Establecimiento De Un Modelo De Rata De La Oclusión Superior Sagital-Seno A Través De Un Método De Hilo-Embolia

Resumen

Aquí, establecemos un modelo nuevo de la rata de Sprague-Dawley (SD) de la trombosis sagital superior del sino (SSS) vía un método del hilo-embolization, y la estabilidad y la confiabilidad del modelo fueron verificadas.

Resumen

Los mecanismos que contribuyen al inicio natural de la trombosis cerebral del sino venoso (CVST) son sobre todo desconocidos, y una variedad de factores incontrolables están implicados en el curso de la enfermedad, dando por resultado grandes limitaciones en la investigación clínica. Por lo tanto, el establecimiento de modelos animales CVST estables que pueden estandarizar una variedad de factores de confusión incontrolables han ayudado a evitar las deficiencias en la investigación clínica. En las últimas décadas, se han construido una variedad de modelos animales CVST, pero los resultados basados en estos modelos han sido inconsistentes e incompletos. Por lo tanto, para explorar más lejos los mecanismos patofisiológicos de CVST, es necesario establecer un modelo animal nuevo y altamente compatible, que tenga valor práctico importante y significación científica para la diagnosis y el tratamiento de CVST. En el actual estudio, un modelo nuevo de la rata de Sprague-Dawley (SD) de la trombosis sagital superior del sino (SSS) fue establecido vía un método del hilo-embolization, y la estabilidad y la confiabilidad del modelo fueron verificadas. Además, evaluamos cambios en flujo de sangre venoso cerebral en ratas después de la formación de CVST. Colectivamente, el modelo de la SSS-trombosis de la SD-rata representa un modelo animal nuevo de CVST que se establezca fácilmente, minimice trauma, rinde buena estabilidad, y permite controlar exactamente la sincronización y la localización isquémicas.

Introducción

La trombosis del seno venoso cerebral (CVST) es una enfermedad rara del sistema venoso cerebral que representa sólo el 0,5-1,0% de todas las causas de accidente cerebrovascular, pero tiene una tasa de ocurrencia relativamente alta en niños y adultos jóvenes^1. Durante la autopsia, cvst fue encontrado para ser la causa del 10% de muertes de la enfermedad cerebrovascular^2. La trombosis puede ocurrir en cualquier parte del sistema venoso intracraneal. El sino sagital superior (SSS) es una de las áreas lo más comúnmente posible afectadas de CVST y puede implicar los vasos sanguíneos múltiples. Debido a la estenosis u oclusión de los senos venosos, se bloquea el retorno venoso intracraneal, lo que a menudo se acompaña de un aumento de la presión intracraneal^3. Las manifestaciones clínicas de CVST son complejas y varían en un plazo determinado; aunque hay una falta de especificidad de los síntomas, los síntomas más comunes incluyen dolor de cabeza (77,2%), convulsiones (42,7%), y déficits neurológicos (39,9%). En casos graves, puede ocurrir coma e incluso la muerte^4,5. En los últimos años, debido a la mejora general de las normas médicas y de salud y a la concienciación sobre la salud pública, la proporción de factores de riesgo relacionados ha cambiado, la proporción de traumatismos e infecciones ha disminuido, y la proporción de CVST causada por el embarazo, el puerperio, los anticonceptivos orales y otras razones ha aumentado gradualmente^5.

Actualmente, la patogenesia de CVST todavía no se entiende bien. Para explorar CVST en profundidad, se necesita más investigación fisiopatológica. Sin embargo, la mayoría de estos métodos de investigación son invasivos y, por lo tanto, difíciles de implementar clínicamente. Debido a muchas limitaciones de la investigación clínica, los modelos animales tienen ventajas insustituibles en términos de investigación básica y traslacional.

La causa de CVST es compleja, pues su inicio es a menudo desconocido y la localización de la formación del trombo es altamente variable. Afortunadamente, los modelos animales pueden lograr un mejor control de estos factores. En las últimas décadas, se ha establecido una variedad de modelos animales CVST, y cada modelo tiene sus propias desventajas. De acuerdo con los diferentes métodos de producción, se pueden dividir aproximadamente en las siguientes categorías: el modelo simple de ligadura SSS^6,7; el acelerador de inyección interna SSS modelo⁸; la trombosis SSS inducida por cloruro férrico modelo^9; la trombosis del SSS fotoquímica inducida por el modelo^10; y la embolia-oclusión de auto-oclusión SSS modelo^11. Sin embargo, la mayoría de estos modelos son incapaces de evitar el daño invasivo a la corteza cerebral del animal y no son capaces de controlar con precisión el tiempo isquémico y la ubicación. En algunos modelos, el trombo se recanalizará espontáneamente; en otros modelos, el SSS se ocluye permanentemente. Además, las operaciones complicadas y/o lesiones serias pueden afectar a resultados patofisiológicos subsecuentes en estos modelos.

En el actual estudio, un enchufe del hilo fue insertado en el SSS de las ratas de Sprague-Dawley (SD) para establecer con éxito un modelo de CVST que minimizara daño, permitió controlabilidad exacta, y rindió buena estabilidad. Además, la proyección de imagen de resonancia magnética del pequeño-animal (MRI) y la proyección de imagen laser-manchada del sangre-flujo fueron combinadas para verificar la eficacia del modelo. Evaluamos cambios en flujo de sangre cerebral antes y después del establecimiento de nuestro modelo, así como evaluamos la estabilidad de nuestro modelo, sentando una base para otros estudios que exploraban el acontecimiento, el desarrollo, y los mecanismos patofisiológicos relacionados de CVST.

Protocolo

Los procedimientos que involucran a sujetos animales han sido aprobados por el Comité de Normas Médicas y Ética de la Universidad de Medicina de Wenzhou y están de acuerdo con la legislación de China sobre el uso y cuidado de animales de laboratorio.

1. Preparación del tapón de rosca, ratas SD y equipos experimentales

1. Utilice una rosca de nylon con un diámetro de 0,28 mm como cuerpo principal del tapón de rosca.
   NOTA: La suavidad y dureza del hilo de nylon debe ser moderada.
2. Cubra un extremo de la rosca de nylon con material de silicona. La longitud de la parte de silicona del tapón de rosca es de aproximadamente 1,2 cm, y el diámetro es de aproximadamente 1,2 mm. El extremo de la cabeza es cónico, y la parte de silicona es cilíndrica. Reserve otros 5-7 cm. El hilo de nylon es fácil de sujetar y se puede cortar de acuerdo con las necesidades específicas después de la operación.
3. Use etanol al 75% para remojar el tapón de rosca durante 3 minutos antes de la operación y enjuague cualquier etanol residual con solución salina normal antes de tapar.
4. Seleccione 12 ratas sd machos que pesan entre 280 y 320 g, y divídalas aleatoriamente en un grupo simulado y un grupo experimental (n = 6 por grupo). Después de una semana de adaptación ambiental, ayunar las ratas durante 12 h y privarlas de agua durante 4 h antes de la operación.
5. Prepare el siguiente equipo experimental necesario para el experimento: una pequeña máquina de anestesia para animales, un instrumento estereotáxico cerebral, un microscopio de disección, un taladro de cráneo de alta velocidad, tijeras, pinzas, pinzas vasculares, un soporte de aguja, un hilo de aguja, una jeringa de 2 ml, un sistema de imágenes de flujo sanguíneo con manchas láser y un escáner de RESONANCIA MAGNÉTICA para animales pequeños.

2. Construcción del modelo de embolización SD-Rat SSS a través de la embolización de rosca

1. Coloque la rata SD en una caja de inducción de anestesia y use una máquina anestésica de animales pequeños para administrar isoflurano al 4% para inducir la anestesia. A partir de entonces, use pinzas para confirmar que las extremidades traseras y los dedos de los dedos de los pie de la rata SD no responden a pellizcos moderados.
2. Fijar rápidamente el SD ratwith pelo superior afeitado en la posición decúbito prono en un dispositivo esteretáxico del cerebro. Mantener la anestesia con isoflurano al 1,5-2,0% (a una velocidad de 0,5 L/min), y estabilizar la frecuencia respiratoria a 40-60 respiraciones/min. Estabilice la temperatura corporal de la rata a través de una almohadilla térmica a 37±0.2 °C.
   1. Aplique lubricante oftálmico estéril para los ojos después de que la rata se coloque en el marco estereotáxico para proteger las córneas del secado durante la anestesia.
3. Esterilice la superficie en la parte superior de la cabeza de la rata con 5% de povidona yodada alternando tres veces con etanol al 75%. Haga una incisión en la piel (2.0 cm de largo) en el centro de la cabeza, y luego desprenda cuidadosamente la fascia superior y el periostio para exponer completamente el cráneo.
   1. Confirme las posiciones de la fontanela anterior, la fontanela posterior, la sutura coronal, la sutura sagital y la sutura de espiga.
4. Utilice el área entre la sutura coronal y la sutura de espiga como área de observación del flujo sanguíneo. Para evitar que el cráneo afecte la observación durante las imágenes de flujo sanguíneo con manchas láser, adelgace el cráneo en el área de observación hasta que los vasos sanguíneos sean claramente visibles. El tamaño del cráneo adelgazado debe ser de aproximadamente 1,0 cm × 1,0 cm. Este paso y los siguientes se realizan bajo un microscopio de disección.
   1. Durante la molienda del cráneo, use solución salina de temperatura normal para enjuagar el taladro repetidamente para evitar quemaduras de alta temperatura en la corteza cerebral.
5. Utilice un taladro de alta velocidad para moler el cráneo dentro de una ventana ósea de 6,0 mm x 4,0 mm centrada en bregma para exponer el SSS del área de bregma.
   1. Use solución salina normal para enfriar el cráneo durante la molienda. Cuando el cráneo se adelgace, use pinzas para extraer cuidadosamente las piezas óseas restantes para evitar el desgarro del SSS.
6. Elija un tapón de rosca adecuado, utilice el punto bregma SSS como punto de enchufe, perfítelo cuidadosamente con una aguja de jeringa de 2 ml e inserte rápidamente el cabezal del tapón del hilo en el punto de enchufe.
   1. En este momento, el ángulo entre el extremo del cabezal del roscado y el SSS debe ser de aproximadamente 30-45°; a continuación, ajuste el ángulo entre el extremo del tapón de rosca y el SSS a 0-10 grados, e inserte lentamente el SSS en el centro hasta que la cabeza alcance el borde posterior de la confluencia sinusal. A partir de entonces, cortar la parte sobrante de la cola.
      NOTA: El sangrado rápido puede ocurrir cuando se pincha el SSS. Si el extremo del tapón de rosca no se puede insertar rápidamente en el punto del tapón a la vez, utilice una pequeña gasa o bola de algodón para presionar suavemente el punto del tapón mientras se desliza lentamente hacia abajo para exponer el punto del tapón con cuidado y, a continuación, inserte rápidamente el extremo del perno del cable en el SSS. Después de insertar el tapón del hilo, si hay sangrado en el punto del tapón, se pueden usar materiales hemostáticos como una esponja de gelatina para detener el sangrado.

3. Detección de flujo sanguíneo en la superficie cerebral de ratas SD

1. Utilice una fuente de luz láser para iluminar uniformemente el área de observación del flujo sanguíneo. La luz reflejada es recogida por una cámara y se transmite a una computadora para su análisis. Utilice los siguientes ajustes de parámetros para el sistema de imágenes de flujo sanguíneo con manchas láser: longitud de onda: λ = 785 nm; y tiempo de exposición de la imagen: T = 10 ms.
2. Centre el área de observación del flujo sanguíneo sd-rata en el campo de visión del sistema de imágenes de flujo sanguíneo con manchas láser y lleve a cabo un monitoreo continuo del flujo sanguíneo en la superficie del cerebro durante 2 min. Recoja y procese los datos del flujo de sangre antes y después del embolization para cada rata del SD, y obtenga el mapa laser-manchado del sangre-flujo del área observada.
3. Enjuague repetidamente el área operada con solución salina normal para lavar los desechos y residuos óseos. Suturar la piel (0#hilo) y desinfectar con yodoforo.
4. Mantener la temperatura corporal hasta que la rata se despierte después de la cirugía y luego la casa en una sola jaula con comida y agua proporcionada ad libitum. El grupo de la farsa no se puede enchufar.
5. Una vez completada la recopilación de datos, realice el procesamiento posterior.
   1. Selección completa de la región de interés (ROI) a través de las herramientas proporcionadas por el software del sistema de imágenes de flujo sanguíneo con manchas láser. Los valores obtenidos son el valor promedio del flujo sanguíneo en el ROI y los valores locales del flujo sanguíneo cerebral antes y después de la embolización. Utilice el valor del flujo sanguíneo antes de la embolización como valor basal.
   2. Seleccione cuatro ROIs y mida el cambio relativo en el flujo sanguíneo cerebral en cada ROI, expresado como el cambio porcentual del valor basal.

4. Detección de la posición del hilo en pequeños animales MRI

1. Utilice los siguientes parámetros de imágenes ponderadas por T2 (T₂WI) para el sistema de imágenes de RM: tiempo de eco (TE) = 33 ms, tiempo de repetición (TR) = 3000 ms, número de excitación (NEX) = 4, rebanadas = 28, espesor de la rebanada = 0,8 mm, tamaño de la matriz = 256 * 256 mm^2,ángulo de volteo = 80 °, campo de visión (FOV) = 30 * 30 mm^2,tiempo de escaneo = 6 min 24 s; Los parámetros de resonancia magnética de la angiografía (MRA) fueron fijados como sigue: TE = ms 4,4, TR = 12 ms, NEX = 4, rebanadas = 80, grueso de la rebanada = 0,4 milímetros, tamaño de la matriz = 256*256^{milímetros 2,}ángulo de la vuelta = 80°, FOV = 30*30^{milímetros 2,}tiempo de la exploración = 16 minutos 23 sec 40 ms.
2. Fije el animal en la mesa de exploración de MRI, calibre la posición del cerebro colocando la exploración, y realice la exploración de la secuencia de T₂WI y de MRA después de confirmar la posición.
3. Use anestesia continua a través de la máquina de anestesia animal durante la detección. Entonces, euthanize las ratas del SD por la inyección intraperitoneal del pentobarbital excesivo.
4. Adquisición de imágenes y post-procesamiento: después de recopilar los datos de la imagen, con el fin de observar el estado del tapón de rosca en el SSS más claramente, utilice el método de mejora de pseudo color para mostrar la imagen T₂WI del cerebro de la rata.

Resultados

Para establecer el modelo de trombosis SSS sd-rata a través del método de sutura, la sutura debe prepararse de antemano (Figura 1A), y el equipo necesario para el experimento (Figura 1B) debe ser preparado. Debido a la naturaleza delicada de la operación, la preparación del modelo debe completarse bajo un microscopio de disección. Los pasos principales se muestran en la Figura 2. Para facilitar la descripción de los detalles e...

Discusión

En este estudio, un nuevo tipo de modelo de CVST fue establecido con éxito insertando un enchufe de rosca hecho a sí mismo en el SSS de ratas SD. Además, la proyección de imagen laser-manchada del sangre-flujo y el pequeño-animal MRI fueron combinados para supervisar cambios en flujo de sangre en la superficie del cerebro de ratas del SD antes y después del embolization para estandardizar la sincronización y la localización isquémicas.

En 1989, Longa et al. hicieron un modelo reversib...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
2 mL syringe	Becton,Dickinson and Company	301940
brain stereotaxic instrument	Shenzhen RWD Life Technology Co., Ltd	68025
dissecting microscope	Wuhan SIM Opto-technology Co.	SIM BFI-HR PRO
high-speed skull drill	Shenzhen RWD Life Technology Co., Ltd	78046
laser-speckle blood-flow imaging system	Wuhan SIM Opto-technology Co.	SIM BFI-HR PRO
needle holder	Shenzhen RWD Life Technology Co., Ltd	F31022-12
needle thread	Shenzhen RWD Life Technology Co., Ltd	F33303-08
scissors	Shenzhen RWD Life Technology Co., Ltd	S13029-14
silica gel	Heraeus Kulzer	302785
small animal anesthesia machine	Shenzhen RWD Life Technology Co., Ltd	R540
small-animal MRI	Bruker Medical GmbH	Biospec 94/30 USR
tweezers	Shenzhen RWD Life Technology Co., Ltd	F11029-11
vascular forceps	Shenzhen RWD Life Technology Co., Ltd	F22003-09