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  • Reimpressões e Permissões

Resumo

Aqui, apresentamos um método TGA modificado para estimativa do teor de lignina na biomassa vegetal herbácea. Este método estima o teor de lignina formando ligações específicas com a lignina e apresenta uma vantagem sobre o método Klason, pois requer uma amostra relativamente pequena para estimativa de conteúdo de lignina.

Resumo

A lignina é um polímero natural que é o segundo polímero mais abundante na Terra depois da celulose. A lignina é depositada principalmente em paredes de células secundárias vegetais e é um heteropolímero aromático composto principalmente por três monolignols com importância industrial significativa. A lignina desempenha um papel importante no crescimento e desenvolvimento das plantas, protege contra estresses bióticos e abióticos e na qualidade da forragem animal, da madeira e dos produtos industriais de lignina. A estimativa precisa do teor de lignina é essencial tanto para a compreensão fundamental da biossíntese de lignina quanto para as aplicações industriais de biomassa. O método de ácido tioglicólico (TGA) é um método altamente confiável de estimar o teor total de lignina na biomassa vegetal. Este método estima o teor de lignina formando thioethers com os grupos de álcool benzílico de lignina, solúveis em condições alcalinas e insolúveis em condições ácidas. O teor total de lignina é estimado usando uma curva padrão gerada a partir de lignina comercial de bambu.

Introdução

A lignina é um dos componentes vitais de suporte de carga das paredes celulares das plantas e o segundo polímero mais abundante na Terra1. Quimicamente, a lignina é um heteropolímero transligado composto por compostos fenólicos complexos de alto peso molecular que formam uma fonte renovável natural de polímeros aromáticos e síntese de biomateriais2,3. Este polímero natural desempenha papéis significativos no crescimento, desenvolvimento, sobrevivência das plantas, suporte mecânico, rigidez da parede celular, transporte de água, transporte mineral, resistência à hospedagem, desenvolvimento de tecidos e órgãos, deposição de energia e proteção contra tensões bióticas e abióticas4,5,6,7. A lignina é composta principalmente por três monolignols diferentes: álcoois coniferyl, sinapyl e p-coumaryl derivados da via propanoide fenil8,9. A quantidade de lignina e a composição dos monômeros variam de acordo com as espécies vegetais, do tipo tecido/órgão e de diferentes estágios de desenvolvimento vegetal10. A lignina é amplamente classificada em madeira macia, madeira e lignina de grama com base na composição de origem e monolignol. A madeira macia é composta principalmente de 95% de álcool coniferyl com 4% p-coumaryl e 1% álcool sinapyl. A madeira de madeira tem álcoois coniferyl e sinapyl em proporções iguais, enquanto a lignina de grama é composta de várias proporções de álcoois coniferyl, sinapyl e p-coumaryl11,12. A composição dos monômeros é crítica, pois determina a força, decomposição e degradação da parede celular, bem como determina a estrutura molecular, ramificação e crosslinking com outros polissacarídeos13,14.

A pesquisa da Lignina está ganhando importância no forrageamento, indústrias têxteis, indústrias de papel e para bioetanol, biocombustível e bioprodutos devido ao seu baixo custo e alta abundância15,16. Vários métodos químicos (por exemplo, brometo de acetil, detergentes ácidos, Klason e oxidação permanganada) juntamente com métodos instrumentais (por exemplo, espectroscopia infravermelha próxima (NIR), espectroscopia de ressonância magnética nuclear (NMR) e espectrofotometria ultravioleta (UV) foram utilizados para quantificação de ligrina9,17. Os métodos de análise da lignina são geralmente classificados com base em radiação eletromagnética, gravimetria e solubilidade. O princípio por trás da estimativa de lignina por radiação eletromagnética foi baseado na propriedade química da lignina pela qual absorve luz em comprimentos de onda específicos. Esses resultados foram estimados com base no princípio de que a lignina tem uma absorção UV mais forte do que os carboidratos. Em 1962, Bolker e Somerville usaram pelotas de cloreto de potássio para estimar o teor de lignina na madeira18. No entanto, este método tem desvantagens na estimativa do conteúdo de lignina de amostras herbáceas devido à presença de compostos fenólicos não-lignina e à ausência de um coeficiente de extinção adequado. Em 1970, Fergus e Goring descobriram que as máximas de absorção de compostos guaiacicl e seringa estavam em 280 nm e 270 nm, o que corrigiu a questão do coeficiente de extinção do método Bolker e Somerville19. Posteriormente, a espectroscopia infravermelha, uma técnica altamente sensível para caracterizar fenólicos, também foi utilizada para a estimativa de lignina com uma pequena quantidade de amostras de biomassa vegetal. Um exemplo dessa tecnologia foi a espectrofotometria de transformação de refletidade difusa Fourier. Este método, no entanto, carece de um padrão adequado semelhante ao método UV20. Mais tarde, o teor de lignina foi estimado por NIRS (espectroscopia infravermelha próxima) e NMR (espectroscopia de ressonância magnética nuclear). Porém, há desvantagens nesses métodos, eles não alteram a estrutura química da lignina, mantendo sua pureza20.

O método gravimétrico Klason é um método analítico direto e mais confiável para a estimativa de lignina de caules lenhosos. A base para a estimativa gravimétrica da lignina é a hidrólise/solubilização de compostos não-lignina e a coleta de lignina insolúvel para gravimetria21. Neste método, os carboidratos são removidos por hidrólise da biomassa com H2SO4 concentrado para extrair resíduo de lignina20,22. O teor de lignina estimado por este método é conhecido como lignina insolúvel ácida ou lignina klason. A aplicação do método Klason depende da espécie vegetal, do tipo de tecido e do tipo de parede celular. A presença de quantidades variáveis de componentes não-ligninas, como taninos, polissacarídeos e proteínas, resulta em diferenças proporcionais na estimativa do teor de lignina ácida insolúvel/solúvel. Assim, o método Klason só é recomendado para a estimativa de lignina de biomassa de alto teor de lignina, como hastes amadeiradas17,23. Métodos de solubilidade como brometo de acetil (AcBr), lignina ácida-insolúvel e ácido tioglicólico (TGA) são métodos mais comumente utilizados para a estimativa do conteúdo de lignina de várias fontes de biomassa vegetal. Kim et al. estabeleceram dois métodos para extração de lignina por solubilização. O primeiro método extrai a lignina como um resíduo insolúvel solubilizando a celulose e a hemiccelulose, enquanto o segundo método separa a lignina na fração solúvel, deixando a celulose e a hemicellulose como o resíduo insolúvel24.

Métodos semelhantes empregados na estimativa de lignina com base na solubilidade são os métodos de ácido tioglicólico (TGA) e brometo de acetil (AcBr)25. Tanto os métodos de TGA quanto de brometo acetil estimam o teor de lignina medindo a absorção da lignina solubilizada a 280 nm; no entanto, o método AcBr degrada xilanas durante o processo de solubilização da lignina e mostra um falso aumento no teor de lignina26. O método de tioglicolato (TGA) é o método mais confiável, pois depende de uma ligação específica com os outros grupos de álcool benzílico de lignina com TGA. A lignina vinculada à TGA é precipitada sob condições ácidas usando HCl, e o teor de lignina é estimado usando sua absorvância em 280 nm27. O método TGA tem vantagens adicionais de modificações menos estruturais, uma forma solúvel de estimativa de lignina, menor interferência de componentes não-ligninas e estimativa precisa de lignina devido à ligação específica com a TGA.

Este método TGA é modificado com base no tipo de amostra de biomassa vegetal usada para a estimativa de teor de lignina. Aqui, modificamos e adaptamos o método rápido TGA de canudos de arroz27 para tecidos de algodão para estimar o teor de lignina. Resumidamente, as amostras de plantas secas em pó foram submetidas a tampão de solubilização de proteínas e extração de metanol para remover proteínas e a fração solúvel do álcool. O resíduo insolúvel de álcool foi tratado com TGA e lignina precipitada em condições ácidas. Foi gerada uma curva padrão de lignina utilizando-se uma lignina comercial de bambu e uma linha de regressão (y = mx+c). O valor "x" utiliza valores médios de absorção de lignina a 280 nm, enquanto os valores "m" e "c" foram inseridos a partir da linha de regressão para calcular a concentração de lignina desconhecida em amostras de biomassa vegetal de algodão. Este método é dividido em cinco fases: 1) preparação de amostras de plantas; 2) lavar as amostras com água e metanol; 3) tratamento da pelota com TGA e ácido para precipitar a lignina; 4) precipitação de lignina; e 5) a preparação padrão da curva e a estimativa de teor de lignina da amostra. As duas primeiras fases são focadas principalmente na preparação do material vegetal, seguidas de extrações de água, PSB (tampão de solubilização de proteínas) e metanol para obtenção do material insolúvel de álcool. Em seguida, foi tratado com TGA (ácido tioglicólico) e HCL para formar um complexo com lignina na terceira fase. No final, o HCL foi usado para precipitar a lignina, que foi dissolvida em hidróxido de sódio para medir sua absorvência em 280 nm28.

Protocolo

1. Preparação de amostras de plantas

  1. Recolher plantas de algodão de dois meses de idade da estufa (Figura 1A).
  2. Vire vasos de plantas suavemente para separar o solo e as raízes com raízes laterais intactas, afrouxando o solo ao redor da planta(Figura 1B).
  3. Lave bem as plantas coletadas em bandejas cheias de água para remover toda a sujeira (para amostras de raiz) (Figura 1C).
  4. Use toalhas de papel para secar tecidos separados de raiz, caule e folha, e rotulá-las(Figura 1D). Ar seco por 2 dias à temperatura ambiente para evitar qualquer contaminação fúngica(Figura 1E).
  5. Transfira tecidos amostrais para recipientes rotulados/folhas de alumínio e incubar em uma incubadora controlada pela temperatura a 49 °C por 7 a 10 dias(Figura 1F).
    NOTA: Temperaturas mais altas podem alterar a estrutura da lignina. Alternativamente, um secador congelado pode ser usado para secar amostras por 1 a 2 dias sem causar alterações químicas na biomassa vegetal.
  6. Use uma lâmina para cortar o tecido seco da incubadora em pedaços de tamanho de 5 mm ou, alternativamente, empregar um moedor de biomassa para moer os tecidos da planta(Figura 1G, Figura 1H).
    NOTA: O moedor/lâmina de biomassa deve ser limpo após cada amostra ter sido cortada/moída.
  7. Transfira o tecido cortado/biomassa aterrado material vegetal em frascos de moagem e moer em pó fino de 1 mm de tamanho usando um moinho de congelador ou moedor criogênico com líquido N2.
  8. Amostras de moagem para três ciclos à taxa de 10 CPS (cada ciclo de 2 min) em um pó uniforme(Figura 1I,1J, 1K).
    NOTA: O experimento pode ser pausado neste momento e as amostras podem ser armazenadas à temperatura ambiente em recipientes herméticos para armazenamento a longo prazo.

2. Lavar amostras com água, PSB e metanol

  1. Meça e regisse o peso de todos os tubos vazios de microfuça de 2 mL usados para estimativa de teor de lignina no caderno de laboratório.
  2. Transfira 20 mg do pó da amostra moída para o tubo pré-pesado. Pese o tubo com tecido e tecido em pó e regista esses pesos no caderno de laboratório.
  3. Incubar todos os tubos de microfuça de 2 mL (com tampas abertas) com 20 mg de pó de tecido em um bloco de calor ou forno a 60 °C por 1 hora.
  4. Após a incubação, amostras frias por 10 minutos em temperatura ambiente (RT).
  5. Adicione 1,8 mL de água a cada tubo de microfuça e misture por vórtice. Em seguida, centrífuga a 25.200 x g (15.000 rpm) por 10 min na RT e descartar o supernante(Figura 2).
  6. Adicione 1,8 mL de tampão de solubilização de proteína (PSB) (Tabela 1) a cada pelota retida e misture por vórtice. Centrifugar a 25.200 x g (15.000 rpm) por 10 min na RT e descartar o supernaspe.
  7. Repita o passo 2.6 novamente para cada amostra.
  8. Adicione 1,8 mL de água a cada pelota, misture por vórtice e centrífuga a 25.200 x g (15.000 rpm) por 10 minutos. Após a centrifugação, salve a pelota e descarte o supernatante.
  9. À pelota retida, adicione 1,8 mL de metanol e incuba em um bloco de calor de 60 °C por 20 min. Em seguida, centrífuga a 25.200 x g (15.000 rpm) por 10 min no RT. Após a centrifugação, descarte o sobrenadante e mantenha a pelota(Figura 2).
  10. Repita o passo 2.9 novamente para cada amostra.
  11. Seque a pelota na RT ou proceda imediatamente pela secagem a vácuo. A vácuo seco usando secador de vácuo a 30 °C por 2 a 3 horas ou até que a pelota esteja completamente seca.
    NOTA: O experimento pode ser pausado neste momento por secagem de ar durante a noite ou continuar secando a vácuo.
  12. Após a secagem, pese tubos de amostra com a pelota seca e regissue o peso ao lado do respectivo peso vazio do tubo no caderno de laboratório. Estime o peso da pelota subtraindo os dois valores. Esses pesos serão utilizados para a estimativa de lignina no final do processo de extração de lignina.
  13. Neste ponto da extração de lignina, incluem a lignina comercial de bambu para geração da curva padrão lignina. Meça a lignina comercial de bambu em tubos separados que variam de 0,5 mg a 5 mgs em incrementos de 0,5 mgs (0,5 mgs, 1 mg, 1,5 mg, 2 mg, 3 mgs, 3,5 mgs, 4 mgs, 4,5 mgs e 5,0 mgs). Meça cada concentração três vezes para três réplicas técnicas.
    NOTA: A partir de agora, as normas medidas na etapa acima foram processadas da mesma forma que as amostras secas.

3. Tratamento de pelota com TGA e ácido para precipitar a lignina

  1. Amostras processadas do sujeito a partir da etapa acima, juntamente com as normas medidas, para o tratamento TGA (ácido tioglicólico).
  2. Adicione 1 mL de 3 N HCl(Tabela 1) e 100 μL de TGA a cada pelota.
  3. Vórtice e incubação em um bloco de calor pré-aquecido de 80 °C por 3 horas em um capô de fumaça(Figura 2).
    NOTA: A etapa de aquecimento a 80 °C deve ser monitorada. O acúmulo de alta pressão pode abrir as tampas e pode levar a derramamentos químicos. Os tubos da tampa do parafuso são recomendados, mas os tubos de 2 mL podem ser frouxamente tampados durante esta etapa como uma alternativa para evitar tais derramamentos.
  4. Após a incubação, tubos frios em RT por 10-15 min e centrífuga a 25.200 x g (15.000 rpm) por 10 min na RT.
    NOTA: Os resíduos gerados a partir de solventes ácidos e orgânicos devem ser separados e armazenados em recipientes de vidro com tampas ventiladas. Use recipientes de vidro separados para a coleta de resíduos ácidos TGA e resíduos ácidos.
  5. Após a centrifugação, descarte o sobrenante e mantenha a pelota. Adicione 1 mL de água, misture por vórtice e centrífuga a 25.200 x g (15.000 rpm) por 10 minutos na RT.
  6. Após a centrifugação, descarte o supernasce e misture a pelota em 1 N NaOH por 24 h a 37 °C de agitador/misturador térmico em baixa velocidade(Figura 2).
    NOTA: Este tempo de incubação pode ser reduzido para 1 hora7.
  7. Após a incubação, centrifugar os tubos de microfuça de 2 mL a 25.200 x g (15.000 rpm) por 10 min na RT. Mantenha o supernascer para a etapa seguinte.
    NOTA: O procedimento envolve o uso de ácidos fortes e outros produtos químicos que sejam corrosivos na natureza. Assim, o uso de EPI adequado é recomendado durante todo o processo de estimativa de lignina. TGA tem um cheiro forte e desagradável e é corrosivo na natureza. Por isso, recomenda-se usar apenas no capô da fumaça.

4. Precipitação de lignina

  1. Transfira o supernante para um tubo de microfuça fresco de 2 mL e adicione 200 μL de HCl concentrado. Incubar a 4 °C por 4 horas ou durante a noite(Figura 2).
    NOTA: O processo de extração pode ser pausado neste momento, estendendo a etapa de refrigeração para durante a noite.
  2. Centrifugar a 25.200 x g (15.000 rpm) por 10 min na RT e dissolver a pelota em 1 mL de 1 N NaOH.
  3. Incubar no shaker na RT por 10 minutos para suspender completamente a pelota em NaOH.
  4. Por fim, meça a absorção de amostras a 280 nm usando um espectrofotômetro e compare com a curva padrão da lignina.
  5. Meça a concentração desconhecida de lignina utilizando os valores da linha de regressão da curva de calibração e absorvências de amostras extraídas a 280 nm.

5. Preparação padrão da curva e estimativa de lignina na amostra

  1. Processe os padrões de lignina da mesma forma que amostras experimentais do tratamento TGA.
  2. Meça as normas comerciais de lignina de bambu em incrementos de 0,5 mg a partir de 0,5 mgs, 1 mg, 1,5 mg, 2,5 mgs, 3,0 mgs, 3,5 mgs, 4,0 mgs, 4,5 mgs e 5 mgs. Em seguida, processo por TGA, HCl, dissolver-se em 1 N NaOH seguido de medição de absorvância a 280 nm(Figura 3A).
  3. Use valores de concentração de lignina e leituras de absorção para gerar um enredo disperso da curva padrão de lignina(Figura 3B).
  4. Utilize a linha de regressão, y = mx+c gerada no parcela dispersa, para a estimativa do conteúdo de lignina desconhecida de amostras preparadas utilizando valores "x" de absorvências médias de amostras extraídas a 280 nm e valores "m" e "c" da linha de regressão da curva padrão da lignina.
  5. Divida o teor de lignina no valor resultante y por peso total da amostra de biomassa vegetal seca a vácuo/ar após a extração de metanol em mg (aproximadamente 15 mg) para obter concentração de lignina por mg. Em seguida, multiplique esse valor por 100 para calcular a porcentagem de lignina por mg.

Resultados

Duas linhas experimentais de algodão diferentes foram comparadas por diferenças em seus teores de lignina em diferentes tecidos. O teor extraído de lignina de cada amostra foi medido em 280 nm e registrou seus respectivos valores de absorção. Os valores médios de absorção de cada réplica biológica foram comparados com a linha de regressão da curva padrão da lignina(Tabela 2, Figura 3C). A linha de regressão, y = mx + c, é utilizada para calcular o conteúdo des...

Discussão

A lignina desempenha um papel significativo no crescimento e desenvolvimento das plantas e recentemente tem sido extensivamente estudada para aplicações de biocombustíveis, bioenergia e bioprodutos. A lignina é rica em compostos aromáticos que são armazenados em todas as paredes de células secundárias de plantas vasculares. Possui diversas aplicações industriais, como produtos de painéis de madeira, bio dispersantes, floculantes, espumas de poliuretano e em resinas de placas de circuito29,

Divulgações

Os autores declaram que não têm conflito de interesses.

Agradecimentos

Agradecemos ao Departamento de Ciência de Plantas & Solos e Cotton Inc. pelo apoio parcial deste estudo.

Materiais

NameCompanyCatalog NumberComments
BioSpectrophotometer kineticEppendorf kinetic6136000010For measuring absorbance at 280 nm
CentrifugeEppendorf5424For centrifuging  samples
Commercial bamboo ligninAldrich1002171289Used in the preparation of the standard curve
Distilled waterFischer Scientific16690382Used in the protocol
Falcon tubesVWR734-0448Containers for solutions
Freezer millSpex Sample Prep68-701-15For fine grinding of plant tissue samples
Heat block/ Thermal mixerEppendorf13527550For temperature controlled steps during lignin extraction
Hotplate stirrerWalterWP1007-HSUsed for preparation of solutions
Hydrochloric acid (HCL)Sigma221677Used in the protocol
IncubatorFisherbrand150152633For thorough drying of plant tissue samples
Measuring scaleMettler toledo30243386For measuring plant tissue weight, standards and microfuge tubes
Methanol (100 %)Fischer Scientific67-56-1Used in the protocol
Microfuge tubes (2 mL)MicrocentrifugeZ628034-500EAContainers for extraction of lignin
Plant biomass gerinderHanchenAmazonUsed for crushing dried samples
pH meterFisher ScientificAE150Measuring pH for solutions prepared for lignin extraction
Temperature controlled incubator/ovenFisher Scientific15-015-2633Used in the protocol
Thioglycolic acid (TGA)Sigma Aldrich68-11-1Used in the protocol
Vacuum dryerEppendorf22820001Used for drying samples
Vortex mixerEppendorf3340001For proper mixing of samples

Referências

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