Untersuchung der Aortenklappenverkalkung durch Isolierung und Kultur von T-Lymphozyten unter Verwendung von Feederzellen aus bestrahltem Buffy-Fell

Zusammenfassung

In dieser Studie beschreiben wir den Prozess der T-Lymphozyten-Isolierung aus frischen Proben verkalkter Aortenklappen und die analytischen Schritte des T-Zell-Klonens zur Charakterisierung der adaptiven Leukozyten-Untergruppen unter Verwendung der Durchflusszytometrie-Analyse.

Zusammenfassung

Die Kalziffische Aortenklappenerkrankung (CAVD), ein aktiver Krankheitsprozess, der von einer leichten Verdickung der Klappe bis hin zu schwerer Verkalkung reicht, ist trotz neuer Therapieoptionen wie dem Transkatheter-Aortenklappenersatz (TAVR) mit einer hohen Mortalität verbunden.

Die kompletten Wege, die mit der Klappenverkalkung beginnen und zu einer schweren Aortenstenose führen, bleiben nur teilweise verstanden. Durch eine genaue Darstellung der Aortenklappenzellen in vivo könnte die Untersuchung von T-Lymphozyten aus stenotischem Klappengewebe ein effizienter Weg sein, um ihre Rolle bei der Entwicklung der Verkalkung zu klären. Nach der chirurgischen Exzision wird die frische Aortenklappenprobe in kleine Stücke zerlegt und die T-Lymphozyten werden kultiviert, kloniert und dann mittels fluoreszenzaktivierter Zellsortierung (FACS) analysiert.

Das Färbeverfahren ist einfach und die gefärbten Röhrchen können auch mit 0,5% Paraformaldehyd fixiert und bis zu 15 Tage später analysiert werden. Die aus dem Färbepanel generierten Ergebnisse können verwendet werden, um Änderungen der T-Zell-Konzentrationen im Laufe der Zeit in Bezug auf die Intervention zu verfolgen, und könnten leicht weiterentwickelt werden, um Aktivierungszustände spezifischer T-Zell-Subtypen von Interesse zu bewerten. In dieser Studie zeigen wir die Isolierung von T-Zellen, die an frisch verkalkten Aortenklappenproben durchgeführt wurden, und die Schritte der Analyse von T-Zell-Klonen mittels Durchflusszytometrie, um die Rolle der adaptiven Immunität in der CAVD-Pathophysiologie besser zu verstehen.

Einleitung

Die Kalziffische Aortenklappenerkrankung (CAVD) ist eine der häufigsten Herzklappenerkrankungen mit starken Auswirkungen auf das Gesundheitswesen. Die Häufigkeit des Aortenklappenersatzes hat in den letzten Jahren dramatisch zugenommen und wird aufgrund der wachsenden älteren Bevölkerung voraussichtlich weiter ^zunehmen1.

Die zugrunde liegende Pathophysiologie der CAVD ist nur teilweise bekannt und die aktuellen therapeutischen Strategien beschränken sich auf konservative Maßnahmen oder Aortenklappenersatz, entweder durch chirurgische oder perkutane Verfahren. Bis heute kann keine wirksame medizinische Behandlung das ....

Protokoll

Die Studie wurde gemäß der Satzung der Charité zur Sicherung guter wissenschaftlicher Praxis durchgeführt und die gesetzlichen Richtlinien und Bestimmungen zu Datenschutz und Ethik wurden eingehalten. Die Ethikkommission genehmigte alle Menschenversuche und die Privatsphäre und Anonymität der Patienten wurden in Übereinstimmung mit den auf dem Ethikformular angegebenen Regeln gewahrt.

HINWEIS: Für das unten beschriebene Protokoll wurden frische humanstenotische Klappenproben verwendet.

1. Vorbereitung des Reagenzes

1. Bereiten Sie das angereicherte RPMI-Komplettmedium vor, indem Sie RPMI 1640 Medium hinzuf....

Ergebnisse

Wir verwendeten eine einfache und kostengünstige Methode, um die Leukozytenpopulation von frischen Aortenklappenproben von menschlichen Patienten mit schwerer Aortenklappenstenose zu charakterisieren (siehe Protokoll). Die Methode zur Isolierung von PBMCs ist ein wichtiger Schritt bei der Gewinnung von Feederzellen, die in jedem Schritt des Experiments (Klonierungs-, Nachfütterungs- und Spaltungsphasen) verwendet werden und den Nachweis und die Charakterisierung infiltrierender Leukozyten in Aortenklappenproben ermögl.......

Diskussion

Hier stellen wir eine Methode zur Charakterisierung von T-Lymphozyten-Subpopulationen vor, die aus stenotischen Aortenklappenproben isoliert wurden, mittels Durchflusszytometrie. Diese Methode erfordert die Verwendung von bestrahltem Buffy Coat, um die PBMCs zu isolieren. Die Strahlungsfrequenz, der die Buffy-Coat-Beutel ausgesetzt werden müssen, beträgt 9000 Rad/90 Gray (Gy) und stellt einen entscheidenden Schritt dar, um die Proliferation der Feederzellen zu stoppen. Die Rolle der aus den Buffy-Coat-Beuteln isolierte.......

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
50 mL plastic syringes	Fisherbrand	9000701
96- well U- bottom Multiwell plates	Greiner Bio-One	10638441
Bag Spike (needle free)	Sigma	P6148	Dilute to 4% with PBS
CD14 Brilliant violet 421	Biolegend	560349
CD25 PE	Biolegend	302621
CD3 PE/Cy7	Biolegend	300316
CD4 Alexa Fluor 488	Biolegend	317419
CD45 Brilliant violet 711	Biolegend	304137
CD8 Brilliant violet 510	Biolegend	301047
Eppendorf tube 1.5 mL	Eppendorf	13094697
Eppendorf tube 0.5 mL	Thermo Scientific	AB0533
Falcon 15 mL conical centrifuge tube	Falcon	10136120
Falcon 50 mL conical centrifuge tubes	Falcon	10788561
Falcon Round-Bottom Polystyrene Tubes	BD	2300E
Fast read 102 plastic counting chamber	KOVA INTERNATIONAL	630-1893
Filters for culture medium 250 mL	NalgeneThermo Fisher Scientific	168-0045
Filters for culture medium 500 mL	NalgeneThermo Fisher Scientific	166-0045
HB 101 Lyophilized Supplement	Irvine Scientific	T151
HB Basal Medium	Irvine Scientific	T000
Heat-Inactivated FBS (Fetal Bovine Serum)	Euroclone	ECS0180L
HS (Human serum)	Sigma Aldrich	H3667
Human IL-2 IS	Miltenyi Biotec	130-097-744
L-Glutamine	Gibco	11140050
Lymphoprep	Falcon	352057
Non-essential amino acids solution	Sigma	11082132001
Paraformaldehyde	Thermo Fisher Scientific	10538931
PBS (Phosphate-buffered saline)	Thermo Fisher Scientific	10010023
Penicillin/Streptomycin	Gibco	15070063	10000 U/mL
PHA (phytohemagglutinin)	Stem Cell Technologies	7811
Plastic Petri dishes	Thermo Scientific	R80115TS	10 0mm x 15 mm
RPMI 1640 Media	HyClone	15-040-CV
Sodium pyruvate	Gibco by Life technologies	11360070
Syringe Filters 0,45µl	Rotilabo-Spritzenfilter	P667.1
T-25 Cell culture flasks	InvitrogenThermo Fisher Scientific	AM9625
T-75 Cell culture flask	Thermo Fisher Scientific	10232771
β- Mercaptoethanol	Gibco	A2916801