلات هيكلية أقل، وشكل قابل للذوبان من تقدير اللجنين، وأقل تدخلا من المكونات غير اللجنين، وتقدير دقيق لللجنين بسبب الترابط محددة مع TGA.

يتم تعديل طريقة TGA هذه استنادا إلى نوع عينة الكتلة الحيوية النباتية المستخدمة لتقدير محتوى اللجنين. هنا، قمنا بتعديل وتكييف طريقة TGA السريعة من قش الأرز27 إلى أنسجة القطن لتقدير محتوى اللجنين. لفترة وجيزة، تعرضت عينات النباتات المجففة مسحوق لبروتين solubilization العازلة واستخراج الميثانول لإزالة البروتينات وكسر الكحول القابلة للذوبان. وعولجت بقايا الكحول غير القابلة للذوبان مع TGA وعجل اللجنين في ظل ظروف حمضية. تم إنشاء منحنى معيار اللجنين باستخدام اللجنين الخيزران التجارية وتم الحصول على خط الانحدار (y = mx +c). تستخدم قيمة "x" متوسط قيم امتصاص اللجنين عند 280 نانومتر، في حين تم إدخال قيم "m" و "c" من خط الانحدار لحساب تركيز اللجنين غير المعروف في عينات الكتلة الحيوية النباتية القطنية. وتنقسم هذه الطريقة إلى خمس مراحل: 1) إعداد عينات النباتات؛ (2) إعداد عينات نباتية؛ (2) إعداد عينات نباتية؛ (2) إعداد عينات نباتية؛ (3) إعداد عينات نباتية 2) غسل العينات بالماء والميثانول؛ 3) علاج بيليه مع TGA وحمض لتسريع اللجنين؛ 4) هطول الأمطار من اللجنين؛ و 5) إعداد منحنى القياسية وتقدير محتوى اللجنين للعينة. وتركز المرحلتان الأوليان في المقام الأول على إعداد المواد النباتية تليها المياه، PSB (البروتين solubilization العازلة) واستخراج الميثانول للحصول على المواد غير القابلة للذوبان الكحول. ثم، تم التعامل مع TGA (حمض ثيوغليكوليك) وHCl لتشكيل مجمع مع اللجنين في المرحلة الثالثة. في النهاية، تم استخدام HCl لتسريع اللجنين، الذي تم حله في هيدروكسيد الصوديوم لقياس امتصاصه في 280 نانومتر28.

Protocol

1. إعداد عينات النباتات

  1. جمع نباتات القطن لمدة شهرين من الدفيئة (الشكل 1A).
  2. الوجه الأواني النباتية بلطف لفصل التربة والجذور مع جذور الجانبي سليمة عن طريق تخفيف التربة حول النبات(الشكل 1B).
  3. غسل النباتات التي تم جمعها جيدا في الصواني مليئة بالماء لإزالة جميع الأوساخ (لعينات الجذر) (الشكل 1C).
  4. استخدام المناشف الورقية لتجف فصل الجذر، الجذعية، والأنسجة ورقة، وتسمية لهم(الشكل 1D). الهواء الجاف لمدة 2 أيام في درجة حرارة الغرفة لمنع أي تلوث الفطريات (الشكل 1E).
  5. نقل أنسجة العينة إلى حاويات موسومة/ رقائق ألمنيوم واحتضانها في حاضنة يتم التحكم في درجة حرارتها عند 49 درجة مئوية لمدة 7 إلى 10 أيام(الشكل 1F).
    ملاحظة: قد تغير درجات الحرارة المرتفعة بنية اللجنين. بدلا من ذلك، يمكن استخدام مجفف التجميد لتجفيف العينات لمدة 1 إلى 2 أيام دون التسبب في أي تغييرات كيميائية في الكتلة الحيوية النباتية.
  6. استخدام شفرة لقطع الأنسجة المجففة حاضنة إلى قطع حجم 5 ملم أو بدلا من ذلك استخدام طاحونة الكتلة الحيوية لطحن الأنسجة النباتية (الشكل 1G، الشكل 1H).
    ملاحظة: يجب تنظيف طاحونة الكتلة الحيوية / شفرة بعد قطع كل عينة / الأرض.
  7. نقل قطع الأنسجة / الكتلة الحيوية على الارض المواد النباتية في قارورة طحن وطحن في مسحوق ناعم من حجم 1 ملم باستخدام طاحونة التجميد أو طاحونة المبردة مع السائل N2.
  8. طحن عينات لثلاث دورات بمعدل 10 CPS (كل دورة تمتد من 2 دقيقة) في مسحوق موحد (الشكل 1I، 1J ، 1K).
    ملاحظة: يمكن إيقاف التجربة مؤقتا عند هذه النقطة ويمكن تخزين العينات في درجة حرارة الغرفة في حاويات محكمة الإغلاق للتخزين على المدى الطويل.

2. غسل العينات بالماء، PSB، والميثانول

  1. قياس وتسجيل وزن جميع أنابيب الميكروفون الفارغة سعة 2 مل المستخدمة في تقدير محتوى اللجنين في دفتر الملاحظات المعملي.
  2. نقل 20 ملغ من مسحوق عينة الأرض إلى أنبوب وزنها مسبقا. وزن أنبوب مع مسحوق الأنسجة والأنسجة وتسجيل هذه الأوزان في دفتر المختبر.
  3. احتضان جميع أنابيب الميكروفون 2 مل (مع أغطية مفتوحة) مع 20 ملغ من مسحوق الأنسجة في كتلة الحرارة أو الفرن في 60 درجة مئوية لمدة ساعة واحدة.
  4. بعد الحضانة، عينات باردة لمدة 10 دقائق في درجة حرارة الغرفة (RT).
  5. أضف 1.8 مل من الماء إلى كل أنبوب مجهري واخلطه بواسطة الدوامة. ثم، الطرد المركزي في 25200 × ز (15000 دورة في الدقيقة) لمدة 10 دقائق في RT والتخلص من supernatant(الشكل 2).
  6. إضافة 1.8 مل من البروتين Solubilization العازلة (PSB) (الجدول 1) إلى كل بيليه الاحتفاظ بها ومزيج من دوامة. جهاز طرد مركزي على 25,200 × غرام (15,000 دورة في الدقيقة) لمدة 10 دقائق في RT والتخلص من الناطور.
  7. كرر الخطوة 2.6 مرة أخرى لكل عينة.
  8. أضف 1.8 مل من الماء إلى كل بيليه، واخلطها بواسطة الدوامة، والطرد المركزي عند 25,200 × غرام (15,000 دورة في الدقيقة) لمدة 10 دقائق. بعد الطرد المركزي، حفظ بيليه والتخلص من supernatant.
  9. إلى بيليه الاحتفاظ بها، إضافة 1.8 مل من الميثانول واحتضان في كتلة الحرارة 60 درجة مئوية لمدة 20 دقيقة. ثم، الطرد المركزي في 25200 × ز (15000 دورة في الدقيقة) لمدة 10 دقائق في RT. بعد الطرد المركزي، تجاهل supernatant والاحتفاظ بيليه (الشكل 2).
  10. كرر الخطوة 2.9 مرة أخرى لكل عينة.
  11. الهواء الجاف بيليه في RT أو المضي قدما على الفور عن طريق التجفيف فراغ. فراغ الجافة باستخدام فراغ أكثر جفافا في 30 درجة مئوية لمدة 2 إلى 3 ساعات أو حتى بيليه جافة تماما.
    ملاحظة: يمكن إيقاف التجربة مؤقتا عند هذه النقطة عن طريق تجفيف الهواء خلال الليل أو الاستمرار في التجفيف بالفراغ.
  12. بعد التجفيف، وزن أنابيب العينة مع بيليه المجففة وتسجيل الوزن بجانب وزن أنبوب فارغة كل منها في دفتر المختبر. تقدير وزن بيليه عن طريق طرح القيمتين. سيتم استخدام هذه الأوزان لتقدير اللجنين في نهاية عملية استخراج اللجنين.
  13. عند هذه النقطة من استخراج اللجنين، وتشمل اللجنين الخيزران التجارية لتوليد منحنى مستوى اللجنين. قياس اللجنين الخيزران التجارية في أنابيب منفصلة تتراوح بين 0.5 ملغ إلى 5 ملغ في 0.5 ملغ زيادات (0.5 ملغ, 1 ملغ, 1.5 ملغ, 2 ملغ, 3 ملغ, 3.5 ملغ, 4 ملغ, 4.5 ملغ, و 5.0 ملغ). قياس كل تركيز ثلاث مرات لثلاث نسخ متماثلة التقنية.
    ملاحظة: من الآن فصاعدا، تم معالجة المعايير التي تم قياسها في الخطوة أعلاه بنفس الطريقة التي تم بها تجفيف العينات.

3. علاج بيليه مع TGA وحمض لتسريع اللجنين

  1. موضوع العينات المعالجة من الخطوة المذكورة أعلاه، جنبا إلى جنب مع المعايير المقاسة، إلى TGA (حمض ثيوغليكوليك) العلاج.
  2. إضافة 1 مل من 3 N HCl (الجدول 1) و 100 ميكرولتر من TGA إلى كل بيليه.
  3. دوامة واحتضان في كتلة الحرارة 80 درجة مئوية مسخن لمدة 3 ساعات في غطاء الدخان (الشكل 2).
    ملاحظة: يجب مراقبة خطوة التسخين عند 80 درجة مئوية. قد يؤدي تراكم الضغط العالي إلى فتح الأغطية ويمكن أن يؤدي إلى انسكابات كيميائية. يوصى بأنابيب غطاء المسمار ولكن يمكن وضع حد أقصى لأنابيب 2 مل بشكل فضفاض خلال هذه الخطوة كبديل لمنع مثل هذه الانسكابات.
  4. بعد الحضانة، أنابيب باردة في RT لمدة 10-15 دقيقة والطرد المركزي في 25،200 × ز (15،000 دورة في الدقيقة) لمدة 10 دقائق في RT.
    ملاحظة: يجب فصل النفايات الناتجة عن المذيبات الحمضية والعضوية وتخزينها في حاويات زجاجية ذات قبعات التهوية. استخدام حاويات زجاجية منفصلة لجمع النفايات حمض TGA والنفايات الحمضية.
  5. بعد الطرد المركزي، تجاهل supernatant والاحتفاظ بيليه. أضف 1 مل من الماء، واخلطه بواسطة الدوامة، والطرد المركزي عند 25,200 × غرام (15,000 دورة في الدقيقة) لمدة 10 دقائق في RT.
  6. بعد الطرد المركزي، والتخلص من supernatant وخلط بيليه في 1 N NaOH لمدة 24 ساعة في 37 درجة مئوية شاكر / خلاط الحرارية بسرعة منخفضة (الشكل 2).
    ملاحظة: يمكن تقليل وقت الحضانة هذا إلى ساعةواحدة و7.
  7. بعد الحضانة، تقوم أجهزة الطرد المركزي بأنابيب الميكروفون 2 مل عند 25,200 × ز (15,000 دورة في الدقيقة) لمدة 10 دقائق في RT. احتفظ بالنافورة للخطوة التالية.
    ملاحظة: ينطوي الإجراء على استخدام الأحماض القوية وغيرها من المواد الكيميائية التي تسبب التآكل في الطبيعة. وبالتالي ، ينصح ارتداء معدات الوقاية الشخصية المناسبة طوال عملية تقدير اللجنين. TGA له رائحة كريهة قوية وتآكل في الطبيعة. ومن ثم، فمن المستحسن أن تستخدم فقط في غطاء محرك السيارة الدخان.

4. هطول الأمطار من اللجنين

  1. نقل supernatant إلى أنبوب الميكروفون 2 مل الطازجة وإضافة 200 ميكرولتر من HCl المركزة في حضانة 4 درجة مئوية لمدة 4 ساعات أو بين عشية وضحاها (الشكل 2).
    ملاحظة: يمكن إيقاف عملية الاستخراج مؤقتا عند هذه النقطة عن طريق تمديد خطوة التبريد إلى بين عشية وضحاها.
  2. جهاز الطرد المركزي في 25,200 x g (15,000 دورة في الدقيقة) لمدة 10 دقائق في RT ويذوب بيليه في 1 مل من 1 N NaOH.
  3. احتضان في شاكر في RT لمدة 10 دقيقة لتعليق بيليه تماما في NaOH.
  4. وأخيرا، قياس امتصاص العينات في 280 نانومتر باستخدام مطياف ومقارنتها مع منحنى اللجنين القياسية.
  5. قياس تركيز غير معروف من اللجنين باستخدام قيم خط الانحدار منحنى المعايرة، وامتصاص العينات المستخرجة في 280 نانومتر.

5. إعداد منحنى قياسي وتقدير اللجنين في العينة

  1. معايير اللجنين العملية بنفس الطريقة التي يتم بها استخدام عينات تجريبية من علاج TGA.
  2. قياس معايير اللجنين الخيزران التجارية في 0.5 ملغ زيادات بدءا من 0.5 ملغ, 1 ملغ, 1.5 ملغ, 2 ملغ, 2.5 ملغ, 3.0 ملغ, 3.5 ملغ, 4.0 ملغ, 4.5 ملغ و 5 ملغ. ثم، عملية من قبل TGA، HCl، حل في 1 N NaOH تليها قياس امتصاص في 280 نانومتر(الشكل 3A).
  3. استخدام قيم تركيز اللجنين وقراءات الامتصاص لتوليد قطعة متناثرة من منحنى اللجنين القياسي(الشكل 3B).
  4. استخدم خط الانحدار، y = mx+c المتولد في قطعة الأرض المتناثرة، لتقدير محتوى اللجنين غير المعروف للعينات المعدة باستخدام قيم "x" من متوسط امتصاص العينات المستخرجة عند قيم 280 نانومتر و"م" و"ج" من خط انحدار منحنى اللجنين القياسي.
  5. تقسيم محتوى اللجنين في قيمة ص الناتجة عن ذلك حسب الوزن الإجمالي للفراغ / الهواء المجففة عينة الكتلة الحيوية النباتية بعد استخراج الميثانول في ملغ (حوالي 15 ملغ) للحصول على تركيز اللجنين لكل ملغ. ثم، ضرب هذه القيمة بنسبة 100 لحساب النسبة المئوية لللجنين لكل ملغ.

النتائج

تمت مقارنة خطين تجريبيين مختلفين للقطن للاختلافات في محتويات اللجنين في أنسجة مختلفة. تم قياس محتوى اللجنين المستخرج من كل عينة عند 280 نانومتر وسجل قيم الامتصاص الخاصة به. تمت مقارنة متوسط قيم الامتصاص لكل تكرار بيولوجي مقابل خط الانحدار لمنحنى مستوى اللجنين(الجدول 2،

Discussion

يلعب اللجنين دورا هاما في نمو النباتات وتطويرها وقد تمت دراسته مؤخرا على نطاق واسع لتطبيقات الوقود الحيوي والطاقة الحيوية و المنتجات الحيوية. اللجنين غني بالمركبات العطرية التي يتم تخزينها في جميع جدران الخلايا الثانوية النباتية الوعائية. لديها العديد من التطبيقات الصناعية مثل منتجات ا...

Disclosures

ويعلن صاحبا البلاغ أنه ليس بينهما تضارب في المصالح.

Acknowledgements

نشكر قسم علوم النبات والتربة والقطن على دعمهم الجزئي لهذه الدراسة.

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
BioSpectrophotometer kineticEppendorf kinetic6136000010For measuring absorbance at 280 nm
CentrifugeEppendorf5424For centrifuging  samples
Commercial bamboo ligninAldrich1002171289Used in the preparation of the standard curve
Distilled waterFischer Scientific16690382Used in the protocol
Falcon tubesVWR734-0448Containers for solutions
Freezer millSpex Sample Prep68-701-15For fine grinding of plant tissue samples
Heat block/ Thermal mixerEppendorf13527550For temperature controlled steps during lignin extraction
Hotplate stirrerWalterWP1007-HSUsed for preparation of solutions
Hydrochloric acid (HCL)Sigma221677Used in the protocol
IncubatorFisherbrand150152633For thorough drying of plant tissue samples
Measuring scaleMettler toledo30243386For measuring plant tissue weight, standards and microfuge tubes
Methanol (100 %)Fischer Scientific67-56-1Used in the protocol
Microfuge tubes (2 mL)MicrocentrifugeZ628034-500EAContainers for extraction of lignin
Plant biomass gerinderHanchenAmazonUsed for crushing dried samples
pH meterFisher ScientificAE150Measuring pH for solutions prepared for lignin extraction
Temperature controlled incubator/ovenFisher Scientific15-015-2633Used in the protocol
Thioglycolic acid (TGA)Sigma Aldrich68-11-1Used in the protocol
Vacuum dryerEppendorf22820001Used for drying samples
Vortex mixerEppendorf3340001For proper mixing of samples

References

  1. Freudenberg, K., Neish, A. C. . Constitutionand Biosynthesis of Lignin. , 129 (1968).
  2. Chio, C., Sain, M., Qin, W. Lignin utilization: A review of lignin depolymerization from various aspects. Renewable and Sustainable Energy Reviews. 107, 232-249 (2019).
  3. Sun, Z., Fridrich, B., de Santi, A., Elangovan, S., Barta, K. Bright Side of Lignin Depolymerization: Toward New Platform Chemicals. Chemical Reviews. 118, 614-678 (2018).
  4. Xu, F., Sun, R. C. . Cereal Straw as a Resource for Sustainable Biomaterials and Biofuels. , 9-47 (2010).
  5. Liu, Q., Luo, L., Zheng, L. Lignins: Biosynthesis and Biological Functions in Plants. International Journal of Molecular Sciences. 19, 335 (2018).
  6. Ithal, N., et al. Developmental transcript profiling of cyst nematode feeding cells in soybean roots. Molecular Plant-Microbe Interactions. 20, 510-525 (2007).
  7. Moura, J. C. M. S., et al. Abiotic and Biotic Stresses and Changes in the Lignin Content and Composition in Plants. Journal of Integrative Plant Biology. 52, 360-376 (2010).
  8. Vanholme, R., Morreel, K., Ralph, J., Boerjan, W. Lignin engineering. Current Opinion In Plant Biology. 11, 278-285 (2008).
  9. Lupoi, J. S., Singh, S., Parthasarathi, R., Simmons, B. A., Henry, R. J. Recent innovations in analytical methods for the qualitative and quantitative assessment of lignin. Renewable and Sustainable Energy Reviews. 49, 871-906 (2015).
  10. Mendu, V., et al. Identification and thermochemical analysis of high-lignin feedstocks for biofuel and biochemical production. Biotechnology for Biofuels. 4, 43 (2011).
  11. Shrotri, A., Kobayashi, H., Fukuoka, A., Song, C. . Advances in Catalysis. 60, 59-123 (2017).
  12. Brunow, G. . Biorefineries-Industrial Processes and Products: Status Quo and Future Directions. 2, 151-163 (2008).
  13. Constant, S., et al. New insights into the structure and composition of technical lignins: a comparative characterisation study. Green Chemistry. , (2016).
  14. Shimada, N., Tsuyama, T., Kamei, I. Rapid Determination of Thioglycolic Acid Lignin for Various Biomass Samples. Mokuzai Gakkaishi. 65, 25-32 (2019).
  15. Li, X., Weng, J. K., Chapple, C. Improvement of biomass through lignin modification. The Plant Journal: For Cell and Molecular Biology. 54, 569-581 (2008).
  16. Ponnusamy, V. K., et al. A review on lignin structure, pretreatments, fermentation reactions and biorefinery potential. Bioresource Technology. 271, 462-472 (2019).
  17. Hatfield, R., Fukushima, R. S. Can Lignin Be Accurately Measured. Crop Science. 45, 832-839 (2005).
  18. Bolker, H., Somerville, N. Ultraviolet spectroscopicstudies of lignin in solid state. I. Isolated lignin preparations. Tappi Journal. 72, 826-829 (1962).
  19. Fergus, B. J., Goring, D. A. I. The distribution of lignin in birchwood as determined by ultraviolet microscopy. Holzforschung. 24, 118-124 (1970).
  20. Schultz, T. P., Templeton, M. C., McGinnis, G. D. Rapid determination of lignocellulose by diffuse reflectance Fourier transform infrared spectrometry. Analytical Chemistry. 57, 2867-2869 (1985).
  21. Dence, C. W., Lin, S. Y., Dence, C. W. The Determination of Lignin. Methods in Lignin Chemistry. , (1992).
  22. Adler, E. Lignin chemistry-past, present and future. Wood Science and Technology. 11, 169-218 (1977).
  23. Brinkmann, K., Blaschke, L., Polle, A. Comparison of different methods for lignin determination as a basis for calibration of near-infrared reflectance spectroscopy and implications of lignoproteins. Journal of Chemical Ecology. 28, 2483-2501 (2002).
  24. Pandey, M. P., Kim, C. S. Lignin Depolymerization and Conversion: A Review of Thermochemical Methods. Chemical Engineering & Technology. 34, 29-41 (2011).
  25. Moreira-Vilar, F. C., et al. The acetyl bromide method is faster, simpler and presents best recovery of lignin in different herbaceous tissues than Klason and thioglycolic acid methods. PLoS One. 9, 110000 (2014).
  26. Hatfield, R. D., Grabber, J., Ralph, J., Brei, K. Using the Acetyl Bromide Assay To Determine Lignin Concentrations in Herbaceous Plants: Some Cautionary Notes. Journal of Agricultural and Food Chemistry. 47, 628-632 (1999).
  27. Suzuki, S., et al. High-throughput determination of thioglycolic acid lignin from rice. Plant Biotechnology. 26, 337-340 (2009).
  28. Nakatsubo, F., Tanahashi, M., Higuchi, T. Acidolysis of Bamboo Lignin II : Isolation and Identification of Acidolysis Products. Wood research. 53, 9-18 (1972).
  29. Aro, T., Fatehi, P. Production and Application of Lignosulfonates and Sulfonated Lignin. ChemSusChem. 10, 1861-1877 (2017).
  30. Frei, M. Lignin: Characterization of a Multifaceted Crop Component. The Scientific World Journal. 2013, 436517 (2013).
  31. Lora, J. H., Glasser, W. G. Recent Industrial Applications of Lignin: A Sustainable Alternative to Nonrenewable Materials. Journal of Polymers and the Environment. 10, 39-48 (2002).
  32. Wang, R., Zhou, B., Wang, Z. Study on the Preparation and Application of Lignin-Derived Polycarboxylic Acids. Journal of Chemistry. 2019, 5493745 (2019).
  33. Welker, C. M., et al. Engineering Plant Biomass Lignin Content and Composition for Biofuels and Bioproducts. Energies. 8, 7654-7676 (2015).
  34. Mendu, V., et al. Global bioenergy potential from high-lignin agricultural residue. Proceedings of the National Academy of Sciences. 109, 4014-4019 (2012).
  35. Brinkmann, K., Blaschke, L., Polle, A. Comparison of Different Methods for Lignin Determination as a Basis for Calibration of Near-Infrared Reflectance Spectroscopy and Implications of Lignoproteins. Journal of Chemical Ecology. 28, 2483-2501 (2002).
  36. Moreira-Vilar, F. C., et al. The Acetyl Bromide Method Is Faster, Simpler and Presents Best Recovery of Lignin in Different Herbaceous Tissues than Klason and Thioglycolic Acid Methods. PLoS One. 9, 110000 (2014).
  37. Iwaasa, A. D., Beauchemin, K. A., Acharya, S. N., Buchanan-Smith, J. G. Effect of stage of maturity and growth cycle on shearing force and cell wall chemical constituents of alfalfa stems. Canadian Journal of Animal Science. 76, 321-328 (1996).
  38. Arai-Sanoh, Y., et al. Genotypic Variations in Non-Structural Carbohydrate and Cell-Wall Components of the Stem in Rice, Sorghum, and Sugar Vane. Bioscience, Biotechnology, and Biochemistry. , 1105072478 (2011).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

173

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved