Işınlanmış Buffy Coat'dan Besleyici Hücreler Kullanılarak T Lenfositlerin İzolasyonu ve Kültürü Yoluyla Aort Kapak Kireçlenmesinin Araştırılması

Özet

Bu çalışmada, akış sitometrisi analizi kullanılarak adaptif lökosit alt kümelerinin karakterizasyonu için taze kireçlenmiş aort kapakçıkları örneklerinden T lenfosit izolasyonu sürecini ve T hücre klonlama analitik adımlarını açıklarız.

Özet

Kapakçığın hafif kalınlaşmasından şiddetli kireçlenmeye kadar uzanan aktif bir hastalık süreci olan kalsfik aort kapak hastalığı (CAVD), transktheter aort kapak replasmanı (TAVR) gibi yeni terapötik seçeneklere rağmen yüksek mortalite ile ilişkilidir.

Kapak kireçlenmesi ile başlayan ve şiddetli aort darlığı ile yol açan tüm yollar sadece kısmen anlaşılmaktadır. Aort kapak hücrelerinin in vivo olarak yakından temsil edilmesini sağlayarak, T lenfositlerinin stenotik kapak dokusundan test edilmesi, kireçlenme gelişimindeki rollerini netleştirmenin etkili bir yolu olabilir. Cerrahi eksizyondan sonra, taze aort kapak örneği küçük parçalar halinde parçalara ayrılır ve T lenfositleri kültürlenir, klonlanır ve floresan aktif hücre sıralama (FACS) kullanılarak analiz edilir.

Boyama işlemi basittir ve lekeli tüpler paraformaldehitin% 0.5'i kullanılarak sabitlenebilir ve 15 gün sonrasına kadar analiz edilebilir. Boyama panelinden elde edilen sonuçlar, müdahale ile ilgili olarak zaman içinde T hücre konsantrasyonlarındaki değişiklikleri izlemek için kullanılabilir ve belirli T hücresi alt türlerinin aktivasyon durumlarını değerlendirmek için kolayca geliştirilebilir. Bu çalışmada, CAVD patofizyolojisinde adaptif bağışıklığın rolünü daha iyi anlamak için taze kireçlenmiş aort kapak örnekleri üzerinde gerçekleştirilen T hücrelerinin izolasyonunu ve akış sitometrisi kullanarak T hücre klonlarının analiz edilmesinin adımlarını gösteriyoruz.

Giriş

Kalsfik aort kapak hastalığı (CAVD), sağlık hizmetleri üzerinde ağır bir etkisi olan en yaygın kalp kapak hastalıklarından biridir. Son yıllarda aort kapak değişimi sıklığı önemli ölçüde artmıştır ve artan yaşlı nüfus nedeniyle daha da artması ^{beklanmaktadır1}.

CAVD'nin alttaki patofizyolojisi sadece kısmen bilinmektedir ve mevcut terapötik stratejiler cerrahi veya perkütan prosedürler yoluyla konservatif önlemler veya aort kapak değişimi ile sınırlıdır. Bugüne kadar, aort kapak değişimi (AVR) yapılmadıkça, etkili hiçbir tıbbi tedavi CAVD ilerlemesini engelleyemez veya tersine çeviremez ve yüksek mortalite erken semptom başlangıcı ile ^{ilişkilidir2}. Şiddetli semptomatik aort darlığı olan hastalarda 3 yıllık semptomsuz sağkalım %20 ³ gibi düşük bir oranın olduğu bildirilmiştir. Transktheter aort kapak replasmanı (TAVR), özellikle yaşlılar arasında yüksek riskli hastalar için tedavide devrim yapan ve bu popülasyonda özünde yüksek olan mortaliteyi önemli ölçüde azaltan yeni bir seçeneği temsil ^eder4,5,6. TAVR'ın umut verici sonuçlarına rağmen, yeni erken terapötik hedefleri belirlemek için CAVD patofizyolojisini anlamak için daha fazla araştırma yapılması gerekmektedir7,8,9.

Daha önce pasif, dejeneratif bir süreç olduğu düşünülen CAVD, şimdi aort kapak interstisyel hücrelerinin osteoblastik fenotip anahtarı ile karakterize aktif bir ilerleyici hastalık olarak kabul ^{edilmektedir10}. Bu hastalık progresif mineralizasyon, fibrokalsifik değişiklikler ve aort kapaklarının (skleroz) azlığı içerir, bu da sonuçta aort kapak açıklığının daralmasına (darlığına) yol açan kan akışını ^engeller11.

İnflamasyon, vasküler ateroskleroz sürecine benzer şekilde CAVD patofizyolojisinde önemli bir süreç olarak kabul edilir. Endotel yaralanması lipid türlerinin, özellikle de aort kapakçığında oksitlenmiş lipoproteinlerin birikmesini ve birikmesini ^sağlar12. Bu oksitlenmiş lipoproteinler, mineralizasyona yol açan enflamatuar aktivite ile sitotoksik oldukları için enflamatuar bir tepkiye neden olan bir inflamatuar yanıta nedendir. CAVD gelişiminde ve hastalığın ilerlemesinde doğuştan gelen ve adaptif bağışıklığın rolü son zamanlarda ^{vurgulanmıştır13}. Bellek T hücrelerinin belirli alt kümelerinin aktivasyonu ve klonal genişlemesi CAVD ve mineralize aort kapak broşürleri olan hastalarda belgelenmiştir, böylece enflamatuar süreçlerin en azından CAVD gelişiminde ve muhtemelen hastalığın ilerlemesinde rol aldığı ^{varsayılmıştır14}. Aslında, hem sağlıklı hem de hastalıklı kapakta antijen sunan hücreler ve makrofajlar mevcut olmasına rağmen, T lenfositlerinin varlığı yaşlı ve hastalıklı bir aort kapakçığının göstergesidir. Bu lenfositik infiltrat, neovaskülarizasyon ve metaplazideki artışla birlikte ^CAVD15'in karakteristik histolojik belirtileridir.

Aort kapak kesişim hücreleri ile bağışıklık sisteminin aktivasyonu arasında bir etkileşimin varlığını hipotez ediyoruz, bu da aort kapakta kronik bir enflamatuar sürecin başlatılmasını potansiyel olarak tetikliyor. T hücrelerinin stenotik aort kapak dokusundan test edilmesi, aort kapak hücrelerinin in vivo olarak yakından temsil edilmesini sağlayabildiğinden, kireçlenme gelişimindeki rollerini netleştirmenin etkili bir yolu olabilir. Mevcut çalışmada, aort kapak dokusunu kullanarak, T-lenfositleri izole ediyoruz, kültürlüyoruz ve klonlıyoruz ve daha sonra floresanla aktive edilmiş hücre sıralamasını (FACS) kullanarak karakterize ediyoruz. Şiddetli aort darlığı için cerrahi kapak değişimi alan CAVD hastalarından taze aort kapak örnekleri çıkarıldı. Cerrahi eksizyondan sonra, taze kapak örneği küçük parçalar halinde parçalandı ve T hücreleri kültürlendi, klonlandı ve akış sitometrisi kullanılarak analiz edildi. Boyama işlemi basittir ve lekeli tüpler paraformaldehitin% 0.5'i kullanılarak sabitlenebilir ve 15 gün sonrasına kadar analiz edilebilir. Boyama panelinden oluşturulan veriler, müdahale ile ilgili olarak zaman içinde T lenfosit dağılımındaki değişiklikleri izlemek için kullanılabilir ve belirli T hücresi alt kümelerinin aktivasyon durumlarını değerlendirmek için kolayca geliştirilebilir.

Kireçlenmiş dokunun çıkarılması, lökositlerin kireçlenmiş dokudan izolasyonu ve özellikle bu tür dokularda akış sitometrisinin kullanılması, otoflüoresans gibi sorunlar nedeniyle zor olabilir. Bu özel amaç için protokollerle çok az yayın var16,17,18. Burada, insan aort kapak örneklerinden T lenfositin doğrudan izolasyonu ve kültürü için özel olarak tasarlanmış bir protokol sunuyoruz. Lenfositlerin klonal genişlemesi adaptif bağışıklığın ayırt edici bir özelliğidir. Bu sürecin in vitro olarak incelenmesi lenfosit heterojenliği seviyesi hakkında içgörülü bilgiler ^sağlar19. Üç haftalık bir kuluçka süresinden sonra, fenotipik ve fonksiyonel çalışmaya izin vermek için her klondan yeterli miktarda T hücresi elde edildiği için T hücre klonları ekilmeye hazırdır. Daha sonra T klonlarının fenotipi sitoflorometri ile incelenir.

Bu immünolojik protokol, amedei ve arkadaşları tarafından daha önce T hücre izolasyonu ve insan dokusundan karakterizasyon için geliştirilen, özellikle ^CAVD20,21,22 gibi kireçlenmiş insan dokusu için tasarlanmış bir yöntemin adaptasyonudur^. Işınlanmış buffy coat kullanılarak PBMC'lerin (periferik kan mononükleer hücreleri) izolasyonu için buradaki protokol, kapak geçiş hücrelerinden izole edilen T lenfositlerinin klonlama aşaması için özel olarak ayarlanmış besleyici hücreler (FC) elde etmenin etkili bir yolunu açıklar. Besleyici tabaka, hala canlı ve biyoaktif olan büyüme tutuklanığı hücrelerinden oluşur. Besleyici hücrelerin rolü, kapak geçiş hücrelerinden izole edilmiş T lenfositlerinin in vitro sağkalımını ve büyümesini desteklemek için ^önemlidir23. Kültürde besleyici hücre çoğalmasını önlemek için, bu hücrelerin büyüme hapsine tabi tutulması gerekir. Bu iki şekilde elde edilebilir: ışınlama gibi fiziksel yöntemlerle veya doğrudan kültür yüzeyine uygulanabilen bir antitümöral antibiyotik olan mitomisin C (MMC) gibi sitotoksik kimyasallarla tedavi ^yoluyla24. Burada hücre ışınlama yoluyla elde edilen besleyici hücre büyümesi tutuklaması gösteriyoruz.

Bu yöntem, T hücrelerini aort kapak dokusundan izole etmek ve karakterize etmek için etkili, uygun maliyetli bir yol sunarak CAVD patofizyolojisini keşfetmek için immünolojik yöntemlerin spektrumunun genişletilmesine katkıda bulunur.

Protokol

Çalışma, İyi Bilimsel Uygulamanın Sağlanması için Charité Tüzüğü'ne göre yürütüldü ve gizlilik ve etikle ilgili yasal kılavuz ve hükümlere uyulur. Etik Kurul tüm insan deneylerini onaylamıştır ve hastaların mahremiyeti ve anonimliği Etik Form'da bildirilen kurallara uygun olarak sürdürülmektedir.

NOT: Aşağıda açıklanan protokol için taze insan stenotik kapak örnekleri kullanılmıştır.

1. Reaktif hazırlama

1. RPMI 1640 Medium: Non-esansiyel amino asitler ekleyerek zenginleştirilmiş RPMI komple ortamını hazırlayın; Sodyum Piruvat, L- Glutamin, ß-Mercaptoethanol ve Penisilin-Streptomisin (Pen/Strep). Kullanmadan önce filtreleyin. +4 °C'de saklayın ve iki ay içinde kullanın.
2. Zenginleştirilmiş RPMI 1640 komple orta ilave fetal sığır serumu (FBS), HB bazal orta, 50 U Interlökin 2 (IL-2) ve İnsan Serumu (HS) kullanarak klonlama aşaması için hücre kültürü ortamını (CCM) hazırlayın. Gün içinde filtreleyin ve kullanın. Saklamayın.
3. Eklenen FBS, HB bazal ortam, 30 U IL-2 ve HS ile zenginleştirilmiş RPMI 1640 komple ortamını kullanarak hücre kültürü ortamını yeniden besleme aşamasına hazırlayın. Gün içinde filtreleyin ve kullanın. Saklamayın.
4. 250 mL RPMI ve 5 mL Pen/Strep içeren yıkama tamponu hazırlayın. +4 °C'de saklayın, iki ay içinde kullanın.

2. T-25 şişelerine insan T lenfosit izolasyonu ve kültürü

1. Stenotik valf örneğini Yıkama Tamponu ile dolu steril bir Petri kabına yerleştirin ve tüm valf örneğinin bununla kaplı olmasını sağlayın. 15 dakika bekletin.
2. Stenotik vanayı neşter kullanarak küçük parçalar halinde kesin ve 10 dakika boyunca tekrar bekletin.
3. Hücre kültürü ortamını daha önce açıklandığı gibi 50 U il-2 ile hazırlayın ve filtreleyin.
4. CCM'yi T25 şişelerinin içine ekleyin ve steril bir plastik plier kullanarak valf parçalarını şişelerin içine yerleştirin.
5. Şişeleri bir hafta boyunca bir _CO2 inkübatörü içinde dikey bir konumda saklayın ve mikroskop altında şişenin durumunu gözlemlemeye dikkat edin. T hücre klonları kültür adımından yaklaşık üç gün sonra görünmelidir; daha iyi gözlem için şişelerin mikroskobik analizden önce 20 dakika boyunca yatay konuma yerleştirilmesi tavsiye edilir.
   NOT: Hücre kültürü ortamının miktarı, mevcut numune miktarına ve kaç adet T25 şişesi kullanılacağına bağlıdır. Her bir valf parçasının bir şişenin içinde 10 mL CCM gerektirdiği göz önüne alındığında, bir T25 şişesinde 25 mL CCM, 3 adet valf için uygundur.

3. Klonlama aşaması

NOT: T hücrelerinin klonlama aşaması için, PBMCs protokolünü izleyerek besleyici hücrelerin ışınlanmış bir buffy coat'dan (BC) izolasyonu ile başlamak gerekir.

1. İğnesiz valfli torba çivisini kullanarak laminar akış başlığının altındaki BC torbasını açın ve bir T150 şişesinde 50 mL kan aktarın. Şişenin içindeki kanı seyreltmek için 70 mL PBS ekleyin.
2. Dört 50 mL konik tüp alın ve her birine 20 mL yoğunluk gradyanı ortamı yerleştirin ve üzerine 30 mL kanı dikkatlice katlayın.
3. Freni kapalıyken 800 x g ve 20 °C'de 25 dakika santrifüj.
4. Süpernatantı dikkatlice emiş ve atık olarak atın. PBMC'leri PBS çözeltisinin içine 50ml hacme kadar ekleyerek yeni bir 50ml konik tüpte halkalayın.
5. 400 x g ve 20 °C'de 10 dakika santrifüj.
6. Üstnatantı atın ve PBS çözeltisinin içine 50 mL hacme kadar ekleyerek peleti askıya alın. Santrifüjleme aşamasını 400 x g ve 20 °C'de 10 dakika boyunca tekrarlayın.
7. Üstnatant atın ve 10 mL hücre kültürü ortamında FC'leri askıya alın.
8. Yeni bir toplama tüpü alın ve FC'ler ve hücre kültürü ortamı ile tüpten 9,9 mL PBS ve 100 μL'nin içine ekleyerek FC'leri PBS 1:10 ile seyreltin. Bir pipetle iyi durulayın ve bu seyreltmeden 7 μL alın ve hücreleri mikroskop altında sayın.
9. Klonlama aşaması için hücre kültürü ortamını hazırlayın: 50 U IL-2 ile 70 mL ve ardından iki 50 mL konik tüpe bölün, her tüp aşağıda açıklanacağı gibi 25 mL hücre kültürü ortamı içerecektir:
   • Tüp 1: 25 mL CCM + FCs + fitohemagglutinin %0,6'sı (PHA)
   • Tüp 2: 25 mL CCM + T lenfositler
     NOT: PMBC'ler yönteminin amacı her mL için 2 x ¹⁰⁶ hücre elde etmektir, bu nedenle hazırlanan 25 mL CCM'nin (Tüp 1) buna göre hesaplanması gerekir. Kullanılan genel formül: Sayılan hücre sayısı x ¹⁰⁶: 1 mL = CCM x ¹⁰⁶: X

4. Çok katlı plakalarda T Lenfosit kültürü

1. Elektronik pipeti kullanarak, şişelerin içindeki tüm hücre kültürü ortamını toplayın ve 50 mL konik bir tüpe aktarın. Boş şişeler atılabilir.
2. Hücreleri 400 x g ve 20 °C'de 10 dakika santrifüjleme ile peletle.
3. Süpernatantı atın, peleti 50 mL PBS'de askıya alın ve hücreleri 400 x g ve 20 °C'de 10 dakika santrifüjleme ile toplayın. Bu adımı iki kez yineleyin.
4. Süpernatantı atın ve peletin 1 mL CCM'de askıya alın. Bu seyreltmeden 7 μL alın ve hücreleri mikroskop altında sayın.
   NOT: Odanın hacmi ve seyreltme uygulanması için sayılan hücre sayısının çoğaltılması gerekir.
5. Hücre kültürü ortamında ^{105'ten 103'e} kadar sayılan hücreleri seyreltmeye devam edin ve ardından ^103'ten 500 μL alın ve Tüp 2'nin içine koyun.
6. Tüp 1'in 25 mL hücre kültürü ortamını 100 mm x 15 mm plastik Petri kabının içine dökün.
7. Dört 96-U alt multiwell plaka alın ve her kuyuda 100 μL tohum FC'lerine ayarlanmış çok kanallı bir pipet kullanın.
8. Tüp 2'yi alın ve hücre kültürü ortamını bir Petri kabının içine dökün. 100 μL'ye ayarlanmış çok kanallı bir pipet kullanarak, her kuyuda T hücrelerini tohumlamak.
9. Multiwell plakalarını bir hafta boyunca bir _CO2 inkübatöründe saklayın.

5. İlk yeniden besleme aşaması

1. Işınlanmış buffy ceket çantası kullanarak, önceki yöntemde açıklandığı gibi FC'leri elde etmek için PBMC yöntemini izleyin.
2. PHA olmadan uygun miktarda CCM hazırlayın ve filtreleyin.
3. Çok kanallı bir pipet kullanarak, her kuyudan 100 μL çıkarın ve kuyunun dibine dokunmamaya dikkat edin.
4. Hücre kültürü besinlerini sağlamak ve ortamı değiştirmek için tüm kuyulara bir besleme katmanı olarak 100 μL FC ekleyin.
   NOT: Her multiwell için 6 mL CCM'yi göz önünde bulundurmanız önerilir, bu nedenle 4 çokluwell için önerilen miktar yaklaşık 30 mL'dir. PHA'nın (toplam CCM miktarının %0,4'ü) ccm'ye iki haftada bir eklenmesi gerekir.

6. İkinci yeniden besleme aşaması

1. Yukarıda açıklanan pasajı takiben yeniden besleme aşamasını tekrarlayın. Hücre kültürü ortamına %0,4 PHA eklenmesi gerekir.

7. İlk bölme aşaması 1 kuyu / numuneden 2 kuyuya / numuneye

1. Mikroskop altındaki dört çoklu boşluğun tümünde kontrol edin ve bu kuyuları T hücre klonları (TCC' ler) ile bölmeye devam edin.
2. Besleyici hücrelerini ışınlanmış buffy ceket torbasından izole etmek için PBMCs protokolünü izleyin.
3. Hücre kültürü ortamını 30 U il-2 ile hazırlayın. IC'leri ekleyin ve U altlı yeni bir 96 kuyulu çoklu plaka alın.
4. 100 μL'ye ayarlanmış bir pipet kullanarak, seçilen numunelerin kuyularının içinde iyice durulayın ve her kuyuda bulunan 200 μL hacmi, yeni 2 kuyunun her biri için 100 μL hacme sahip olmak için yeni çok kuyulu plakanın 2 yeni kuyusuna bölün.
5. Tüm yeni kuyuların içine 100 μL IC ekleyin. Her kuyu toplam 200 μL hacim içermelidir.
6. Pipet 100 μL'ye ayarlayın ve kontrol görevi görmek için yalnızca FC'ler içeren ek iki kuyuya 100 μL ekleyin.
   NOT: TTK'yı hangi kuyuların başarıyla büyüttüğini belirlemek için tüm çok katlı plakaları gözlemlemek için hafif mikroskopi kullanın. Klonların seçimini kolaylaştırmak için, denetime (yalnızca DC'ler içeren iki kuyu) bir karşılaştırma yapılabilir ve klon denetime kıyasla daha koyu ve daha büyük görünür. Seçilecek kuyular, lenfositlerin yoğun bir şekilde bir araya toplanmış olduğu büyük, net, yuvarlak bir klona sahip olanlardır. İki haftalık yeniden beslemeden sonra TCC yoksa, bir hafta daha beklemeniz ve ek bir yeniden besleme aşaması gerçekleştirmeniz önerilir.

8. 2 kuyudan/ numuneden 4 kuyuya / numuneye ikinci bölme aşaması

1. Pipet 100 μL'ye ayarlayın, her numunenin iki kuyusunun içinde iyice durulayın ve her biri için 100 μL'lik iki yeni kuyuyu tohumlayın.
2. Hücre kültürü ortamını 30 U IL-2 ile hazırlayın ve IC'leri buffy ceket torbasından çıkarmak ve IC'leri CCM'nin içine yerleştirmek için PBMC tekniğini izleyin.
3. Pipet 100 μL'ye ayarlayın ve FC'leri tüm kuyulara tohumlayın. Multiwells bir hafta boyunca bir _CO2 inkübatörde saklayın.

9. 4 kuyudan/ numuneden 8 kuyuya / örneğe üçüncü bölme aşaması:

1. 100 μL'ye ayarlanmış çok kanallı bir pipet kullanarak, her numunenin dört kuyusunun içinde iyice durulayın ve 100 μL'lik tohumu yeni bir 96 kuyu plakasında dört yeni kuyunun her birine durulayın.
2. Hücre kültürü ortamını hazırlayın ve FC'leri ışınlanmış bir buffy ceket çantasından çıkarmak için PBMC'ler tekniğini izleyin.
3. IC'leri CCM'nin içine yerleştirin. Pipet 100 μL'ye ayarlayın ve FC'leri tüm kuyulara tohumlayın. Multiwells'i bir hafta boyunca bir _CO2 inkübatörde saklayın

10. Sitofluorimetrik analiz

1. CO2 inkübatöründen en eski tarihe sahip multiwell plakasını alın ve analiz etmek için numune numaralarıyla toplama tüplerini tanımlayın.
2. 2 uçlu 200 μL'ye ayarlanmış çok kanallı bir pipet kullanarak, aynı numunenin iki kuyusunun içini iyice durulayın ve her ikisini de aynı toplama tüpünün içine koyun. Tüm örnekler için bu adımı yineleyin.
   NOT: PCC örnekleri yalnızca kontrol görevi gördükleri için analiz edilmeyecektir.

11. Sitofluorimetrik analiz için Antikor Boyama Paneli Hazırlama

1. Her tüp için 1 mL PBS çözeltisi ve 400 x g ve 20 °C'de 10 dakika santrifüj ekleyin.
2. Santrifüjleme aşamasından sonra süpernatantı atın.
   NOT: Antikor boyama paneli Tablo 1'de bulunabilir. Hesaplanan her bir antikor konsantrasyonu yaklaşık 2 μL/numunedir. Kullanmadan önce antikor tüplerinin kısa bir süre dönmesi önerilir. Floroforla konjuge edilen antikorları ışıktan korumak için tüm adımlar karanlıkta yapılmalıdır.
3. Antikor karışımını 1,5 mL'lik bir tüpün içine hazırlayın ve girdaplayın.
4. Antikorları numunelerin içine ekleyin ve numuneleri 15 dakika boyunca oda sıcaklığında karanlıkta kuluçkaya bırakın.
5. Her numuneye 1 mL PBS ekleyin ve 400 x g ve 20 °C'de 10 dakika santrifüj ekleyin.
6. Süpernatant atın ve peleti 500 μL PBS çözeltisi ile askıya alın.
7. Sitofluorimetrik analize devam edin (FACS analizi, Tablo 1).
   NOT: Lekeli numuneler PBS çözeltisinde seyreltilmiş %0,5 paraformaldehit (PFA) kullanılarak sabitlenebilir ve 15 gün sonrasına kadar analiz edilebilir.
   DİkKAT: PFA toksiktir ve dikkatli bir şekilde ele alınmalıdır.

Işaretleyici	Florofor
CD3	PE/Cy7
CD4	Alexa Flor 488
CD8	Parlak menekşe 510
CD14	Parlak menekşe 421
CD25	PE
CD45	Parlak menekşe 711

Tablo 1. Kireçlenme aort kapak hastalığında T lenfosit popülasyonunun saptaması için antikor boyama paneli.

Sonuçlar

Şiddetli aort kapak darlığı olan insan hastalardan elde edilen taze aort kapak örneklerinin lökosit popülasyonu karakterize etmek için basit ve uygun maliyetli bir yöntem kullandık (protokole bakın). PBMC'leri izole etme yöntemi, deneyin her adımında (klonlama, yeniden besleme ve bölme aşamaları) kullanılan besleyici hücrelerin elde edilmesinde hayati bir adımdır ve aort valf örneklerinde lökositlerin algılanmasını ve karakterizasyonunu sağlar. Bu yöntemin temel adımları

Tartışmalar

Burada akış sitometrisi kullanarak stenotik aort kapak örneklerinden izole edilmiş T lenfosit subpopulasyonlarını karakterize etmek için bir yöntem sunuyoruz. Bu yöntem, PBMC'leri izole etmek için ışınlanmış buffy coat kullanılmasını gerektirir. Buffy ceket torbalarının tabi tutulması gereken radyasyon frekansı 9000 Rad/90 Gridir (Gy) ve besleyici hücrelerin çoğalmasını durdurmak için çok önemli bir adımı temsil eder. Buffy ceket torbalarından izole edilen hücrelerin rolü, sadece besley...

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
50 mL plastic syringes	Fisherbrand	9000701
96- well U- bottom Multiwell plates	Greiner Bio-One	10638441
Bag Spike (needle free)	Sigma	P6148	Dilute to 4% with PBS
CD14 Brilliant violet 421	Biolegend	560349
CD25 PE	Biolegend	302621
CD3 PE/Cy7	Biolegend	300316
CD4 Alexa Fluor 488	Biolegend	317419
CD45 Brilliant violet 711	Biolegend	304137
CD8 Brilliant violet 510	Biolegend	301047
Eppendorf tube 1.5 mL	Eppendorf	13094697
Eppendorf tube 0.5 mL	Thermo Scientific	AB0533
Falcon 15 mL conical centrifuge tube	Falcon	10136120
Falcon 50 mL conical centrifuge tubes	Falcon	10788561
Falcon Round-Bottom Polystyrene Tubes	BD	2300E
Fast read 102 plastic counting chamber	KOVA INTERNATIONAL	630-1893
Filters for culture medium 250 mL	NalgeneThermo Fisher Scientific	168-0045
Filters for culture medium 500 mL	NalgeneThermo Fisher Scientific	166-0045
HB 101 Lyophilized Supplement	Irvine Scientific	T151
HB Basal Medium	Irvine Scientific	T000
Heat-Inactivated FBS (Fetal Bovine Serum)	Euroclone	ECS0180L
HS (Human serum)	Sigma Aldrich	H3667
Human IL-2 IS	Miltenyi Biotec	130-097-744
L-Glutamine	Gibco	11140050
Lymphoprep	Falcon	352057
Non-essential amino acids solution	Sigma	11082132001
Paraformaldehyde	Thermo Fisher Scientific	10538931
PBS (Phosphate-buffered saline)	Thermo Fisher Scientific	10010023
Penicillin/Streptomycin	Gibco	15070063	10000 U/mL
PHA (phytohemagglutinin)	Stem Cell Technologies	7811
Plastic Petri dishes	Thermo Scientific	R80115TS	10 0mm x 15 mm
RPMI 1640 Media	HyClone	15-040-CV
Sodium pyruvate	Gibco by Life technologies	11360070
Syringe Filters 0,45µl	Rotilabo-Spritzenfilter	P667.1
T-25 Cell culture flasks	InvitrogenThermo Fisher Scientific	AM9625
T-75 Cell culture flask	Thermo Fisher Scientific	10232771
β- Mercaptoethanol	Gibco	A2916801