تقييم تشتت بيو فيلم في جروح مورين

Summary

هنا، ونحن نصف السابقين في الجسم الحي وفي أساليب الجسم الحي لتقييم التشتت البكتيري من عدوى الجرح في الفئران. ويمكن استخدام هذا البروتوكول لاختبار فعالية العلاجات الموضعية المضادة للميكروبات والأغشية الحيوية، أو لتقييم قدرة تشتت السلالات البكتيرية المختلفة أو الأنواع.

Abstract

وتورط العدوى ذات الصلة بيو فيلم في مجموعة واسعة من الحالات المزمنة مثل قرحة القدم السكري غير الشفاء، والتهاب الجيوب الأنفية المزمن، والتهاب الأذن الوسطى المتكرر، وغيرها الكثير. الخلايا الميكروبية داخل هذه العدوى محمية بمادة بوليمرية خارج الخلية (EPS) ، والتي يمكن أن تمنع المضادات الحيوية وتستضيف الخلايا المناعية من إزالة العدوى. للتغلب على هذه العقبة، بدأ المحققون في تطوير عوامل التشتت كعلاجات محتملة. تستهدف هذه العوامل مكونات مختلفة داخل EPS بيو فيلم، وإضعاف الهيكل، والشروع في تشتت البكتيريا، والتي يمكن نظريا تحسين فعالية المضادات الحيوية وإزالة المناعة. لتحديد فعالية عوامل التشتت لالتهابات الجروح ، قمنا بتطوير بروتوكولات تقيس تشتت بيو فيلم في الجسم الحي السابق وفي الجسم الحي. نحن نستخدم نموذج استئصال الماوس الجراحية التي تم وصفها بشكل جيد لخلق التهابات الجروح المزمنة المرتبطة بيو فيلم. لرصد التشتت في الجسم الحي، نصيب الجروح بسلالات بكتيرية تعبر عن لوسيفيراز. بمجرد أن تنشأ العدوى الناضجة ، نروي الجروح بمحلول يحتوي على إنزيمات تتحلل مكونات EPS بيو فيلم. ثم نراقب موقع وشدة الإشارة الإنارة في الجرح وتصفية الأعضاء لتوفير معلومات حول مستوى التشتت الذي تم تحقيقه. لتحليل الجسم الحي السابق لتشتت بيو فيلم ، يتم غمر أنسجة الجرح المصابة في محلول الإنزيم المهين للبيو فيلم ، وبعد ذلك يتم تقييم الحمل البكتيري المتبقي في الأنسجة ، مقابل الحمل البكتيري في المحلول. كلا البروتوكولين لديها نقاط القوة والضعف ويمكن تحسينها للمساعدة في تحديد بدقة فعالية العلاجات التشتت.

Introduction

ارتفاع مقاومة المضادات الحيوية في جميع أنحاء العالم يؤدي إلى عدم وجود خيارات المضادات الحيوية لعلاج مجموعة متنوعة من الالتهابات البكتيرية¹. بالإضافة إلى مقاومة المضادات الحيوية، يمكن للبكتيريا الحصول على تحمل المضادات الحيوية من خلال اعتماد نمط الحياة المرتبطة بيو فيلم². بيو فيلم هو مجتمع من الكائنات الحية الدقيقة التي تحميها مصفوفة من السكريات، الحمض النووي خارج الخلية، الدهون، والبروتينات^3،تسمى مجتمعة مادة البوليمر خارج الخلية (EPS). ومع استمرار أزمة مقاومة المضادات الحيوية، هناك حاجة ماسة إلى استراتيجيات جديدة تطيل أمد استخدام المضادات الحيوية أو تعمل على فعاليتها. عوامل مكافحة بيو فيلم هي واحدة واعدة الحل⁴.

من بين مختلف استراتيجيات مكافحة بيو فيلم التي تم اقتراحها، واستخدام عوامل التشتت، والتي تستهدف مكونات مختلفة من EPS بيو فيلم، هي في طليعة التنمية العلاجية⁵. الهدرلاسات الجليكوزيدية (GH) هي واحدة من هذه الفئة من عوامل التشتت. هرمون النمو هي فئة كبيرة من الانزيمات التي تحفز انشقاق الروابط المختلفة داخل السكريات التي توفر السلامة الهيكلية لEPS. وقد أظهرت مجموعتنا، فضلا عن غيرها، أن هرمون النمو يمكن أن تتحلل بشكل فعال الأغشية الحيوية، والحث على التشتت وتحسين فعالية المضادات الحيوية لعدد من الأنواع البكتيرية المختلفة، سواء في المختبر وفي الجسم الحي^{6،7،8،9،10،11}.

مع تزايد الاهتمام في التشتت بيو فيلم، من المهم تطوير أساليب فعالة لتقييم فعالية التشتت. هنا، نقدم بروتوكول مفصل لعلاج التهابات الجروح المرتبطة بيو فيلم مع عامل التشتت في الفئران، وتقييم فعالية التشتت، في الجسم الحي وفي الجسم الحي السابق. الهدف العام هو توفير أساليب فعالة يمكن استخدامها مع نماذج ما قبل السريرية لقياس تشتت بيو فيلم بفعالية وكفاءة.

تم استخدام نموذج عدوى استئصال مورين الجراحية في هذه الدراسات لإنشاء عدوى مرتبطة بيو فيلم. لقد استخدمنا هذا النموذج لأكثر من 15 عاما ونشرنا ملاحظاتنا على نطاق واسع^{7،9،12،13،14،15،16،17،18،19،20،21}. بشكل عام ، هذا هو نموذج العدوى غير المميتة حيث تظل البكتيريا مترجمة إلى سرير الجرح وترتبط بيو فيلم (البكتيريا التي ينظر إليها في المجاميع محاطة EPS) ، وإعداد عدوى مزمنة تستمر لمدة تصل إلى 3 أسابيع. ومع ذلك ، إذا كانت الفئران منقوصة المناعة (مع مرض السكري من النوع 1 على سبيل المثال) ، فإنها يمكن أن تصبح أكثر عرضة لتطوير عدوى جهازية قاتلة في هذا النموذج.

في هذا التقرير، نقدم بروتوكولات لتقييم تشتت البكتيريا من الجرح، سواء في الجسم الحي أو الجسم الحي السابق. يمكن استخدام كلا البروتوكولين لفحص فعالية عامل التشتت ويكون له نقاط قوته ونقاط ضعفه الخاصة. على سبيل المثال، يمكن لتقييم التشتت في الجسم الحي أن يوفر معلومات مهمة في الوقت الحقيقي حول انتشار البكتيريا إلى أجزاء أخرى من الجسم بعد التشتت، وكيفية استجابة المضيف. من ناحية أخرى ، قد يكون تقييم التشتت في الجسم الحي أكثر جاذبية لفحص عوامل أو جرعات أو تركيبات متعددة ، حيث يمكن تقسيم الأنسجة إلى أقسام متعددة يمكن اختبارها بشكل منفصل ، وبالتالي تقليل عدد الفئران المطلوبة. عند تقييم عوامل متعددة، ونحن عادة قياس التشتت أولا في المختبر كما هو موضح سابقا ^6،9،22. ثم نقوم باختبار الجسم الحي السابق الأكثر فعالية والاحتياطي في اختبار الجسم الحي لعدد محدود من العوامل الواعدة للغاية.

Protocol

تمت مراجعة هذا البروتوكول الحيواني والموافقة عليه من قبل اللجنة المؤسسية لرعاية الحيوان واستخدامه التابعة لمركز العلوم الصحية بجامعة تكساس للتكنولوجيا (البروتوكول رقم 07044). وقد أجريت هذه الدراسة وفقا للتوصيات الواردة في دليل رعاية واستخدام المختبرات التابع للمعاهد الوطنية للصحة.

1. إعداد البكتيريا لالتهابات الماوس

ملاحظة: هنا نحن نصف الفئران المصابة فقط مع Pseudomonas aeruginosa. ومع ذلك، يمكن استخدام أنواع بكتيرية أخرى للتسبب في العدوى. يتم تفصيل السلالات والمواد البكتيرية في جدول المواد.

1. استخدام Pseudomonas aeruginosa البرية نوع سلالة PAO1 تحمل البلازميد التلألؤ pQF50-لوكس^{23 لهذه} التجارب كما هو موضح سابقا⁷.
2. تنمو P. aeruginosa سلالات في قوارير إرلينماير حائرة، مع اهتزاز في 200 دورة في الدقيقة، في لوريا-بيرتاني (LB) مرق في 37 درجة مئوية لمدة 16 إلى 20 ساعة. إضافة تركيز النهائي من 100 ميكروغرام / مل من أمبيسلين لثقافة بين عشية وضحاها من PAO1 (pQF50-لوكس) للحفاظ على البلازميد.
3. الثقافة الفرعية P. aeruginosa بإضافة 100 ميكرولتر من الثقافة بين عشية وضحاها إلى قارورة Erlenmeyer تحتوي على 10 مل من مرق LB مع تركيز نهائي قدره 100 ميكروغرام / مل أمبيسلين. ثم تنمو لمدة 2-2.5 ساعة في 37 درجة مئوية مع اهتزاز، إلى OD_{600 نانومتر} من 0.4، ومن ثم تمييع تسلسليا (1:10) ثلاث مرات لجرعة إصابة ما يقرب من 10⁴ خلايا.

2. إعداد إنزيم التشتت بيو فيلم

ملاحظة: لهذه الدراسة نستخدم حل 10٪ من أجزاء متساوية الأميليز والسيلولاز (5٪ من كل)، والتي سوف يشار إليها باسم "GH"، لعلاج التشتت.

1. استخدام محلول GH 10٪ (ث / v) من الأميليز (من العصيات subtilis)والسيلولاز الفطرية (من النيجر Aspergillus) المخفف في 1x الفوسفات العازلة المالحة (PBS). استخدام برنامج تلفزيوني كعلاج التحكم في السيارة.
2. قم بتسخين جميع العلاجات إلى 37 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة لتنشيط الإنزيم.

3. الحيوانات التجريبية والإعداد قبل الجراحة

1. فئران المنزل، 5 زملاء القمامة في القفص الواحد، في ظروف تسيطر عليها البيئة، مع 12 ساعة دورات خفيفة / مظلمة والوصول السليم إلى الغذاء والماء.
2. ويفضل استخدام الفئران ويبستر السويسرية الإناث، بين 8 و 10 أسابيع من العمر.
3. وزن الفئران لتحديد الكمية المناسبة من التخدير لإدارة.
4. إعطاء التخدير عن طريق الحقن داخل الصفاق من 100 ملغ / كجم الكيتامين 10 ملغ / كغ xylazine.
5. ضعي كريم العين (مثل، تحديث P.M)بعناية على العين باستخدام مسحة قطنية للحد من الجفاف.
6. رصد المعلمات الفسيولوجية بما في ذلك معدل الجهاز التنفسي، تلوين الجلد، ودرجة حرارة الجسم طوال الجراحة.

4. دورسال جراحة استئصال سمك كامل

1. تقييم الطائرة الجراحية للتخدير عن طريق قرصة إصبع القدم ورصد معدل التنفس والجهد. حلق السطح الظهري وتطبيق كريم إزالة الشعر لمدة 10 دقيقة (أو وفقا لتعليمات المنتج)، وبعد ذلك إزالة بلطف، وضمان الجلد كان جافا.
2. لإدارة الألم، وإدارة 0.05 مل من الليدوكائين تحت الجلد في المنطقة ليتم استئصالها، وحقن 0.02 مل من البوبرينورفين تحت الجلد في scruff من الرقبة. انتظر 10 دقائق لضمان الوصول إلى إدارة الألم.
3. قبل استئصال، تطهير السطح الظهري باستخدام مسحة الكحول ورسم دائرة قطرها 1.5 سم نحو الجزء الخلفي من الظهر. الحفاظ على حقل جراحي معقم طوال العملية واستخدام الأدوات الاوتوسلافية والقفازات العقيمة. للحد من التلوث، قم بإجراء الجراحة بواسطة موقد بونسن مضاء واستخدم أدوات نظيفة لكل.
4. إدارة كامل سمك، جرح الجلد استئصالي إلى مستوى العضلات panniculus مع مقص الجراحية.
5. بعد استئصال، تغطية الجروح على الفور مع خلع الملابس البولي يوريثين شبه نفاذة.
6. حقن ما يقرب من 10⁴ CFU من البكتيريا في 100 μL PBS تحت خلع الملابس، على سرير الجرح، لإنشاء عدوى.
   ملاحظة: يمكن أيضا أن تكون مصابة الجروح مع أنواع متعددة من البكتيريا و / أو الفطريات في وقت واحد، أو عن طريق وضع الأغشية الحيوية شكلت مسبقا^12،أو حتى الأنسجة debridement المستخرجة من المرضى^19،على سرير الجرح.
7. بعد العدوى، ضع الفئران في قفص مع منصات التدفئة ورصد حتى استعادت منعكس الحق.
   ملاحظة: تأكد من أن الفئران لا تحصل الباردة لأن هذا يمكن أن يؤدي إلى الموت.
8. تحديد التهابات الجروح لمدة 48 ساعة.
9. فحص الضمادات لاصقة يوميا للدموع ومناطق عدم الالتزام واستبدالها إذا لزم الأمر.

5. في علاج تشتت الجسم الحي

ملاحظة: هنا نحن وصف إدارة عوامل التشتت من خلال تطبيق سلسلة من 3 حلول الري الجرح الموضعي(الشكل 1). ومع ذلك، يمكن تكييف البروتوكول لأنواع أخرى من التسليم مثل تطبيق المواد الهلامية أو الكريمات أو الضمادات.

1. ضع الفئران تحت تخدير الأيزوفلوران (بمعدل 3٪ و1 لتر في الدقيقة من الأكسجين) أثناء إدارة العلاجات.
2. إعداد ثلاثة 1 مل المحاقن، مع الإبر 25 G، التي تحتوي على 200 ميكرولتر من العلاج لكل فأر.
3. حقن 200 ميكرولتر من محلول الإنزيم أو التحكم في PBS على الجرح عن طريق رفع الجلد مع ملقط بعناية ، أعلى قليلا من الجرح نحو رأس الحيوان. ثقب المحاقن بعناية من خلال الجلد رفع وحقن ببطء الحل بين خلع الملابس وسرير الجرح. غالبا ما تلتزم الضمادات المستخدمة في هذه الدراسة بكل من سرير الجرح والأنسجة المحيطة به.
   1. لضمان تغطية سرير الجرح بأكمله بالمحلول ، ارفع الضمادة برفق مع ملقط ، وسحبها بعيدا عن سرير الجرح ، مع حقن المحلول ببطء.
4. بعد العلاج، ضع الفئران مرة أخرى في أقفاصها لمدة 30 دقيقة.
5. بعد 30 دقيقة من التعرض للعلاج ، قم بإعادة تخدير الفئران بالايسوففلوران وتوبيخ المحلول بحقنة ، مع التأكد من ثقب في نفس المنطقة كما كان من قبل.
   ملاحظة: يحتوي هذا الحل المهتلأ على خلايا بكتيرية مشتتة، والتي يمكن حفظها لمختلف التحليلات المصب.
6. إدارة علاجات الري الثانية والثالثة كأول، وذلك باستخدام حقنة جديدة في كل مرة.

6. في التصوير والتحليل في تشتت الجسم الحي

ملاحظة: إذا تم استخدام سلالة من البكتيريا الإنارة لبدء العدوى، يمكن استخدام نظام التصوير في Vivo (IVIS) لتصور التشتت من سرير الجرح.

1. الفئران صورة مباشرة قبل وبعد العلاج وعلى 10 و 20 ساعة بعد العلاج (الشكل 2 والشكل التكميلي 1).
2. إجراء التصوير بينما الفئران تحت التخدير عن طريق وضعها بشكل فردي في IVIS والتصوير كل واحد لمدة 5 ق في الطول الموجي من 560 نانومتر. احفظ الصور لمزيد من التحليل.
   ملاحظة: يعتمد الطول الموجي الأمثل ووقت التعرض على المراسل المستخدم وأداة IVIS وبرامج التصوير.
3. للتحليل، افتح الصور في برنامج IVIS وحدد المنطقة التي سيتم تحليلها في لوحة الأدوات.
4. لحساب الخلفية، ضع دائرة على خلفية صورة ثم ضع نفس الدائرة الحجم فوق سرير الجرح لكل فأر.
5. لتحميل قيم القياس، حدد عرض قياسات منطقة الاهتمام (ROI) > وتحميل جدول القياسات إلى جدول بيانات. طرح قراءة دائرة الخلفية من كل من قياسات سرير الجرح لحساب التلألؤ لكل عينة. حساب النسبة المئوية للتألق التي تم تغييرها بواسطة:
   عائد الاستثمار قبل العلاج-ROI بعد العلاج/ العائد على الاستثمار قبل العلاج) × 100.
   ملاحظة: يجب تحليل الماوس التحكم ومعالجتها في وقت واحد لتطبيع للمتغيرات التي قد تؤثر على الحصول على الصورة أو التألق.

7. تقييم التشتت من خلال تحديد CFU

1. القتل الرحيم إنسانيا الفئران عن طريق الحقن داخل الصفاق من 0.2 مل من الصوديوم pentobarbital (على سبيل المثال، زائد فادح) تحت التخدير مع 100 ملغم / كجم كيتامين 10 ملغ / كغ xylazine.
2. حصاد أنسجة سرير الجرح عن طريق إزالة أولا بلطف خلع الملابس مع ملقط معقم، ومن ثم قطع حول محيط سرير الجرح مع مقص الجراحية العقيمة. رفع بلطف نهاية واحدة من سرير الجرح مع ملقط أثناء استخدام مقص لقطع / ندف العينة بعيدا عن طبقة العضلات.
3. ضع الأنسجة من سرير الجرح في أنبوب تجانس 2 مل قبل التسمية والوزن المسبق الذي يحتوي على 1 مل من PBS. وزن الأنابيب مرة أخرى بعد إدراج العينات، ومن ثم عكس بلطف 3-5 مرات لشطف قبالة أي البكتيريا المنتشرة أو فضفاضة الالتزام بها، وإزالة برنامج تلفزيوني. إضافة 1 مل من برنامج تلفزيوني جديد.
4. من أجل حصاد الطحال ، ضع الفئران في وضع تشريحي قوي وآمن عن طريق تثبيت أطرافها على سطح تشريح. نقع المنطقة ليتم تشريحها مع الإيثانول 70٪ من أجل تطهير المنطقة والحفاظ على الفراء من تلويث العينة.
5. قم بإجراء شق صغير عمودي على خط الوسط مع مقص جراحي في الأدمة في أسفل البطن ، مع التأكد من سحب الجلد صعودا وبعيدا عن الأعضاء الداخلية. استمر في الشق داخليا ، على طول الخط الأوسط ، حتى تم الوصول إلى القص. بمجرد تعرض التجويف البريتوني وكانت الأعضاء الداخلية مرئية ، افصل الطحال برفق عن النسيج الضام ووضعها في أنبوب تجانس منفصل.
6. وزن الطحال وشطف مع برنامج تلفزيوني، كما هو موضح لأنسجة سرير الجرح.
   ملاحظة: يمكن حصاد أجهزة أخرى ذات أهمية مماثلة.
   1. عند إجراء الشق الأولي، يجب الحرص على تجنب ثقب الأمعاء أو الأعضاء الأخرى.
7. تجانس العينات في 2 مل قبل مملوءة أنابيب مطحنة حبة باستخدام متجانس benchtop في 5 م / ث لمدة 60 ثانية، مرتين.
8. لتعداد CFU، مخففة بشكل متسلسل عينات وبقعة لوحة على أجار انتقائية. لتخفيف المسلسل، ماصة 100 ميكرولتر من العينة إلى 900 ميكرولتر من برنامج تلفزيوني في أنبوب 1.5 مل، دوامة، وتكرار 5 مرات. ماصة 10 ميكرولتر من كل تخفيف على لوحة أجار كما هو مبين في الشكل 3.
   ملاحظة: إذا كان مطلوب كمية CFU أكثر دقة، انتشار 100 ميكرولتر من كل تخفيف العينة عبر لوحات أجار منفصلة.

8. تقييم الجسم الحي للتشتت ( الشكل4)

1. الفئران الجرح وتصيب ما يقرب من 10⁴ PAO1 كما هو موضح أعلاه، ومن ثم القتل الرحيم 48 ساعة بعد العدوى.
2. إزالة بعناية خلع الملابس مع ملقط، وذلك باستخدام تقنية معقمة ودون إزعاج سرير الجرح.
3. استخدم مقصا جراحيا معقما لقطع محيط سرير الجرح بعيدا عن الجلد غير المصاب باستخدام ملقط لرفع طرف واحد من سرير الجرح ومقص لاستئصال أنسجة الجرح المصابة من طبقة العضلات تحت الأنسجة غير المصابة المحيطة بها. تقسيم عينات سرير الجرح إلى أجزاء متساوية أو استخدام كامل.
4. ضع أنسجة الجرح في فارغة، قبل وزنها 2 مل حبة مطحنة أنابيب التجانس. ثم وزن الأنابيب مرة أخرى بعد إضافة العينة. حساب وزن العينة عن طريق:
   الوزن بعد إضافة عينة - الوزن قبل إضافة عينة.
5. إضافة 1 مل من برنامج تلفزيوني، وانعكس بلطف أنبوب 3-5 مرات لشطف العينة وإزالة أي خلايا العوالق. إزالة وتجاهل برنامج تلفزيوني.
6. أضف 1 مل من علاج هرمون النمو (أو PBS كتحكم سلبي) إلى العينة واحتضن لمدة 2 ساعة عند 37 درجة مئوية مع الاهتزاز عند 80 دورة في الدقيقة.
7. إزالة محلول التشتت بيو فيلم ومكان في أنبوب منفصل 1.5 مل. هذا يحتوي على خلايا متفرقة.
8. إضافة 1 مل من برنامج تلفزيوني إلى عينة الأنسجة المتبقية وعكس بلطف 3-5 مرات لشطف قبالة أي خلايا مشتتة المتبقية. إزالة وتجاهل برنامج تلفزيوني.
9. إضافة 1 مل من برنامج تلفزيوني إلى الأنسجة المتبقية وتجانس في 5 م / ث لمدة 60 ثانية باستخدام متجانس benchtop.
10. تمييع محلول الخلايا المشتتة وعينة الأنسجة المتجانسة بشكل متسلسل عن طريق وضع 100 ميكرولتر من العينة في 900 ميكرولتر من PBS في أنبوب 1.5 مل ، وتكرار خمس مرات لما مجموعه 6 تمييعات.
11. بقعة لوحة 10 ميكرولتر من كل تخفيف على وسائل الإعلام أجار انتقائية (على سبيل المثال، Pseudomonas العزلة أغار لP. aeruginosa)واحتضان لوحات في 37 درجة مئوية بين عشية وضحاها.
12. عد CFU وحساب 'في المئة مشتتة' كما (CFU في supernatant / (CFU في supernatant + CFU في الأنسجة بيو فيلم)) × 100.

النتائج

في هذه التجربة، أصيبت 8-10 أسابيع من الفئران السويسرية ويبستر القديمة مع 10⁴ CFU من PAO1 تحمل البلازميد التلألؤ pQF50-لوكس. كما هو موضح أعلاه، سمح للعدوى لتحديد لمدة 48 ساعة قبل إعطاء العلاجات 3 × 30 دقيقة من برنامج تلفزيوني إما (مراقبة السيارة) أو 10٪ GH (العلاج) لهضم EPS بيو فيلم. تم تصوير الفئران قب?...

Discussion

هنا نحن وصف البروتوكولات التي يمكن استخدامها لدراسة فعالية عوامل التشتت بيو فيلم. ويمكن تكييف هذه البروتوكولات بسهولة لاستخدامها مع أنواع مختلفة من عوامل التشتت أو الأنواع البكتيرية أو عينات الجسم الحي السابق، بما في ذلك عينات الحطام السريري. يوفر هذا البروتوكول أيضا نموذجا مناسبا ...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
1.5 mL microcentrifuge tube	Fisher	14823434	Use to complete serial dilutions of samples
25G 58 in needle	Fisher	14823434	Attaches to 1 mL syringe
Ampicillin Sodium Salt	Fisher	BP1760-5	Make a 50 mg/ mL stock solution and add 100 µL to 10 mL of LB broth for both overnight and subculture
Amylase	MP Biomedicals	2100447	Make a 5% w/v solution, vortex- other dispersal agents can be used
Buprenorphine SR-LAB 5 mL (1 mg/mL)	ZooPharm	RX216118	Use as pain mainagement- may use other options
Cellulase	MP Biomedicals	2150583	Add 5% w/v to the 5% w/v amylase solution, vortex, activate at 37 °C for 30 min- other dispersal agents can be used
Depilatory cream	Walmart	287746	Use a small amount to massage into the hair follicles on the back of the animal and allot 10 min to remove hair
Dressing Forceps, Serrated Tips	Fisher	12-460-536	Can use other forms of forceps
Erlenmeyer flasks baffled 125 mL	Fisher	101406	Use to grow overnights and sub-cultures of bacteria
FastPrep-24 Benchtop Homogenizer	MP Biomedicals	6VFV9	Use 5 m/s for 60 s two times to homogenize tissue
Fatal Plus	Vortech Pharmaceuticals	0298-9373-68	Inject 0.2 mL intraperitaneal for each mouse
Homogenizing tubes (Bead Tube 2 mL 2.4 mm Metal)	Fisher	15340151	Used to homogenize samples for plating
Isoflurane	Diamond Back Drugs
Ketamine hydrochloride/xylazine hydrochloride solution C-IIIN	Sigma Aldrich	K4138	Use as anasethia- other options can also be utilized to gain a surgical field of anasethia
LB broth, Miller	Fisher	BP1426-2	Add 25 g/L and autoclave
Lidocaine 2% Injectable	Diamond Back Drugs	2468	Inject 0.05 mL through the side of the marked wound bed area so it is deposited in the center of the mark. Allot 10 min prior to cutting
Meropenem	Sigma Aldrich	PHR1772-500MG	Make 5 mg/mL to add to the GH solution to apply topically and a 15 mg/mL solution to inject intraperitaneal 4 h prior and 6 h post-treatment
Non-sterile cotton gauze sponges	Fisher	13-761-52	Use to remove the depilatory cream
PAO1 pQF50-lux bacterial strain	Ref [13]	N/A	PAO1 pgF50-lux was used as the P. aeruginosa strain of interest in this paper's representative results
Petri dishes	Fisher	PHR1772-500MG
Phosphate Buffer Saline 10x	Fisher	BP3991	Dilute 10x to 1x prior to use
Polyurethane dressing	Mckesson	66024007	Cut the rounded edge off and cut the remaining square into 4 equal sections
Pseudomonas isolation agar	VWR	90004-394	Add 20 mL/L of glycerol and 45 g/mL to water, autoclave, and pour 20 mL into petri dishes
Refresh P.M.	Walmart		Use on eyes to reduce dryness during procedure.
Sterile Alcohol Prep Pads	Fisher	22-363-750	Use to clean the skin immediately prior to wounding to disinfect the area
Straight Delicate Scissors	Fisher	89515	Can also use curved scissors
Swiss Webster mice	Charles River	551NCISWWEB	Other mice strains can be used
Syring Slip Tip 1 mL	Fisher	14823434	Used to administer drugs and enzyme treatment