التحقيق في تكلس الصمام الأبهري عن طريق العزلة وثقافة الخلايا الليمفاوية T باستخدام الخلايا المغذية من معطف بافي المشعع

Summary

في هذه الدراسة، ونحن نصف عملية عزل الخلايا الليمفاوية T من عينات جديدة من الصمامات الأبهري المتكلسة والخطوات التحليلية لاستنساخ الخلايا التائية لتوصيف المجموعات الفرعية الكريات البيض التكيفية باستخدام تحليل تدفق قياس الخلايا.

Abstract

يرتبط مرض الصمام الأبهري الكالسيومي (CAVD)، وهو عملية مرض نشطة تتراوح بين سماكة خفيفة للصمام إلى تكلس شديد، بارتفاع معدل الوفيات، على الرغم من الخيارات العلاجية الجديدة مثل استبدال الصمام الأبهري عبر القسطرة (TAVR).

المسارات الكاملة التي تبدأ مع تكلس الصمام وتؤدي إلى تضيق الأبهر الشديد لا تزال مفهومة جزئيا فقط. من خلال توفير تمثيل وثيق لخلايا الصمام الأبهري في الجسم الحي ، يمكن أن يكون فحص الخلايا الليمفاوية T من أنسجة الصمام الشهوتي طريقة فعالة لتوضيح دورها في تطوير التكلس. بعد الختان الجراحي ، يتم تشريح عينة الصمام الأبهري الطازجة في قطع صغيرة ويتم استزراع الخلايا الليمفاوية T ، واستنساخها ثم تحليلها باستخدام فرز الخلايا المنشطة الفلورية (FACS).

إجراء تلطيخ بسيط ويمكن أيضا أن تكون ثابتة أنابيب ملطخة باستخدام 0.5٪ من paraformaldehyde وتحليلها حتى 15 يوما في وقت لاحق. ويمكن استخدام النتائج الناتجة عن لوحة تلطيخ لتتبع التغيرات في تركيزات الخلايا التائية مع مرور الوقت فيما يتعلق بالتدخل ويمكن بسهولة مواصلة تطويرها لتقييم حالات التنشيط للأنواع الفرعية المحددة من الخلايا التائية ذات الاهتمام. في هذه الدراسة، نظهر عزلة الخلايا التائية، التي أجريت على عينات الصمام الأبهري المتكلسة الطازجة وخطوات تحليل استنساخ الخلايا التائية باستخدام قياس التدفق الخلوي لزيادة فهم دور المناعة التكيفية في الفيزيولوجيا المرضية CAVD.

Introduction

مرض الصمام الأبهري الكالسيومي (CAVD) هو واحد من أكثر اضطرابات صمام القلب شيوعا ، مع تأثير كبير على الرعاية الصحية. ازدادت وتيرة استبدال الصمام الأبهري في السنوات الأخيرة بشكل كبير ومن المتوقع أن تزيد أكثر، بسبب تزايد عدد السكان ^{المسنين1}.

الفيزيولوجيا المرضية الأساسية من CAVD معروفة جزئيا فقط وتقتصر الاستراتيجيات العلاجية الحالية على التدابير المحافظة أو استبدال الصمام الأبهري ، إما من خلال الإجراءات الجراحية أو عن طريق الجلد. حتى الآن، لا يمكن لأي علاج طبي فعال أن يعيق أو يعكس تطور CAVD ويرتبط ارتفاع معدل الوفيات بظهور الأعراض المبكر، ما لم يتم إجراء استبدال الصمام الأبهري (AVR)². في المرضى الذين يعانون من تضيق الأبهر أعراض حادة، تم الإبلاغ عن البقاء على قيد الحياة خالية من الأعراض لمدة 3 سنوات منخفضة حتى 20٪³. يمثل استبدال الصمام الأبهري عبر القسطرة (TAVR) خيارا جديدا ، مما أحدث ثورة في علاج المرضى المعرضين لخطر كبير ، خاصة بين كبار السن ، وخفض بشكل كبير معدل الوفيات ، الذي كان مرتفعا في جوهره في هذه الفئة من السكان ^4،5،6. على الرغم من النتائج الواعدة ل TAVR ، من الضروري إجراء مزيد من الأبحاث لفهم الفيزيولوجيا المرضية CAVD لتحديد الأهداف العلاجية المبكرة ^{الجديدة7،8،9}.

كان يعتقد سابقا أن تكون سلبية, عملية التنكسية, ومن المسلم به الآن CAVD كمرض التقدمية النشطة, تتميز التبديل الظاهري العظمي من الخلايا الخلالية الصمام ^{الأبهري10}. هذا المرض ينطوي على التمعدن التدريجي، والتغيرات الليفية وانخفاض حركية منشورات الصمام الأبهري (التصلب)، والتي تعوق في نهاية المطاف تدفق الدم مما يؤدي إلى تضييق (تضيق) من فتح الصمام ^{الأبهري11}.

يعتبر الالتهاب عملية رئيسية في الفيزيولوجيا المرضية CAVD ، على غرار عملية تصلب الشرايين الوعائية. إصابة البطانية تمكن من ترسب وتراكم أنواع الدهون، وخاصة البروتينات الدهنية المؤأكسدة في الصمام ^{الأبهري12}. تثير هذه البروتينات الدهنية المؤأكسدة استجابة التهابية ، لأنها سامة للخلايا ، مع النشاط الالتهابي الذي يؤدي إلى التمعدن. وقد تم مؤخرا تسليط الضوء على دور المناعة الفطرية والتكيفية في تطوير CAVD وتطور ^المرض13. تم توثيق تنشيط وتوسع التخفي من مجموعات فرعية محددة من خلايا الذاكرة T في المرضى الذين يعانون من CAVD ومنشورات الصمام الأبهري المعدنية ، بحيث يفترض أن العمليات الالتهابية تشارك على الأقل في تطوير CAVD ويفترض في تطور المرض كذلك ¹⁴. في الواقع ، على الرغم من وجود خلايا عرض المستضدات والكواعم في كل من الصمام الصحي والمرض ، فإن وجود الخلايا الليمفاوية T يدل على صمام الأبهر المسن والمرض. هذا التسلل اللمفاوي جنبا إلى جنب مع زيادة في الأوعية الدموية الجديدة و metaplasia هي علامات النسيجية المميزة من ^CAVD15.

نحن نفترض وجود تفاعل بين الخلايا الخلالية الصمام الأبهري وتنشيط الجهاز المناعي، مما قد يؤدي إلى بدء عملية التهابية مزمنة في الصمام الأبهري. يمكن أن يكون فحص الخلايا التائية من أنسجة الصمام الأبهري النتنة طريقة فعالة لتوضيح دورها في تطوير التكلس ، حيث يمكن أن يوفر تمثيلا وثيقا لخلايا الصمام الأبهري في الجسم الحي. في العمل الحالي ، باستخدام أنسجة الصمام الأبهري ، نعزل الخلايا الليمفاوية التائية ، والثقافة واستنساخها ، ونقوم بعد ذلك بتصنيفها باستخدام فرز الخلايا المنشطة بالفلور (FACS). تم استئصال عينات الصمام الأبهري الطازجة من مرضى CAVD الذين تلقوا استبدال الصمام الجراحي للتوضيق الأبهري الشديد. بعد استئصال الجراحية، تم تشريح عينة صمام جديد في قطع صغيرة وزراعة الخلايا التائية، استنساخ ثم تحليلها باستخدام قياس التدفق الخلوي. إجراء تلطيخ بسيط ويمكن إصلاح الأنابيب الملطخة باستخدام 0.5٪ من البارافورمالديهايد وتحليلها حتى 15 يوما في وقت لاحق. يمكن استخدام البيانات الناتجة من لوحة التلطيخ لتتبع التغيرات في توزيع الخلايا الليمفاوية T بمرور الوقت فيما يتعلق بالتدخل ويمكن تطويرها بسهولة لتقييم حالات التنشيط للمجموعات الفرعية المحددة من الخلايا التائية ذات الاهتمام.

يمكن أن يكون استخراج الأنسجة المتكلسة وعزل الكريات البيض عن الأنسجة المتكلسة وخاصة استخدام قياس التدفق الخلوي على هذا النوع من الأنسجة أمرا صعبا ، بسبب مشكلات مثل الفلورة الذاتية. ولا توجد سوى منشورات قليلة مع بروتوكولات لهذا الغرض المحدد16,17,18. هنا نقدم بروتوكول مصمم خصيصا لعزل مباشرة والثقافة من الخلايا الليمفاوية T من عينات الصمام الأبهري البشري. التوسع الكلوني للخلايا الليمفاوية هو السمة المميزة للحصانة التكيفية. دراسة هذه العملية في المختبر يوفر معلومات ثاقبة على مستوى التغايرية الخلايا ^{الليمفاوية19}. وبعد فترة حضانة مدتها ثلاثة أسابيع، أصبحت استنساخات الخلايا التائية جاهزة للتنضح، حيث تم الحصول على كمية كافية من الخلايا التائية من كل استنساخ، وذلك للسماح بإجراء دراسة فينوتبيك ووظيفية. في وقت لاحق يتم دراسة النمط الظاهري من استنساخ تي عن طريق قياس الخلايا.

هذا البروتوكول المناعي هو تكييف لطريقة سبق أن طورتها أميدي وآخرون لعزل الخلايا التائية وتوصيفها من الأنسجة البشرية ، والمصممة خصيصا للأنسجة البشرية المتكلسة ، كما هو الحال في ^{CAVD20،21،22}. البروتوكول هنا لعزل PBMCs (خلايا الدم المحيطية أحادية النووية) باستخدام معطف برتقالي مشع يصف طريقة فعالة للحصول على الخلايا المغذية (FC)، تعديلها خصيصا لمرحلة استنساخ الخلايا الليمفاوية T معزولة عن الخلايا الخلالية صمام. تتكون الطبقة المغذية من الخلايا الموقوفة للنمو ، والتي لا تزال قابلة للحياة وحيوية. دور الخلايا المغذية مهم لدعم البقاء على قيد الحياة في المختبر ونمو الخلايا الليمفاوية T معزولة عن الخلايا الخلالية ^صمام23. من أجل تجنب انتشار الخلايا المغذية في الثقافة، يجب أن تخضع هذه الخلايا لوقف النمو. ويمكن تحقيق ذلك بطريقتين: من خلال الطرق الفيزيائية مثل التشعيع، أو من خلال العلاج بالمواد الكيميائية السامة للخلايا، مثل الميتوميسين C (MMC)، وهو مضاد حيوي مضاد للورم يمكن تطبيقه مباشرة على سطح ^{الثقافة24}. هنا نظهر تغذية خلية النمو اعتقال يتحقق من خلال تشعيع الخلية.

تقدم هذه الطريقة طريقة فعالة وفعالة من حيث التكلفة لعزل وتوصيف الخلايا التائية من أنسجة الصمام الأبهري ، مما يساهم في توسيع نطاق الطرق المناعية لاستكشاف الفيزيولوجيا المرضية CAVD.

Protocol

وقد أجريت الدراسة وفقا للنظام الأساسي للهيئة الخيرية لضمان الممارسة العلمية الجيدة، كما تم احترام المبادئ التوجيهية والأحكام القانونية المتعلقة بالخصوصية والأخلاق. ووافقت لجنة الأخلاقيات على جميع التجارب البشرية، وتم الحفاظ على خصوصية المرضى وعدم الكشف عن هويتهم وفقا للقواعد المبلغ عنها في نموذج الأخلاقيات.

ملاحظة: للبروتوكول المذكور أدناه تم استخدام عينات صمام النتنة البشرية الطازجة.

1. إعداد الكاشف

1. إعداد المتوسطة RPMI المخصب كاملة بإضافة في RPMI 1640 المتوسطة: الأحماض الأمينية غير الأساسية; الصوديوم بيروفات، L- الجلوتامين، ß-ميركابتوثانول وبينيسلين-ستريبتوميسين (القلم / ستريب). فلتر قبل الاستخدام. يخزن عند +4 درجة مئوية ويستخدم في غضون شهرين.
2. إعداد وسيطة زراعة الخلايا (CCM) لمرحلة الاستنساخ باستخدام RPMI 1640 المخصب المتوسط الكامل المضافة الحرارة المعطلة مصل البقر الجنيني (FBS)، HB المتوسط القاعدي، 50 U من إنترلوكين 2 (IL-2) والمصل البشري (HS). تصفية واستخدامها في غضون يوم. لا تخزن.
3. إعداد وسيطة ثقافة الخلية لمرحلة إعادة التغذية باستخدام وسيط RPMI 1640 الكامل الغني مع إضافة FBS وBB المتوسط القاعدي و30 U من IL-2 وHS. تصفية واستخدامها في غضون يوم. لا تخزن.
4. قم بإعداد المخزن المؤقت للغسيل الذي يحتوي على 250 مل من RPMI و5 مل من القلم/العقدية. يخزن عند +4 درجة مئوية، ويستخدم في غضون شهرين.

2. عزل الخلايا الليمفاوية T الإنسان والثقافة في قوارير T-25

1. ضع عينة الصمام النتنة في طبق بيتري معقم مليء بحاجز الغسيل، مع ضمان تغطية عينة الصمام بأكملها به. دعك تقف لمدة 15 دقيقة.
2. قطع الصمام النتنطي في قطع صغيرة باستخدام مشرط والسماح لها الوقوف مرة أخرى لمدة 10 دقائق.
3. إعداد وسيطة ثقافة الخلية مع 50 U من IL-2، كما هو موضح سابقا، وتصفية ذلك.
4. إضافة CCM داخل قوارير T25 واستخدام plier البلاستيك العقيمة، ووضع قطع صمام داخل القوارير.
5. تخزين قوارير في وضع عمودي داخل حاضنة ثاني _أكسيد الكربون لمدة أسبوع واحد، مع الحرص على مراقبة حالة القارورة تحت المجهر. وينبغي أن تكون استنساخات الخلايا التائية مرئية بعد ثلاثة أيام تقريبا من خطوة الثقافة؛ لمراقبة أفضل فإنه من المستحسن لوضع قوارير في وضع أفقي لمدة 20 دقيقة قبل التحليل المجهري.
   ملاحظة: تعتمد كمية وسيطة زراعة الخلية على مقدار العينة الموجودة وعلى عدد قوارير T25 التي سيتم استخدامها. وبالنظر إلى أن كل قطعة من صمام يتطلب 10 مل من CCM داخل قارورة، 25 مل من CCM في قارورة T25 مناسب ل3 قطع من صمام.

3. مرحلة الاستنساخ

ملاحظة: بالنسبة لمرحلة الاستنساخ للخلايا التائية، من الضروري البدء بعزل الخلايا المغذية من معطف برتقالي مشع (BC)، باتباع بروتوكول PBMCs.

1. افتح كيس BC تحت غطاء تدفق صفح باستخدام ارتفاع الحقيبة مع صمام خال من الإبر ونقل 50 مل من الدم في قارورة T150. إضافة 70 مل من برنامج تلفزيوني لتخفيف الدم داخل القارورة.
2. تأخذ أربعة أنابيب مخروطية 50 مل ووضع 20 مل من متوسط التدرج الكثافة في كل وطبقة بعناية 30 مل من الدم أكثر من ذلك.
3. جهاز طرد مركزي لمدة 25 دقيقة عند 800 × ز و 20 درجة مئوية مع إيقاف تشغيل الفرامل.
4. يستنشق بعناية supernatant والتخلص منه كنفايات. جمع حلقة PBMCs في أنبوب مخروطي 50ml جديدة إضافة داخل حل برنامج تلفزيوني تصل إلى حجم 50ml.
5. جهاز طرد مركزي لمدة 10 دقائق عند 400 × ز و 20 درجة مئوية.
6. تجاهل supernatant وتعليق بيليه بإضافة داخل حل برنامج تلفزيوني يصل إلى حجم 50 مل. كرر مرحلة الطرد المركزي لمدة 10 دقائق عند 400 × ز و 20 درجة مئوية.
7. تجاهل supernatant وتعليق FCs في 10 مل من الخلايا ثقافة المتوسطة.
8. تأخذ أنبوب جمع جديدة وتمييع FCs مع برنامج تلفزيوني 1:10 بإضافة داخل 9.9 مل من برنامج تلفزيوني و 100 ميكرولتر من أنبوب مع FCs وخلية ثقافة المتوسطة. شطف جيدا مع ماصة واتخاذ 7 ميكرولتر من هذا التخفيف والعد الخلايا تحت المجهر.
9. إعداد وسيطة زراعة الخلايا لمرحلة الاستنساخ: 70 مل مع 50 U من IL-2، ومن ثم تقسيمها إلى أنبوبين مخروطيين سعة كل منهما 50 مل، وسيحتوي كل أنبوب على 25 مل من متوسط زراعة الخلايا، كما هو موضح أدناه:
   • أنبوب 1: 25 مل من CCM + FCs + 0.6٪ من phytohemagglutinin (PHA)
   • أنبوب 2: 25 مل من CCM + T الخلايا الليمفاوية
     ملاحظة: الهدف من طريقة PMBCs هو الحصول على 2 × ¹⁰⁶ خلايا لكل مل، لذلك يجب حساب 25 مل من CCM المعدة (الأنبوب 1) وفقا لذلك. الصيغة العامة المستخدمة هي: عدد الخلايا المحصاة × ¹⁰⁶: 1 مل = CCM × ¹⁰⁶: X

4. T الخلايا الليمفاوية الثقافة في لوحات متعددةويل

1. باستخدام ماصة الإلكترونية، وجمع كل وسيلة ثقافة الخلية داخل قوارير ونقله إلى أنبوب مخروطي 50 مل. يمكن رمي القوارير الفارغة بعيدا.
2. بيليه الخلايا عن طريق الطرد المركزي لمدة 10 دقيقة في 400 × ز و 20 درجة مئوية.
3. تجاهل supernatant، تعليق بيليه في 50 مل من برنامج تلفزيوني وجمع الخلايا عن طريق الطرد المركزي لمدة 10 دقيقة في 400 × ز و 20 درجة مئوية. كرر هذه الخطوة مرتين.
4. تجاهل supernatant وتعليق بيليه في 1 مل من CCM. خذ 7 ميكرولتر من هذا التخفيف واحسب الخلايا تحت المجهر.
   ملاحظة: يجب ضرب عدد الخلايا التي تم عدها لحجم الغرفة وللتخفيف المطبق.
5. المضي قدما لتخفيف الخلايا التي تم عدها من ¹⁰⁵ إلى ¹⁰³ في خلية الثقافة المتوسطة ومن ثم اتخاذ 500 ميكرولتر من ¹⁰³ ووضعها داخل الأنبوب 2.
6. صب 25 مل خلية الثقافة المتوسطة من أنبوب 1 داخل 100 ملم × 15 ملم طبق بيتري البلاستيك.
7. اتخاذ أربعة لوحات متعددة الآبار 96-U أسفل واستخدام ماصة متعددة القنوات تعيين إلى 100 ميكرولتر FCs البذور في كل بئر.
8. خذ الأنبوب 2 وصب وسط ثقافة الخلية داخل طبق بيتري. باستخدام ماصة متعددة القنوات تعيين إلى 100 ميكرولتر، البذور الخلايا التائية في كل بئر.
9. تخزين لوحات متعددة بويل داخل حاضنة ثاني _أكسيد الكربون لمدة أسبوع واحد.

5. مرحلة إعادة التغذية الأولى

1. باستخدام حقيبة معطف برتقالي مشع، اتبع طريقة PBMCs للحصول على مركبات الكربون الهيدروفلورية كما هو موضح في الطريقة السابقة.
2. إعداد كمية مناسبة من CCM دون PHA وتصفيته.
3. باستخدام ماصة متعددة القنوات، قم بإزالة 100 ميكرولتر من كل بئر، مع ضمان عدم لمس الجزء السفلي من البئر.
4. إضافة 100 ميكرولتر من FCs في جميع الآبار كطبقة تغذية لتوفير المواد الغذائية ثقافة الخلية وتغيير المتوسط.
   ملاحظة: لكل متعددة الميزات ينصح بالنظر في 6 مل من CCM، وبالتالي فإن الكمية الموصى بها ل4 multiwells حوالي 30 مل. PHA (0.4٪ من إجمالي كمية CCM) يحتاج إلى إضافته إلى CCM مرة واحدة كل أسبوعين.

6. مرحلة إعادة التغذية الثانية

1. كرر مرحلة إعادة التغذية بعد المقطع الموضح أعلاه. 0.4٪ PHA يحتاج إلى إضافته إلى وسيط ثقافة الخلية.

7. مرحلة التقسيم الأولى من بئر/عينة واحدة إلى بئرين/عينة

1. تحقق من جميع الآبار الأربعة تحت المجهر وامضي قدما في تقسيم تلك الآبار مع استنساخ الخلايا التائية (TCCs).
2. اتبع بروتوكول PBMCs لعزل الخلايا المغذية من كيس معطف برتقالي مشع.
3. إعداد الوسط ثقافة الخلية مع 30 U من IL-2. إضافة FCs واتخاذ لوحة جديدة متعددة الآبار 96 جيدا مع أسفل يو.
4. باستخدام ماصة تعيين إلى 100 ميكرولتر، شطف جيدا داخل آبار العينات المختارة وتقسيم 200 ميكرولتر من حجم الواردة في كل بئر إلى بئرين جديدة من لوحة متعددة الآبار الجديدة، من أجل أن يكون 100 ميكروغرام من حجم لكل بئر من الآبار الجديدة 2.
5. إضافة 100 ميكرولتر من FCs داخل جميع الآبار الجديدة. يجب أن يحتوي كل بئر على حجم إجمالي قدره 200 ميكرولتر.
6. تعيين ماصة في 100 ميكرولتر وإضافة 100 ميكرولتر في بئرين إضافية، تحتوي على FCs فقط لتكون بمثابة عنصر تحكم.
   ملاحظة: استخدم المجهر الخفيف لمراقبة جميع لوحات متعددة الآبار من أجل تحديد الآبار التي نمت بنجاح TCC. لجعل اختيار المستنسخين أسهل ، يمكن إجراء مقارنة مع عنصر التحكم (البئران اللذين يحتويان على FCs فقط) ، مع ظهور المستنسخ أكثر قتامة وأكبر مقارنة بالتحكم. الآبار التي سيتم اختيارها هي تلك التي لديها استنساخ كبير وواضح وجولي ، مع الخلايا الليمفاوية معبأة بكثافة معا. إذا لم تكن هناك أية مراكز إعادة تغذية بعد أسبوعين من إعادة التغذية، فمن المستحسن الانتظار أسبوعا إضافيا وإجراء مرحلة إعادة تغذية إضافية.

8. مرحلة التقسيم الثانية من بئرين/عينة إلى 4 آبار/عينة

1. تعيين ماصة إلى 100 ميكرولتر، شطف جيدا داخل بئرين من كل عينة والبذور بئرين جديدة من 100 ميكرولتر لكل واحد.
2. إعداد الوسط ثقافة الخلية مع 30 U من IL-2 واتبع تقنية PBMCs لاستخراج FCs من حقيبة معطف بافي ووضع FCs داخل CCM.
3. تعيين ماصة إلى 100 ميكرولتر والبذور FCs في جميع الآبار. تخزين الحيوانات المتعددة في حاضنة ثاني _أكسيد الكربون لمدة أسبوع واحد.

9. مرحلة التقسيم الثالث من 4 آبار / عينة إلى 8 آبار / عينة:

1. باستخدام ماصة متعددة القنوات تعيين إلى 100 ميكرولتر، شطف جيدا داخل جميع الآبار الأربعة من كل عينة والبذور 100 ميكرولتر في كل من الآبار الأربعة الجديدة في لوحة جديدة 96 جيدا.
2. إعداد الخلايا ثقافة المتوسطة واتبع تقنية PBMCs لاستخراج FCs من كيس معطف برتقالي مشع.
3. ضع FCs داخل CCM. تعيين ماصة إلى 100 ميكرولتر والبذور FCs في جميع الآبار. تخزين الفيتامينات المتعددة في حاضنة ثاني _أكسيد الكربون لمدة أسبوع واحد

10. تحليل القياسات الخلوية

1. خذ لوحة متعددة العينات مع أقدم تاريخ من حاضنة ثاني _أكسيد الكربون وحدد أنابيب التجميع مع أرقام العينة لتحليلها.
2. باستخدام ماصة متعددة القنوات تعيين إلى 200 ميكرولتر مع 2 نصائح، شطف جيدا داخل بئرين من نفس العينة ووضع كل من داخل أنبوب جمع نفسه. كرر هذه الخطوة لكافة العينات.
   ملاحظة: لن يتم تحليل عينات FCs، كما أنها تعمل فقط كعناصر تحكم.

11. الأجسام المضادة تلطيخ لوحة التحضير لتحليل السيتوفلوريومتري

1. أضف 1 مل من محلول PBS لكل أنبوب وطارد مركزي لمدة 10 دقائق عند 400 × ز و 20 درجة مئوية.
2. بعد مرحلة الطرد المركزي التخلص من supernatant.
   ملاحظة: يمكن العثور على لوحة تلطيخ الأجسام المضادة في الجدول 1. كل تركيز الأجسام المضادة واحد محسوبة حوالي 2 ميكرولتر / عينة. فمن المستحسن أن تدور لفترة وجيزة أنابيب الأجسام المضادة قبل الاستخدام. لحماية الأجسام المضادة المترافقة مع الفلوروفوري من الضوء ، يجب تنفيذ جميع الخطوات في الظلام.
3. إعداد مزيج الأجسام المضادة داخل أنبوب 1.5 مل ودوامة ذلك.
4. إضافة الأجسام المضادة داخل العينات وترك عينات لاحتضان في الظلام في درجة حرارة الغرفة لمدة 15 دقيقة.
5. أضف 1 مل من برنامج تلفزيوني في كل عينة وأجهزة الطرد المركزي لمدة 10 دقائق عند 400 × ز و 20 درجة مئوية.
6. تجاهل supernatant وتعليق بيليه مع 500 ميكرولتر من محلول برنامج تلفزيوني.
7. 10 - المضي قدما في تحليل القياسات الخلوية (تحليل المركبات الهيدروفلورية، الجدول 1).
   ملاحظة: يمكن إصلاح العينات الملطخة باستخدام 0.5٪ بارافورمالديهايد (PFA) المخفف في حل PBS وتحليلها حتى 15 يوما في وقت لاحق.
   تنبيه: PFA سام ويجب التعامل معه بعناية.

علامه	فلوروفور
CD3	PE/Cy7
CD4	أليكسا فلور 488
CD8	البنفسجي الرائعة 510
CD14	البنفسجي الرائعة 421
CD25	PE
CD45	البنفسجي الرائعة 711

الجدول 1 - الجداول لوحة تلطيخ الأجسام المضادة للكشف عن السكان T الخلايا الليمفاوية في مرض الصمام الأبهري تكلس.

النتائج

استخدمنا طريقة بسيطة وفعالة من حيث التكلفة لتوصيف مجموعة الكريات البيض من عينات الصمام الأبهري الطازجة المستمدة من المرضى البشريين الذين يعانون من تضيق الصمام الأبهري الشديد (الرجوع إلى البروتوكول). 10- تعتبر طريقة عزل مركبات ثنائي الفينيل متعدد الكلور خطوة حيوية في الحصول على الخلايا ال?...

Discussion

هنا نقدم طريقة لتوصيف الخلايا الليمفاوية T الخلايا الفرعية معزولة عن عينات الصمام الأبهري النتنة، وذلك باستخدام قياس التدفق الخلوي. تتطلب هذه الطريقة استخدام معطف برتقالي مشع لعزل PBMCs. تردد الإشعاع الذي يجب أن تتعرض أكياس معطف بافي هو 9000 راد /90 غراي (Gy) ويمثل خطوة حاسمة لوقف انتشار الخلايا ?...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
50 mL plastic syringes	Fisherbrand	9000701
96- well U- bottom Multiwell plates	Greiner Bio-One	10638441
Bag Spike (needle free)	Sigma	P6148	Dilute to 4% with PBS
CD14 Brilliant violet 421	Biolegend	560349
CD25 PE	Biolegend	302621
CD3 PE/Cy7	Biolegend	300316
CD4 Alexa Fluor 488	Biolegend	317419
CD45 Brilliant violet 711	Biolegend	304137
CD8 Brilliant violet 510	Biolegend	301047
Eppendorf tube 1.5 mL	Eppendorf	13094697
Eppendorf tube 0.5 mL	Thermo Scientific	AB0533
Falcon 15 mL conical centrifuge tube	Falcon	10136120
Falcon 50 mL conical centrifuge tubes	Falcon	10788561
Falcon Round-Bottom Polystyrene Tubes	BD	2300E
Fast read 102 plastic counting chamber	KOVA INTERNATIONAL	630-1893
Filters for culture medium 250 mL	NalgeneThermo Fisher Scientific	168-0045
Filters for culture medium 500 mL	NalgeneThermo Fisher Scientific	166-0045
HB 101 Lyophilized Supplement	Irvine Scientific	T151
HB Basal Medium	Irvine Scientific	T000
Heat-Inactivated FBS (Fetal Bovine Serum)	Euroclone	ECS0180L
HS (Human serum)	Sigma Aldrich	H3667
Human IL-2 IS	Miltenyi Biotec	130-097-744
L-Glutamine	Gibco	11140050
Lymphoprep	Falcon	352057
Non-essential amino acids solution	Sigma	11082132001
Paraformaldehyde	Thermo Fisher Scientific	10538931
PBS (Phosphate-buffered saline)	Thermo Fisher Scientific	10010023
Penicillin/Streptomycin	Gibco	15070063	10000 U/mL
PHA (phytohemagglutinin)	Stem Cell Technologies	7811
Plastic Petri dishes	Thermo Scientific	R80115TS	10 0mm x 15 mm
RPMI 1640 Media	HyClone	15-040-CV
Sodium pyruvate	Gibco by Life technologies	11360070
Syringe Filters 0,45µl	Rotilabo-Spritzenfilter	P667.1
T-25 Cell culture flasks	InvitrogenThermo Fisher Scientific	AM9625
T-75 Cell culture flask	Thermo Fisher Scientific	10232771
β- Mercaptoethanol	Gibco	A2916801