Оценка рассеивания биопленки в мышиных ранах

Резюме

Здесь мы описываем методы ex vivo и in vivo для оценки распространения бактерий от раневой инфекции у мышей. Этот протокол может быть использован для проверки эффективности местной антимикробной и антибиопленковой терапии или для оценки рассеивательной способности различных бактериальных штаммов или видов.

Аннотация

Инфекции, связанные с биопленкой, связаны с широким спектром хронических состояний, таких как незаживающие диабетические язвы стопы, хронический синусит, повторяющийся средний отит и многие другие. Микробные клетки в этих инфекциях защищены внеклеточным полимерным веществом (EPS), которое может предотвратить антибиотики и иммунные клетки хозяина от очистки инфекции. Чтобы преодолеть это препятствие, исследователи начали разрабатывать диспергирующие агенты в качестве потенциальных терапевтических средств. Эти агенты нацелены на различные компоненты в биопленке EPS, ослабляя структуру и инициируя рассеивание бактерий, что теоретически может улучшить эффективность антибиотиков и иммунный клиренс. Чтобы определить эффективность диспергаторов при раневых инфекциях, мы разработали протоколы, которые измеряют рассеивание биопленки как ex vivo, так и in vivo. Мы используем модель хирургического иссечения мыши, которая была хорошо описана для создания хронических раневых инфекций, связанных с биопленкой. Чтобы контролировать рассеивание in vivo,мы заражаем раны бактериальными штаммами, которые экспрессируют люциферазу. Как только зрелые инфекции установлены, мы орошаем раны раствором, содержащим ферменты, которые разлагают компоненты биопленки EPS. Затем мы отслеживаем местоположение и интенсивность люминесцентного сигнала в ране и фильтрующих органах, чтобы предоставить информацию о достигнутом уровне рассеивания. Для анализа рассеивания биопленки ex vivo инфицированную раневую ткань погружают в раствор фермента, разлагающего биопленку, после чего оценивается бактериальная нагрузка, остающиеся в ткани, по сравнению с бактериальной нагрузкой в растворе. Оба протокола имеют сильные и слабые стороны и могут быть оптимизированы, чтобы помочь точно определить эффективность дисперсных методов лечения.

Введение

Рост устойчивости к антибиотикам во всем мире приводит к отсутствию вариантов антибиотиков для лечения различных бактериальных инфекций¹. В дополнение к устойчивости к антибиотикам, бактерии могут получить толерантность к антибиотикам, приняв образ жизни, связанный с биопленкой^2. Биопленка представляет собой сообщество микроорганизмов, которые защищены матрицей полисахаридов, внеклеточной ДНК, липидов и белков^3,в совокупности называемых внеклеточным полимерным веществом (EPS). Поскольку кризис устойчивости к антибиотикам продолжается, крайне необходимы новые стратегии, которые продлевают использование антибиотиков или потенцируют эффективность. Антибиопленоополяторы являются одним из перспективных растворов^4.

Среди различных стратегий антибиопленки, которые были предложены, использование диспергаторов, которые нацелены на различные компоненты биопленки EPS, находятся на переднем крае терапевтической разработки^5. Гликозидгидролазы (ГР) являются одним из таких классов диспергаторов. GH представляют собой большой класс ферментов, которые катализируют расщепление различных связей внутри полисахаридов, которые обеспечивают структурную целостность EPS. Наша группа, как и другие, показала, что ГР может эффективно разлагать биопленки, индуцировать рассеивание и улучшать эффективность антибиотиков для ряда различных видов бактерий, как in vitro, так и in vivo^{6,7,8,9,10,11.}

С растущим интересом к рассеиванию биопленки важно разработать эффективные методы, которые оценивают эффективность рассеивания. Здесь мы представляем подробный протокол лечения биопленочно-ассоциированных раневых инфекций рассеивателем у мышей, а также оценку эффективности рассеивания in vivo и ex vivo. Общая цель состоит в том, чтобы обеспечить эффективные методы, которые могут быть использованы с доклиническими моделями для эффективного и действенного измерения рассеивания биопленки.

Модель хирургической иссеченной инфекции мышей была использована в этих исследованиях для установления инфекции, связанной с биопленкой. Мы использовали эту модель более 15 лет и опубликовали наши наблюдения широко^{7,9,12,13,14,15,16,17,18,19,20,21.} В целом, это модель нелетальной инфекции, где бактерии остаются локализованными в раневом ложе и связаны с биопленкой (бактерии, наблюдаемые в агрегатах, окруженных EPS), создавая хроническую инфекцию, которая длится до 3 недель. Однако, если у мышей ослаблен иммунитет (например, с диабетом 1 типа), они могут стать более восприимчивыми к развитию смертельной системной инфекции в этой модели.

В этом отчете мы предоставляем протоколы для оценки рассеивания бактерий из раны, как in vivo, так и ex vivo. Оба протокола могут быть использованы для изучения эффективности рассеивателя и имеют свои сильные и слабые стороны. Например, оценка рассеивания in vivo может предоставить важную информацию в режиме реального времени о распространении бактерий в другие части тела после рассеивания и о том, как реагирует хозяин. С другой стороны, оценка диспергирования ex vivo может быть более желательной для скрининга нескольких агентов, доз или составов, поскольку ткань может быть разделена на несколько секций, которые могут быть протестированы отдельно, тем самым уменьшая количество требуемых мышей. При оценке нескольких агентов мы обычно измеряем рассеивание сначала in vitro, как описано ^{ранее 6,9,22.} Затем мы тестируем наиболее эффективное тестирование ex vivo и резервное тестирование in vivo для ограниченного числа очень перспективных агентов.

протокол

Этот протокол для животных был рассмотрен и одобрен Институциональным комитетом по уходу за животными и их использованию Центром медицинских наук Техасского технического университета (протокол No 07044). Данное исследование проводилось в строгом соответствии с рекомендациями Руководства по уходу за лабораторными животными и их использованию Национальными институтами здравоохранения.

1. Подготовка бактерий к мышиным инфекциям

ПРИМЕЧАНИЕ: Здесь мы описываем заражение мышей только Pseudomonas aeruginosa. Тем не менее, другие виды бактерий могут быть использованы для возникновения инфекции. Бактериальные штаммы и материалы подробно описаны в Таблице материалов.

1. Используйте Pseudomonas aeruginosa штамм дикого типа PAO1, несущий люминесцентную плазмиду pQF50-lux²³ для этих экспериментов, как описано^{ранее 7.}
2. Выращивайте штаммы P. aeruginosa в сбитых с толку колбах Эрленмейера, с встряхиванием при 200 об/мин, в бульоне Лурия-Бертани (LB) при 37 °C в течение 16-20 ч. Добавьте конечную концентрацию 100 мкг/мл ампициллина в ночную культуру PAO1 (pQF50-lux) для поддержания плазмиды.
3. Субкультура P. aeruginosa путем добавления 100 мкл ночной культуры в колбу Эрленмейера, содержащую 10 мл бульона LB с конечной концентрацией 100 мкг/мл ампициллина. Затем растут в течение 2-2,5 ч при 37 °C с встряхиванием, до OD_{600 нм} 0,4, а затем последовательно разбавляют (1:10) три раза для инфектирования дозы примерно 10⁴ клеток.

2. Получение фермента диспергирования биопленки

ПРИМЕЧАНИЕ: Для этого исследования мы используем 10% раствор равных частей амилазы и целлюлазы (по 5% от каждого), который будет называться «GH», для дисперсной обработки.

1. Используйте 10% раствор ГР (мас./об.) амилазы (из Bacillus subtilis)и грибковой целлюлазы (из Aspergillus niger),разбавленный в 1x фосфатном буферном физиологическом растворе (PBS). Используйте PBS в качестве средства управления транспортным средством.
2. Согреть все процедуры до 37 °C в течение 30 минут для активации ферментов.

3. Экспериментальные животные и предоперационная установка

1. Домашние мыши, 5 пометных товарищей в клетке, в условиях, контролируемых окружающей средой, с 12-ч светлым / темным циклами и надлежащим доступом к пище и воде.
2. Предпочтительно использовать самок швейцарских мышей Вебстера в возрасте от 8 до 10 недель.
3. Взвесьте мышей, чтобы определить правильное количество анестезии для введения.
4. Вводят анестезию путем внутрибрюшинной инъекции 100 мг/кг кетамина 10 мг/кг ксилазина.
5. Осторожно нанесите крем для глаз (например, Refresh P.M.) на глаза с помощью ватного тампона, чтобы уменьшить сухость.
6. Контролируйте физиологические параметры, включая частоту дыхания, цвет кожи и температуру тела на протяжении всей операции.

4. Операция иссечения дорсальной полной толщины

1. Оценить хирургическую плоскость анестезии путем защемления носа и мониторинга частоты дыхания и усилий. Побрейте дорсальную поверхность и нанесите крем для депиляции на 10 минут (или в соответствии с инструкцией продукта), после чего аккуратно удалите, убедившись, что кожа была сухой.
2. Для лечения боли вводят 0,05 мл лидокаина подкожно в область, которая должна быть исся, и вводят 0,02 мл бупренорфина подкожно в шею. Подождите 10 минут, чтобы убедиться, что лечение боли достигнуто.
3. Перед иссечением продезинфицируйте дорсальную поверхность спиртовым тампоном и проведите круг диаметром 1,5 см к задней части спины. Поддерживайте стерильное хирургическое поле на протяжении всей процедуры и ими и ими пользуются автоклавные инструменты и стерильные перчатки. Чтобы ограничить загрязнение, проведите операцию с помощью зажженной горелки Бунзена и используйте чистые инструменты для каждого животного.
4. Ввести полную толщину, эксцизионную рану кожи до уровня мышцы панникулуса хирургическими ножницами.
5. После иссечения немедленно накройте раны полупроницаемой полиуретановой повязкой.
6. Вводят примерно 10⁴ КОЕ бактерий в 100 мкл PBS под повязку, на раневое ложе, чтобы установить инфекцию.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Раны также могут быть инфицированы несколькими видами бактерий и/или грибков одновременно или путем размещения предварительно сформированных биопленок¹²или даже санированной ткани, извлеченной из пациентов^19,на раневое ложе.
7. После заражения поместите мышей в клетку с грелками и контролируйте, пока они не восстановят свой правый рефлекс.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Убедитесь, что мыши не замерзают, так как это может привести к смерти.
8. Устанавливают раневые инфекции в течение 48 ч.
9. Ежедневно осматривайте адгезивные повязки на наличие разрывов и участков несцепление и при необходимости заменяйте их.

5. Дисперсная обработка in vivo

ПРИМЕЧАНИЕ: Здесь мы описываем введение диспергаторов путем применения серии из 3 местных растворов для орошения ран(рисунок 1). Тем не менее, протокол может быть адаптирован для других видов доставки, таких как нанесение гелей, кремов или повязок.

1. Поместите мышей под изофлурановую анестезию (при 3% и 1 л в минуту кислорода) во время лечения.
2. Приготовьте три шприца по 1 мл с иглами по 25 г, содержащими 200 мкл обработки для каждой мыши.
3. Вводят 200 мкл раствора фермента или контроля PBS в рану, осторожно поднимая и зажимая кожу щипцами, немного выше раны по направлению к голове животного. Осторожно проткните шприц через приподнятую кожу и медленно вводят раствор между повязкой и раневым ложем. Повязка, используемая в этом исследовании, часто прилипает как к раневому слою, так и к окружающим тканям.
   1. Чтобы убедиться, что все раневое ложе покрыто раствором, осторожно поднимите повязку щипцами, оттягивая ее от раневого ложа, при этом медленно вводя раствор.
4. После обработки поместите мышей обратно в клетки на 30 минут.
5. После 30 мин воздействия обработки повторно обезболивают мышей изофлураном и аспирируют раствор шприцем, убедившись, что прокол в том же месте, что и раньше.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Этот аспирированный раствор содержит дисперсные бактериальные клетки, которые могут быть сохранены для различных последующих анализов.
6. Вводите вторую и третью оросительную обработку в качестве первой, используя каждый раз новый шприц.

6. Визуализация и анализ дисперга in vivo

ПРИМЕЧАНИЕ: Если люминесцентный штамм бактерий используется для инициирования инфекции, для визуализации рассеивания из раневого дна может использоваться система визуализации In Vivo (IVIS).

1. Изображение мышей непосредственно до и после лечения и через 10 и 20 ч после обработки(рисунок 2 и дополнительный рисунок 1).
2. Выполняйте визуализацию, пока мыши находятся под наркозом, помещая их индивидуально в IVIS и визуализируя каждую из них в течение 5 с на длине волны 560 нм. Сохраните изображения для дальнейшего анализа.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Оптимальная длина волны и время экспозиции будут зависеть от используемого репортера, а также от прибора IVIS и программного обеспечения для визуализации.
3. Для анализа откройте изображения в программном обеспечении IVIS и выберите область для анализа в палитре инструментов.
4. Чтобы учесть фон, поместите круг на фон фотографии, а затем поместите круг одинакового размера поверх раневого ложа для каждой мыши.
5. Чтобы загрузить значения измерений, выберите Просмотреть измерения > области интереса (ROI) и загрузите таблицу измерений в электронную таблицу. Вычтите показания фонового круга из каждого измерения раневого ложа, чтобы рассчитать люминесценцию для каждого образца. Рассчитать процент люминесценции, измененный на:
   ROI до лечения -ROI после лечения / ROI до лечения) x 100.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Контрольные и обработанные мыши должны быть проанализированы одновременно для нормализации переменных, которые могут повлиять на получение изображения или сияние.

7. Оценка рассредоточения путем определения КОЕ

1. Гуманный усыплять мышей путем внутрибрюшинной инъекции 0,2 мл пентобарбитала натрия (например, Fatal Plus) под наркозом со 100 мг/кг кетамина 10 мг/кг ксилазина.
2. Заготовьте ткань раневого ложа, сначала аккуратно сняв повязку стерильными щипцами, а затем разрезав по периметру раневого ложа стерильными хирургическими ножницами. Осторожно поднимите один конец раневого ложа щипцами, используя ножницы, чтобы отрезать / дразнить образец от мышечного слоя.
3. Поместите ткань из раневого ложа в предварительно маркированную и предварительно взвешенную гомогенизационную трубку 2 мл, содержащую 1 мл PBS. Снова взвесьте трубки после введения образцов, а затем осторожно переверните 3-5 раз, чтобы смыть любые дисперсные или слабо прилипшие бактерии, и удалите PBS. Добавьте 1 мл свежего PBS.
4. Чтобы собрать селезенку, поместите мышей в анатомическое положение лежа на спине и закрепите, прикрепив их конечности к поверхности рассечения. Замочите область, которая будет рассечена, 70% этанолом, чтобы дезинфицировать область и предотвратить заражение образца мехом.
5. Аккуратно сделайте небольшой разрез перпендикулярно средней линии хирургическими ножницами в дерме нижней части живота, убедившись, что кожа подтягивается вверх и подальше от внутренних органов. Продолжайте разрез внутрь, вдоль средней линии, пока не будет достигнута грудина. После того, как брюшинная полость была обнажена и внутренние органы были видны, осторожно отделите селезенку от соединительной ткани и поместите в отдельную гомогенизационную трубку.
6. Взвесьте селезенку и промойте PBS, как описано для ткани раневого ложа.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Другие органы, представляющие интерес, могут быть извлечены аналогичным образом.
   1. При проведении начального разреза позаботьтесь о том, чтобы избежать проколов кишечника или других органов.
7. Гомогенизируйте образцы в предварительно заполненных шариковых мельничных трубах по 2 мл с использованием настольного гомогенизатора со скоростью 5 м/с в течение 60 с, дважды.
8. Чтобы перечислить КОЕ, последовательно разбавляйте образцы и точечные пластины на селективном агаре. Для последовательного разбавления пипетку 100 мкл образца на 900 мкл PBS в пробирке 1,5 мл, вихрь и повторите 5 раз. Пипетка 10 мкл каждого разведения на агартовую пластину, как показано на рисунке 3.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Если требуется более точное количественное уточнение КОЕ, распределите 100 мкл каждого разбавления образца по отдельным пластинам агара.

8. Оценка рассеивания ex vivo (рисунок 4)

1. Раните мышей и заражайте примерно 10⁴ PAO1, как описано выше, а затем усыпляйте через 48 ч после заражения.
2. Аккуратно снимите повязку щипцами, используя стерильную технику и не нарушая раневого ложа.
3. Используйте стерильные хирургические ножницы, чтобы отрезать периметр раневого ложа от неинфицированной кожи, используя щипцы, чтобы поднять один конец раневого ложа и ножницы, чтобы иссечь инфицированную раневую ткань из мышечного слоя под ней и окружающей неинфицированной ткани. Разделите образцы раневого ложа на равные части или используйте целиком.
4. Поместите раневую ткань в пустые, предварительно взвешенные 2 мл шариковой мельницы гомогенизирующие трубки. Затем снова взвесьте пробирки после добавления образца. Рассчитайте вес образца по:
   вес после добавления образца - вес перед добавлением образца.
5. Добавьте 1 мл PBS и осторожно переверните трубку 3-5 раз, чтобы промыть образец и удалить любые планктонные клетки. Удалите и удалите PBS.
6. Добавьте 1 мл обработки ГР (или PBS в качестве отрицательного контроля) к образцу и инкубируйте в течение 2 ч при 37 °C с встряхиванием при 80 об/мин.
7. Удалите раствор для рассеивания биопленки и поместите в отдельную пробирку 1,5 мл. Он содержит дисперсные клетки.
8. Добавьте 1 мл PBS к оставшемуся образцу ткани и осторожно инвертируйте 3-5 раз, чтобы смыть оставшиеся дисперсные клетки. Удалите и удалите PBS.
9. Добавьте 1 мл PBS к оставшейся ткани и гомогенизируйте со скоростью 5 м/с в течение 60 с с использованием настоального гомогенизатора.
10. Последовательно разбавляют раствор дисперсных клеток и гомогенизированный образец ткани, помещая 100 мкл образца в 900 мкл PBS в пробирке объемом 1,5 мл и повторяя пять раз в общей сложности 6 разведений.
11. Пятнистая пластина 10 мкл каждого разведения на селективный агар среды (например, Pseudomonas Isolation Agar для P. aeruginosa)и инкубируют пластины при 37 °C в течение ночи.
12. Подсчитайте КОЕ и рассчитайте «процент дисперсного» как (КОЕ в супернатанте/ (КОЕ в супернатанте + КОЕ в ткани биопленки)) x 100.

Результаты

В этом эксперименте 8-10-недельные самки швейцарских мышей Вебстера были инфицированы 10⁴ КОЕ PAO1, несущих люминесцентную плазмиду pQF50-lux. Как описано выше, инфекцию разрешалось устанавливать в течение 48 ч до введения 3 х 30 мин обработки либо PBS (контроль транспортного средства), либо 10% ...

Обсуждение

Здесь мы описываем протоколы, которые могут быть использованы для изучения эффективности агентов диспергирования биопленки. Эти протоколы могут быть легко адаптированы для использования с различными типами диспергирующих агентов, видами бактерий или образцами ex vivo, включая обр?...

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
1.5 mL microcentrifuge tube	Fisher	14823434	Use to complete serial dilutions of samples
25G 58 in needle	Fisher	14823434	Attaches to 1 mL syringe
Ampicillin Sodium Salt	Fisher	BP1760-5	Make a 50 mg/ mL stock solution and add 100 µL to 10 mL of LB broth for both overnight and subculture
Amylase	MP Biomedicals	2100447	Make a 5% w/v solution, vortex- other dispersal agents can be used
Buprenorphine SR-LAB 5 mL (1 mg/mL)	ZooPharm	RX216118	Use as pain mainagement- may use other options
Cellulase	MP Biomedicals	2150583	Add 5% w/v to the 5% w/v amylase solution, vortex, activate at 37 °C for 30 min- other dispersal agents can be used
Depilatory cream	Walmart	287746	Use a small amount to massage into the hair follicles on the back of the animal and allot 10 min to remove hair
Dressing Forceps, Serrated Tips	Fisher	12-460-536	Can use other forms of forceps
Erlenmeyer flasks baffled 125 mL	Fisher	101406	Use to grow overnights and sub-cultures of bacteria
FastPrep-24 Benchtop Homogenizer	MP Biomedicals	6VFV9	Use 5 m/s for 60 s two times to homogenize tissue
Fatal Plus	Vortech Pharmaceuticals	0298-9373-68	Inject 0.2 mL intraperitaneal for each mouse
Homogenizing tubes (Bead Tube 2 mL 2.4 mm Metal)	Fisher	15340151	Used to homogenize samples for plating
Isoflurane	Diamond Back Drugs
Ketamine hydrochloride/xylazine hydrochloride solution C-IIIN	Sigma Aldrich	K4138	Use as anasethia- other options can also be utilized to gain a surgical field of anasethia
LB broth, Miller	Fisher	BP1426-2	Add 25 g/L and autoclave
Lidocaine 2% Injectable	Diamond Back Drugs	2468	Inject 0.05 mL through the side of the marked wound bed area so it is deposited in the center of the mark. Allot 10 min prior to cutting
Meropenem	Sigma Aldrich	PHR1772-500MG	Make 5 mg/mL to add to the GH solution to apply topically and a 15 mg/mL solution to inject intraperitaneal 4 h prior and 6 h post-treatment
Non-sterile cotton gauze sponges	Fisher	13-761-52	Use to remove the depilatory cream
PAO1 pQF50-lux bacterial strain	Ref [13]	N/A	PAO1 pgF50-lux was used as the P. aeruginosa strain of interest in this paper's representative results
Petri dishes	Fisher	PHR1772-500MG
Phosphate Buffer Saline 10x	Fisher	BP3991	Dilute 10x to 1x prior to use
Polyurethane dressing	Mckesson	66024007	Cut the rounded edge off and cut the remaining square into 4 equal sections
Pseudomonas isolation agar	VWR	90004-394	Add 20 mL/L of glycerol and 45 g/mL to water, autoclave, and pour 20 mL into petri dishes
Refresh P.M.	Walmart		Use on eyes to reduce dryness during procedure.
Sterile Alcohol Prep Pads	Fisher	22-363-750	Use to clean the skin immediately prior to wounding to disinfect the area
Straight Delicate Scissors	Fisher	89515	Can also use curved scissors
Swiss Webster mice	Charles River	551NCISWWEB	Other mice strains can be used
Syring Slip Tip 1 mL	Fisher	14823434	Used to administer drugs and enzyme treatment