إنشاء نموذج الفئران من القوس العليا الجيوب الأنفية انسداد عبر طريقة الخيط والانصمام

Summary

هنا، ونحن إنشاء رواية سبراغ دولي (SD) نموذج الفئران من تجلط الجيوب الأنفية القوس متفوقة (SSS) عن طريق طريقة الانسداد الخيط، وتم التحقق من استقرار وموثوقية النموذج.

Abstract

الآليات المساهمة في البداية الطبيعية لتجلط الجيوب الأنفية الوريدية الدماغية (CVST) غير معروفة في الغالب ، وتشارك مجموعة متنوعة من العوامل التي لا يمكن السيطرة عليها في مسار المرض ، مما يؤدي إلى قيود كبيرة في البحوث السريرية. لذلك ، ساعد إنشاء نماذج حيوانية مستقرة CVST التي يمكن أن توحد مجموعة متنوعة من العوامل المحيرة التي لا يمكن السيطرة عليها على التحايل على أوجه القصور في البحوث السريرية. في العقود الأخيرة ، تم بناء مجموعة متنوعة من نماذج الحيوانات CVST ، ولكن النتائج المستندة إلى هذه النماذج كانت غير متسقة وغير مكتملة. ومن ثم، من أجل مواصلة استكشاف الآليات المرضية الفسيولوجية للCVST، من الضروري إنشاء نموذج حيواني جديد ومتوافق للغاية، له قيمة عملية هامة وأهمية علمية لتشخيص وعلاج CVST. في هذه الدراسة، تم إنشاء رواية سبراغ دولي (SD) نموذج الفئران من تجلط الجيوب الأنفية القوس متفوقة (SSS) عن طريق طريقة الانسداد الخيط، وتم التحقق من استقرار وموثوقية النموذج. بالإضافة إلى ذلك، قمنا بتقييم التغيرات في تدفق الدم الوريدي الدماغي في الفئران بعد تشكيل CVST. بشكل جماعي ، يمثل نموذج SSS-thrombosis SD-rat نموذجا حيوانيا جديدا CVST يتم إنشاؤه بسهولة ، ويقلل من الصدمة ، وينتج عنه استقرار جيد ، ويسمح بالتحكم بدقة في التوقيت والموقع الإقفاري.

Introduction

تجلط الجيوب الأنفية الوريدية الدماغية (CVST) هو مرض نادر في الجهاز الوريدي الدماغي الذي يمثل فقط 0.5-1.0٪ من جميع أسباب السكتة الدماغية ولكن لديه معدل حدوث مرتفع نسبيا في الأطفال والشباب¹. أثناء تشريح الجثة، تم العثور على CVST أن يكون السبب في 10٪ من وفيات الأمراض الدماغية الوعائية². يمكن أن يحدث تجلط الدم في أي جزء من الجهاز الوريدي داخل الجمجمة. الجيوب الأنفية القوسية متفوقة (SSS) هي واحدة من المناطق الأكثر تضررا في CVST ويمكن أن تنطوي على الأوعية الدموية متعددة. بسبب تضيق أو انسداد الجيوب الوريدية ، يتم حظر العودة الوريدية داخل الجمجمة ، والتي غالبا ما يصاحبها زيادة الضغط داخل الجمجمة³. المظاهر السريرية للCVST معقدة وتختلف مع مرور الوقت; على الرغم من عدم وجود خصوصية الأعراض، وتشمل الأعراض الأكثر شيوعا الصداع (77.2٪)، والمضبوطات (42.7٪)، والعجز العصبي (39.9٪). في الحالات الشديدة ، قد تحدث غيبوبة وحتى الموت^4،5. في السنوات الأخيرة، وبسبب التحسن العام في المعايير الطبية والصحية والوعي بالصحة العامة، تغيرت نسبة عوامل الخطر ذات الصلة، وانخفضت نسبة الصدمات والعدوى، وارتفعت^{تدريجيا نسبة}CVST الناجمة عن الحمل، والبريوم، ووسائل منع الحمل عن طريق الفم، وغيرها من الأسباب 5 .

في الوقت الحاضر ، لا يزال مرض CVST غير مفهوم جيدا. لاستكشاف CVST في العمق ، هناك حاجة إلى مزيد من البحوث المرضية الفسيولوجية. ومع ذلك، فإن معظم هذه الطرق البحثية الغازية وبالتالي من الصعب تنفيذها سريريا. نظرا للعديد من القيود على البحوث السريرية، والنماذج الحيوانية لها مزايا لا تعوض من حيث البحوث الأساسية والتواتيالية.

سبب CVST معقد ، حيث غالبا ما لا يتم التعرف على بدايته الأولية وموقع تكوين الجلطة متغير للغاية. لحسن الحظ، يمكن للنماذج الحيوانية تحقيق سيطرة أفضل على هذه العوامل. في العقود القليلة الماضية، تم إنشاء مجموعة متنوعة من نماذج الحيوانات CVST، ولكل نموذج عيوبه الخاصة. وفقا لأساليب الإنتاج المختلفة، يمكن تقسيمها تقريبا إلى الفئات التالية: نموذج SSS-ربط^{بسيطة 6،7}؛ SSS الداخلية الحقن مسرع نموذج⁸; النموذج تجلط SSS الناجم عن فيريريك-كلوريد⁹; نموذج تجلط SSS الناجم عن الكيماويات الضوئية¹⁰؛ وصنع الذاتي الانسداد- انسداد SSS نموذج¹¹. ومع ذلك ، فإن معظم هذه النماذج غير قادرة على التحايل على الأضرار الغازية التي لحقت قشرة الدماغ للحيوان وغير قادرة على التحكم بدقة في الوقت والمكان الإقفاري. في بعض النماذج، سوف الخفقان إعادة تشكيل تلقائيا. في نماذج أخرى، يصبح SSS انسداد بشكل دائم. وبالإضافة إلى ذلك، قد تؤثر العمليات المعقدة و/أو الإصابات الخطيرة على النتائج المرضية الفسيولوجية اللاحقة في هذه النماذج.

في هذه الدراسة، تم إدراج سد الموضوع في SSS من الفئران سبراغ دولي (SD) لإنشاء بنجاح نموذج CVST التي قللت من الضرر، وتمكين السيطرة الدقيقة، وأسفرت عن استقرار جيد. بالإضافة إلى ذلك، تم الجمع بين التصوير بالرنين المغناطيسي للحيوانات الصغيرة (MRI) وتصوير تدفق الدم بقع الليزر للتحقق من فعالية النموذج. قمنا بتقييم التغيرات في تدفق الدم الدماغي قبل وبعد إنشاء نموذجنا ، وكذلك تقييم استقرار نموذجنا ، ووضع الأساس لمزيد من الدراسات التي تستكشف حدوث وتطور وآليات الفيزيولوجيا المرضية ذات الصلة من CVST.

Protocol

وقد وافقت لجنة المعايير والاخلاق الطبية بجامعة ونتشو الطبية على الاجراءات المتعلقة بمواضيع الحيوانات و تتفق مع التشريع الصينى الخاص باستخدام ورعاية المختبرات.

1. إعداد المكونات الموضوع، الفئران SD، والمعدات التجريبية

1. استخدام موضوع النايلون مع قطر 0.28 ملم كجسم الرئيسي للقابس الموضوع.
   ملاحظة: يجب أن تكون ليونة و صلابة الخيط النايلون معتدلة.
2. تغطية نهاية واحدة من الخيط النايلون مع مواد السيليكون. طول الجزء السيليكون من المكونات الموضوع هو ما يقرب من 1.2 سم، وقطرها هو ما يقرب من 1.2 ملم. نهاية الرأس مدببة ، وجزء السيليكون أسطواني. حجز آخر 5-7 سم. الخيط النايلون من السهل المشبك ويمكن قطع وفقا لاحتياجات محددة بعد العملية.
3. استخدام الإيثانول 75٪ لنقع المكونات الموضوع لمدة 3 دقائق قبل العملية وشطف أي الإيثانول المتبقية مع المالحة العادية قبل توصيل.
4. حدد 12 الفئران SD الذكور وزنها بين 280 و 320 غرام، وتقسيمها عشوائيا إلى مجموعة وهمية ومجموعة تجريبية (ن = 6 لكل مجموعة). بعد أسبوع من التكيف البيئي، بسرعة الفئران لمدة 12 ساعة وحرمان المياه لهم لمدة 4 ساعة قبل العملية.
5. قم بإعداد المعدات التجريبية التالية اللازمة للتجربة: آلة تخدير حيوانية صغيرة ، وأداة ستيريوتاكسيك في الدماغ ، ومجهر تشريح ، وحفر جمجمة عالي السرعة ، ومقص ، وملاقط ، وملقط الأوعية الدموية ، وحامل إبرة ، وخيط إبرة ، وحقنة 2 مل ، ونظام تصوير تدفق الدم بالليزر ، وماسح التصوير بالرنين المغناطيسي للحيوانات الصغيرة.

2. بناء SD-Rat SSS-Embolization نموذج عبر الانسداد مؤشر الترابط

1. ضع فأر SD في صندوق تحريض التخدير واستخدم جهاز تخدير حيواني صغير لتقديم 4٪ isoflurane للحث على التخدير. بعد ذلك ، استخدم ملقط للتأكد من أن الأطراف الخلفية للفئران SD و أصابع قدم لا تستجيب لقرص معتدل.
2. بسرعة إصلاح ratwith SD حلق الشعر العلوي في موقف عرضة على جهاز ستيريوتاكسيك الدماغ. الحفاظ على التخدير مع 1.5-2.0٪ isoflurane (بسرعة 0.5 لتر / دقيقة)، وتحقيق الاستقرار في معدل التنفس في 40-60 نفسا / دقيقة. تثبيت درجة حرارة جسم الجرذ عن طريق وسادة التدفئة في 37±0.2 درجة مئوية.
   1. تطبيق زيوت التشحيم العين العيون العقيمة بعد وضع الفئران على الإطار ستيريوتاكسيك لحماية القرنيات من التجفيف أثناء التخدير.
3. تعقيم السطح على الجزء العلوي من رأس الجرذ مع 5٪ بوفيدوني اليود بالتناوب ثلاث مرات مع الإيثانول 75٪. إجراء شق الجلد (2.0 سم طويلة) في منتصف الرأس، ومن ثم قشر بعناية قبالة اللفافة العليا والبيريوستيوم لفضح الجمجمة تماما.
   1. تأكيد مواقف فونتانيل الأمامية، فونتانيل الخلفي، خياطة التاجية، خياطة القوس، وامتصاص عظم الرنجة.
4. استخدم المنطقة الواقعة بين الغرزة التاجية وخياطة عظم الرنجة كمنطقة مراقبة لتدفق الدم. لمنع الجمجمة من التأثير على الملاحظة أثناء تصوير تدفق الدم بقع الليزر، رقيقة الجمجمة في منطقة المراقبة حتى الأوعية الدموية مرئية بوضوح. يجب أن يكون حجم الجمجمة الرقيقة حوالي 1.0 سم × 1.0 سم. يتم تنفيذ هذه الخطوة وما يلي تحت المجهر تشريح.
   1. أثناء طحن الجمجمة، استخدم المالحة ذات درجة الحرارة العادية لشطف المثقاب مرارا وتكرارا لتجنب الحروق عالية الحرارة في قشرة الدماغ.
5. استخدام حفر عالية السرعة لطحن الجمجمة داخل 6.0 مم × 4.0 مم نافذة العظام تركزت في bregma لفضح SSS من منطقة bregma.
   1. استخدام المالحة العادية لتبريد الجمجمة أثناء طحن. عندما تصبح الجمجمة رقيقة، استخدم الملاقط لإزالة قطع العظام المتبقية بعناية لتجنب تمزق جهاز الSSS.
6. اختيار المكونات الموضوع مناسبة، واستخدام نقطة bregma SSS كنقطة المكونات، ثقب بعناية مع إبرة حقنة 2 مل، وإدراج بسرعة رأس سد الموضوع في نقطة المكونات.
   1. في هذا الوقت، يجب أن تكون الزاوية بين نهاية رأس توصيل مؤشر الترابط وSSS حوالي 30-45 درجة؛ ثم ضبط الزاوية بين نهاية المكونات الخيط وSSS إلى 0-10 درجة، وإدراج ببطء SSS في المركز حتى يصل الرأس إلى الحافة الخلفية لالتقاء الجيوب الأنفية. بعد ذلك، قطع الجزء الزائد من الذيل.
      ملاحظة: قد يحدث نزيف سريع عند ثقب SSS. إذا كان لا يمكن إدراج نهاية المكونات الموضوع بسرعة في نقطة التوصيل في وقت واحد، واستخدام الشاش الصغيرة أو القطن الكرة للضغط بلطف نقطة المكونات في حين تنزلق ببطء إلى أسفل لفضح نقطة المكونات بعناية، ومن ثم إدراج بسرعة نهاية الترباس الأسلاك في SSS. بعد إدخال قابس الخيط ، إذا كان هناك نزيف عند نقطة التوصيل ، يمكن استخدام مواد الهيموستاتيكي مثل إسفنجة الجيلاتين لوقف النزيف.

3. الكشف عن تدفق الدم على سطح الدماغ من الفئران SD

1. استخدم مصدر ضوء ليزر لإلقاء الضوء بشكل موحد على منطقة مراقبة تدفق الدم. يتم جمع الضوء المنعكس بواسطة كاميرا ويتم إرساله إلى جهاز كمبيوتر للتحليل. استخدم إعدادات المعلمة التالية لنظام تصوير تدفق الدم بالليزر: الطول الموجي: λ = 785 نانومتر؛ ووقت التعرض للصورة: T = 10 مللي ثانية.
2. مركز منطقة رصد تدفق الدم SD-rat في مجال الرؤية لنظام تصوير تدفق الدم بالليزر وإجراء مراقبة مستمرة لتدفق الدم على سطح الدماغ لمدة 2 دقيقة. جمع ومعالجة بيانات تدفق الدم قبل وبعد الانسداد لكل فأر SD، والحصول على خريطة تدفق الدم بقع الليزر للمنطقة التي لوحظت.
3. شطف المنطقة التي تعمل بشكل متكرر مع المالحة العادية لغسل حطام العظام وبقايا. خياطة الجلد (0 # الخيط) وتطهير مع iodophor.
4. الحفاظ على درجة حرارة الجسم حتى يستيقظ الجرذ بعد الجراحة ومن ثم منزل في قفص واحد مع الغذاء والماء المقدمة libitum الإعلانية. لا يمكن توصيل المجموعة الصورية.
5. بعد اكتمال جمع البيانات، قم بإجراء ما بعد المعالجة.
   1. الاختيار الكامل للمنطقة ذات الأهمية (ROI) عن طريق الأدوات التي يوفرها برنامج نظام التصوير تدفق الدم الليزر بقع. القيم التي تم الحصول عليها هي متوسط قيمة تدفق الدم في عائد الاستثمار، وقيم تدفق الدم الدماغي المحلي قبل وبعد الانصمام. استخدم قيمة تدفق الدم قبل الانسداد كقيمة الأساس.
   2. حدد أربعة مؤشرات استثمار وقياس التغير النسبي في تدفق الدم الدماغي في كل عائد استثمار، معبرا عنه على أنه التغير في المائة من قيمة الأساس.

4. الكشف عن موقف الخيط على الحيوانات الصغيرة MRI

1. استخدم معلمات التصوير T2 المرجحة التالية (T₂WI) لنظام التصوير بالرنين المغناطيسي: وقت الصدى (TE) = 33 مللي ثانية، وقت التكرار (TR) = 3000 مللي ثانية ، عدد الإثارة (NEX) = 4 ، شرائح = 28 ، سمك الشريحة = 0.8 مم ، حجم المصفوفة = 256 * 256 مم 2 ،^زاويةالوجه = 80 درجة ، مجال الرؤية (FOV) = 30 * 30 مم²، وقت المسح الضوئي = 6 دقائق 24 ثانية ؛ تم تعيين معلمات تصوير الأوعية بالرنين المغناطيسي (MRA) على النحو التالي: TE = 4.4 مللي ثانية، TR = 12 مللي ثانية، NEX = 4، شرائح = 80، سمك الشريحة = 0.4 مم، حجم المصفوفة = 256* 256 مم^{2، زاوية}الوجه = 80 درجة، FOV = 30* 30 مم^2،وقت المسح الضوئي = 16 دقيقة 23 ثانية 40 مللي ثانية.
2. إصلاح الحيوان على جدول المسح بالرنين المغناطيسي، ومعايرة موقف الدماغ عن طريق تحديد المواقع المسح الضوئي، وإجراء T₂WI وMRA تسلسل المسح الضوئي بعد تأكيد الموقف.
3. استخدام التخدير المستمر عن طريق آلة التخدير الحيواني أثناء الكشف. ثم، القتل الرحيم الفئران SD عن طريق الحقن داخل الصفاق من البنتوباربيتال المفرط.
4. الحصول على الصورة ومعالجة ما بعد: بعد جمع بيانات الصورة، من أجل مراقبة حالة المكونات الموضوع في SSS أكثر وضوحا، واستخدام طريقة تعزيز اللون الزائفة لعرض صورة T₂WI من الدماغ الفئران.

النتائج

لإنشاء نموذج SD-rat SSS-thrombosis عن طريق طريقة الخياطة ، يجب إعداد الغرز مسبقا(الشكل 1A)، ويجب إعداد المعدات اللازمة للتجربة(الشكل 1B). نظرا للطبيعة الحساسة للعملية ، يجب إكمال إعداد النموذج تحت مجهر تشريح. تظهر الخطوات الرئيسية في الشكل 2. لتسهيل وصف ...

Discussion

في هذه الدراسة، تم إنشاء نوع جديد من نموذج CVST بنجاح عن طريق إدراج سد العجز الموضوع عصامي في SSS من الفئران SD. بالإضافة إلى ذلك ، تم الجمع بين تصوير تدفق الدم بالليزر والتصوير بالرنين المغناطيسي للحيوانات الصغيرة لرصد التغيرات في تدفق الدم على سطح الدماغ من فئران SD قبل وبعد الانسداد من أجل تو?...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
2 mL syringe	Becton,Dickinson and Company	301940
brain stereotaxic instrument	Shenzhen RWD Life Technology Co., Ltd	68025
dissecting microscope	Wuhan SIM Opto-technology Co.	SIM BFI-HR PRO
high-speed skull drill	Shenzhen RWD Life Technology Co., Ltd	78046
laser-speckle blood-flow imaging system	Wuhan SIM Opto-technology Co.	SIM BFI-HR PRO
needle holder	Shenzhen RWD Life Technology Co., Ltd	F31022-12
needle thread	Shenzhen RWD Life Technology Co., Ltd	F33303-08
scissors	Shenzhen RWD Life Technology Co., Ltd	S13029-14
silica gel	Heraeus Kulzer	302785
small animal anesthesia machine	Shenzhen RWD Life Technology Co., Ltd	R540
small-animal MRI	Bruker Medical GmbH	Biospec 94/30 USR
tweezers	Shenzhen RWD Life Technology Co., Ltd	F11029-11
vascular forceps	Shenzhen RWD Life Technology Co., Ltd	F22003-09