通过螺纹栓塞方法建立高级射手座-鼻塞的鼠模型

摘要

在这里，我们建立了一个新的斯普拉格道利（SD）大鼠模型的优越下垂鼻窦（SSS）血栓通过螺纹栓塞方法，并验证了模型的稳定性和可靠性。

摘要

促成脑静脉鼻窦血栓形成（CVST）自然发病的机制大多未知，在疾病过程中涉及各种无法控制的因素，导致临床研究存在很大局限性。因此，建立稳定的CVST动物模型，可以标准化各种无法控制的混淆因素，有助于规避临床研究的不足。近几十年来，已经构建了各种CVST动物模型，但基于这些模型的结果是不一致和不完整的。因此，为了进一步探索CVST的病理生理机制，有必要建立一种新型的、高度兼容的动物模型，这对CVST的诊断和治疗具有重要的现实价值和科学意义。在本研究中，通过螺纹栓塞法建立了优越的下垂鼻窦（SSS）血栓形成的新型斯普拉格-道利（SD）大鼠模型，验证了模型的稳定性和可靠性。此外，我们评估了CVST形成后大鼠脑静脉血流量的变化。SD-rat SSS-血栓形成模型是一种新型的CVST动物模型，它易于建立，最大限度地减少创伤，产生良好的稳定性，并允许精确控制缺血时间和位置。

引言

脑静脉鼻窦血栓（CVST）是脑静脉系统罕见的疾病，仅占中风所有病因的0.5-1.0%，但在儿童和青少年中发病率^较高。在验尸过程中，CVST被查出是导致10%脑血管疾病死亡^{的原因2。}血栓形成可能发生在颅内静脉系统的任何部分。优越的下垂鼻窦 （SSS） 是 CVST 中最常见的受影响区域之一，可能涉及多个血管。由于静脉鼻窦的狭窄或闭塞，颅内静脉回流被阻断，这通常伴随着颅内压力^增加3。CVST的临床表现是复杂的，并随着时间的推移而变化:虽然症状缺乏特异性，但最常见的症状包括头痛（77.2%）、癫痫发作（42.7%）和神经缺陷（39.9%）。在严重的情况下，昏迷，甚至死亡可能发生^4，5。近年来，由于医疗卫生水平和公共卫生意识的全面提高，相关危险因素的比例有所变化，创伤和感染的比例有所下降，妊娠、幼虫、口服避孕药等原因引起的CVST比例逐步上升^5.

目前，CVST的发病机当时还没有得到很好的了解。为了深入探索CVST，需要进一步的病理生理学研究。然而，这些研究方法大多具有侵入性，因此难以在临床上实施。由于临床研究的诸多局限性，动物模型在基础研究和转化研究方面具有不可替代的优势。

CVST 的原因很复杂，因为它的初始发病通常无法识别，血栓形成的位置也非常多变。幸运的是，动物模型可以更好地控制这些因素。在过去的几十年里，各种CVST动物模型已经建立，每个模型都有其自身的缺点。根据不同的生产方法，大致可分为以下几个类:简单的SSS-ligation型号^6、7:SSS内部注射加速器型号^8:铁氯化物诱发的SSS血栓形成模型^9:光化学诱发的SSS血栓模型^10:和自制的栓塞闭塞SS模型^11。然而，这些模型大多无法规避对动物大脑皮层的侵入性损伤，也无法准确控制缺血时间和位置。在某些模型中，血栓会自发地重新扫描:在其他模型中，SSS 将永久被遮挡。此外，复杂的手术和/或严重伤害可能会影响这些模型中随后的病理生理学发现。

在本研究中，将螺纹插头插入斯普拉格-道利（SD）大鼠的SSS中，以成功建立CVST模型，最大限度地减少损伤，实现精确可控性，并产生良好的稳定性。此外，小动物磁共振成像 （MRI） 和激光斑点血流成像相结合，以验证模型的有效性。我们评估了模型建立前后脑血流的变化，并评估了模型的稳定性，为进一步研究CVST的发生、发展和相关病理生理机制奠定了基础。

研究方案

涉及动物学科的程序已获温州医科大学医学规范与伦理委员会批准，并符合中国关于实验室动物使用和护理的立法。

1. 准备螺纹插头、SD 大鼠和实验设备

1. 使用直径为 0.28 mm 的尼龙线作为螺纹插头的主体。
   注意:尼龙线的柔软度和硬度应适中。
2. 用硅胶材料覆盖尼龙线的一端。螺纹塞的硅胶部分长度约为 1.2 厘米，直径约为 1.2 毫米。头端锥形，硅胶部分为圆柱形。再保留 5-7 厘米。尼龙线易于夹紧，可在手术后根据特定需要切割。
3. 使用 75% 乙醇在操作前将螺纹插头浸泡 3 分钟，并在插入前用普通盐水冲洗任何残留乙醇。
4. 选择12只体重在280至320克之间的雄性SD大鼠，并随机将其分成一个假组和实验组（n = 6每组）。经过一周的环境适应后，将大鼠禁食12小时，在手术前将缺水的老鼠禁食4小时。
5. 准备实验所需的以下实验设备:小型动物麻醉机、脑立体毒仪、解剖显微镜、高速头骨钻头、剪刀、钳子、血管钳、针架、针线、2mL注射器、激光斑点血流成像系统和小型动物MRI扫描仪。

2. 通过螺纹栓塞构建 SD-Rat SSS-栓塞模型

1. 将SD大鼠放入麻醉感应盒中，并使用小型动物麻醉机提供4%的异氟烷来诱导麻醉。此后，使用钳子确认SD大鼠的后肢和脚趾对中度捏合没有反应。
2. 快速修复 SD 鼠与剃光的顶毛在大脑立体氧化装置的容易的位置。保持麻醉1.5-2.0%异氟兰（以0.5 L/min的速度），并将呼吸速率稳定在40-60呼吸/分钟。通过加热垫稳定大鼠的体温，温度为 37±0.2 °C。
   1. 大鼠被放置在立体毒性框架上后，应用无菌眼润滑剂，以保护角膜在麻醉期间不干燥。
3. 用5%的碘与75%乙醇交替三次对大鼠头顶部的表面进行消毒。在头部中间切开一个皮肤切口（2.0厘米长），然后小心地剥去顶部筋膜和围骨，以完全暴露头骨。
   1. 确认前方塔内尔、后方丰塔内尔、冠状缝合、下垂缝合和鱼骨缝合的位置。
4. 将冠状缝合线和鱼骨缝合线之间的区域用作血流观察区域。为了防止头骨在激光斑点血流成像期间影响观察，在观察区域将头骨变薄，直到血管清晰可见。变薄的头骨的大小应该是大约1.0厘米×1.0厘米。此步骤和以下步骤均在解剖显微镜下执行。
   1. 在头骨研磨过程中，使用正常温度盐水反复冲洗钻头，以避免高温灼伤大脑皮层。
5. 使用高速钻头在以布雷格马为中心的 6.0 mm x 4.0 mm 骨窗内研磨头骨，以暴露布雷格马区域的 SSS。
   1. 在研磨过程中使用普通盐水冷却头骨。当头骨变薄时，使用钳子小心地取出剩余的骨片，以避免撕裂 SSS。
6. 选择合适的螺纹插头，使用 SSS 布雷格马点作为插头点，用 2 mL 注射器针小心刺穿它，并快速将螺纹插头头插入插头点。
   1. 此时，螺纹插头末端与 SSS 之间的角度应约为 30-45°:然后将螺纹插头末端和 SSS 之间的角度调整到 0-10 度，然后缓慢地将 SSS 插入中心，直到头部到达鼻窦汇合的后边缘。之后，切断尾巴的多余的部分。
      注意:当 SSS 被刺穿时，可能会发生快速出血。如果螺纹插头的末端不能同时快速插入插头点，请使用小纱布或棉球轻轻按下插头点，同时缓慢滑动向下小心地暴露插头点，然后快速将螺纹末端插入 SSS。插入螺纹塞后，如果插头点有出血，可以使用明胶海绵等止血材料止血。

3. SD大鼠大脑表面血流检测

1. 使用激光源均匀地照亮血流观测区域。反射光由摄像机收集，并传输到计算机进行分析。使用以下参数设置为激光斑点血流成像系统:波长:λ = 785 nm;和图像曝光时间:T=10毫秒。
2. 将SD-rat血流观测区集中到激光斑点血流成像系统的视野中，对脑部血流进行2分钟的连续监测。收集和处理每只SD大鼠栓塞前后的血流量数据，并获取观察区域的激光斑点血流量图。
3. 用正常的盐水反复冲洗手术区域，以洗去骨屑和残留物。缝合皮肤（0#线程）和消毒与碘酚。
4. 保持体温，直到大鼠在手术后醒来，然后用食物和 水在一个笼子里存放。假组无法插入。
5. 数据收集完成后，执行后处理。
   1. 通过激光斑点血流成像系统软件提供的工具，完整选择感兴趣的区域 （ROI）。获得的值是投资回报率中的平均血流量值，以及栓塞前后的局部脑血流量值。在栓塞之前使用血流值作为基线值。
   2. 选择四个投资回报率，并测量每个投资回报率中脑血流量的相对变化，表示为基线值的百分比变化。

4. 检测小动物MRI的螺纹位置

1. 将以下 T2 加权成像 （T₂WI） 参数用于 MRI 成像系统:回声时间 （TE） = 33 毫秒， 重复时间 （TR） = 3000 ms， 兴奋次数 （NEX） = 4， 切片 = 28， 切片厚度 = 0.8 毫米， 矩阵大小 = 256*256 毫米²， 翻转角度 = 80°， 视场 （FOV） = 30*30 mm²， 扫描时间 = 6 分 24 秒:磁共振血管造影 （MRA） 参数设置如下: TE = 4.4 毫秒， TR = 12 ms， NEX = 4， 切片 = 80， 切片厚度 = 0.4 毫米， 矩阵大小 = 256*256 毫米²， 翻转角度 = 80°， FOV = 30*30 mm²， 扫描时间 = 16 分钟 23 秒 40 毫秒。
2. 修复 MRI 扫描台上的动物，通过定位扫描校准大脑位置，并在确认位置后执行 T₂WI 和 MRA 序列扫描。
3. 在检测过程中通过动物麻醉机使用连续麻醉。然后，通过过度的五巴比妥的内皮注射，对SD大鼠实施安乐死。
4. 图像采集和后处理:采集图像数据后，为了更清楚地观察SSS中螺纹插头的状态，使用伪增色方法显示大鼠大脑的T₂WI图像。

结果

要通过缝合方法建立SD-rat SSS-血栓形成模型，缝合应提前准备（图1A），并准备实验所需的设备（图1B）。由于操作的微妙性，模型的准备需要在解剖显微镜下完成。主要步骤显示在图2 中。为了便于描述模型血流观测的具体细节，图 3B标记了血流观察区域、骨窗和插头点，还显示了插入 SSS （...

讨论

在这项研究中，通过将自制螺纹插头插入SD大鼠的SSS，成功建立了一种新型的CVST模型。此外，激光斑点血流成像和小动物MRI相结合，监测SD大鼠栓塞前后脑部表面血流的变化，以标准化缺血时间和位置。

1989年，隆加等人逆行地将自制尼龙缝合物插入大鼠¹²的外骨动脉，从而制造了可逆的MCA遮挡模型。为了提高这种模式的稳定性，自¹³日起，?...

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
2 mL syringe	Becton,Dickinson and Company	301940
brain stereotaxic instrument	Shenzhen RWD Life Technology Co., Ltd	68025
dissecting microscope	Wuhan SIM Opto-technology Co.	SIM BFI-HR PRO
high-speed skull drill	Shenzhen RWD Life Technology Co., Ltd	78046
laser-speckle blood-flow imaging system	Wuhan SIM Opto-technology Co.	SIM BFI-HR PRO
needle holder	Shenzhen RWD Life Technology Co., Ltd	F31022-12
needle thread	Shenzhen RWD Life Technology Co., Ltd	F33303-08
scissors	Shenzhen RWD Life Technology Co., Ltd	S13029-14
silica gel	Heraeus Kulzer	302785
small animal anesthesia machine	Shenzhen RWD Life Technology Co., Ltd	R540
small-animal MRI	Bruker Medical GmbH	Biospec 94/30 USR
tweezers	Shenzhen RWD Life Technology Co., Ltd	F11029-11
vascular forceps	Shenzhen RWD Life Technology Co., Ltd	F22003-09