Beurteilung der Biofilmausbreitung in murinen Wunden

Zusammenfassung

Hier beschreiben wir ex vivo und in vivo Methoden zur Beurteilung der bakteriellen Ausbreitung aus einer Wundinfektion bei Mäusen. Dieses Protokoll kann verwendet werden, um die Wirksamkeit topischer antimikrobieller und Anti-Biofilm-Therapien zu testen oder die Ausbreitungskapazität verschiedener Bakterienstämme oder -arten zu bewerten.

Zusammenfassung

Biofilmbedingte Infektionen sind an einer Vielzahl chronischer Erkrankungen wie nicht heilenden diabetischen Fußgeschwüren, chronischer Sinusitis, wiederkehrender Mittelohrentzündung und vielem mehr beteiligt. Mikrobielle Zellen innerhalb dieser Infektionen werden durch eine extrazelluläre polymere Substanz (EPS) geschützt, die verhindern kann, dass Antibiotika und Wirtsimmunzellen die Infektion beseitigen. Um dieses Hindernis zu überwinden, haben die Forscher begonnen, Dispersionsmittel als potenzielle Therapeutika zu entwickeln. Diese Wirkstoffe zielen auf verschiedene Komponenten innerhalb des Biofilms EPS ab, schwächen die Struktur und initiieren die Ausbreitung der Bakterien, was theoretisch die Antibiotikapotenz und die Immunclearance verbessern kann. Um die Wirksamkeit von Dispersionsmitteln bei Wundinfektionen zu bestimmen, haben wir Protokolle entwickelt, die die Ausbreitung von Biofilmen sowohl ex vivo als auch in vivomessen. Wir verwenden ein chirurgisches Exzisionsmodell der Maus, das gut beschrieben wurde, um biofilm-assoziierte chronische Wundinfektionen zu erzeugen. Um die Ausbreitung in vivo zuüberwachen, infizieren wir die Wunden mit Bakterienstämmen, die Luciferase exprimieren. Sobald sich reife Infektionen etabliert haben, bewässern wir die Wunden mit einer Lösung, die Enzyme enthält, die Bestandteile des Biofilms EPS abbauen. Anschließend überwachen wir die Lage und Intensität des Leuchtsignals in den Wund- und Filterorganen, um Informationen über den erreichten Ausbreitungsgrad zu erhalten. Für die Ex-vivo-Analyse der Biofilmausbreitung wird infiziertes Wundgewebe in biofilmabbauende Enzymlösung getaummt, wonach die im Gewebe verbleibende Bakterienlast im Vergleich zur Bakterienlast in Lösung bewertet wird. Beide Protokolle haben Stärken und Schwächen und können optimiert werden, um die Wirksamkeit von Ausbreitungsbehandlungen genau zu bestimmen.

Einleitung

Der Anstieg der Antibiotikaresistenz weltweit führt zu einem Mangel an Antibiotika-Optionen zur Behandlung einer Vielzahl von bakteriellen Infektionen¹. Zusätzlich zur Antibiotikaresistenz können Bakterien eine Antibiotikatoleranz erlangen, indem sie einen Biofilm-assoziierten Lebensstil^{annehmen 2}. Ein Biofilm ist eine Gemeinschaft von Mikroorganismen, die durch eine Matrix aus Polysacchariden, extrazellulärer DNA, Lipiden und Proteinen³geschützt sind, die zusammen als extrazelluläre polymere Substanz (EPS) bezeichnet werden. Da die Antibiotikaresistenzkrise andauert, werden neue Strategien, die den Einsatz von Antibiotika verlängern oder die Wirksamkeit von Antibiotika potenzieren, dringend benötigt. Anti-Biofilm-Wirkstoffe sind eine vielversprechende Lösung⁴.

Unter den verschiedenen Anti-Biofilm-Strategien, die vorgeschlagen wurden, steht die Verwendung von Dispersionsmitteln, die auf verschiedene Komponenten des Biofilm-EPS abzielen, an der Spitze der therapeutischen Entwicklung⁵. Glykosidhydrolasen (GH) sind eine solche Klasse von Dispersionsmitteln. GH sind eine große Klasse von Enzymen, die die Spaltung verschiedener Bindungen innerhalb der Polysaccharide katalysieren, die dem EPS strukturelle Integrität verleihen. Unsere Gruppe und andere haben gezeigt, dass GH Biofilme effektiv abbauen, Ausbreitung induzieren und die Antibiotikawirksamkeit für eine Reihe verschiedener Bakterienarten verbessern kann, sowohl in vitro als auch in vivo^{6,7,8,9,10,11}.

Mit einem wachsenden Interesse an der Ausbreitung von Biofilmen ist es wichtig, wirksame Methoden zu entwickeln, die die Ausbreitungseffizienz bewerten. Hier präsentieren wir ein detailliertes Protokoll zur Behandlung von Biofilm-assoziierten Wundinfektionen mit einem Ausbreitungsmittel bei Mäusen und die Beurteilung der Ausbreitungswirksamkeit, in vivo und ex vivo. Das übergeordnete Ziel ist es, effektive Methoden bereitzustellen, die mit präklinischen Modellen verwendet werden können, um die Biofilmausbreitung effektiv und effizient zu messen.

Ein murines chirurgisches Exzisionsinfektionsmodell wurde in diesen Studien verwendet, um eine Biofilm-assoziierte Infektion zu etablieren. Wir verwenden dieses Modell seit über 15 Jahren und veröffentlichen unsere Beobachtungen ausführlich^{7,9,12,13,14,15,16,17,18,19,20,21}. Im Allgemeinen ist dies ein nicht-tödliches Infektionsmodell, bei dem Bakterien im Wundbett lokalisiert bleiben und biofilm-assoziiert sind (Bakterien in Aggregaten, die von EPS umgeben sind), was zu einer chronischen Infektion führt, die bis zu 3 Wochen dauert. Wenn Mäuse jedoch immungeschwächt sind (z. B. mit Typ-1-Diabetes), können sie in diesem Modell anfälliger für die Entwicklung einer tödlichen systemischen Infektion werden.

In diesem Bericht stellen wir Protokolle zur Beurteilung der Ausbreitung von Bakterien aus einer Wunde sowohl in vivo als auch ex vivo zur Verfügung. Beide Protokolle können verwendet werden, um die Wirksamkeit eines Dispersionsmittels zu untersuchen und haben ihre eigenen Stärken und Schwächen. Zum Beispiel kann die Beurteilung der Ausbreitung in vivo wichtige Echtzeitinformationen über die Ausbreitung von Bakterien auf andere Teile des Körpers nach der Ausbreitung liefern und wie der Wirt reagiert. Auf der anderen Seite kann die Beurteilung der Ausbreitung ex vivo für das Screening mehrerer Wirkstoffe, Dosen oder Formulierungen wünschenswerter sein, da das Gewebe in mehrere Abschnitte unterteilt werden kann, die separat getestet werden können, wodurch die Anzahl der benötigten Mäuse reduziert wird. Bei der Beurteilung mehrerer Wirkstoffe messen wir typischerweise die Ausbreitung zuerst in vitro, wie zuvor beschrieben ^6,9,22. Wir testen dann die effektivsten ex vivo und reservieren in vivo Tests für eine begrenzte Anzahl von sehr vielversprechenden Wirkstoffen.

Protokoll

Dieses Tierprotokoll wurde vom Institutional Animal Care and Use Committee des Texas Tech University Health Sciences Center (Protokollnummer 07044) überprüft und genehmigt. Diese Studie wurde in strikter Übereinstimmung mit den Empfehlungen des Leitfadens für die Pflege und Verwendung von Labortieren der National Institutes of Health durchgeführt.

1. Bakterien auf Mausinfektionen vorbereiten

HINWEIS: Hier beschreiben wir die Infektion von Mäusen nur mit Pseudomonas aeruginosa. Andere Bakterienarten können jedoch verwendet werden, um eine Infektion zu verursachen. Bakterienstämme und -materialien sind in der Materialtabelle aufgeführt.

1. Verwenden Sie Pseudomonas aeruginosa Wildtyp-Stamm PAO1, der das Lumineszenzplasmid pQF50-lux²³ für diese Experimente trägt, wie zuvor beschrieben⁷.
2. P. aeruginosa-Stämme in verblüfften Erlenmeyerkolben mit Schütteln bei 200 U/min in Luria-Bertani (LB)-Brühe bei 37 °C für 16 bis 20 h züchten. Fügen Sie der Nachtkultur von PAO1 (pQF50-lux) eine Endkonzentration von 100 μg/ ml Ampicillin hinzu, um das Plasmid zu erhalten.
3. Subkultur P. aeruginosa durch Zugabe von 100 μL der Nachtkultur in einen Erlenmeyerkolben mit 10 ml LB-Brühe mit einer Endkonzentration von 100 μg/ml Ampicillin. Dann 2-2,5 h bei 37 °C unter Schütteln auf einen OD_{600 nm} von 0,4 wachsen und dann für eine infektiöse Dosis von etwa 10 4 Zellen dreimal seriell verdünnen (1:10).

2. Herstellung des Biofilm-Dispersionsenzyms

HINWEIS: Für diese Studie verwenden wir eine 10% ige Lösung aus gleichen Teilen Amylase und Cellulase (jeweils 5%), die als "GH" bezeichnet wird, für die Ausbreitungsbehandlung.

1. Verwenden Sie eine 10% ige GH-Lösung (w/v) von Amylase (aus Bacillus subtilis)und Pilzcellulase (aus Aspergillus niger),verdünnt in 1x Phosphatpuffersalzlösung (PBS). Verwenden Sie PBS als Fahrzeugsteuerungsbehandlung.
2. Alle Behandlungen für 30 min zur Enzymaktivierung auf 37 °C erwärmen.

3. Versuchstiere und präoperativer Aufbau

1. Hausmäuse, 5 Wurfgefährten pro Käfig, unter umweltkontrollierten Bedingungen, mit 12 h Hell-Dunkel-Zyklen und richtigem Zugang zu Nahrung und Wasser.
2. Verwenden Sie vorzugsweise weibliche Schweizer Webster-Mäuse, die zwischen 8 und 10 Wochen alt sind.
3. Wiegen Sie Mäuse, um die richtige Menge an Anästhesie zu bestimmen.
4. Anästhesie durch intraperitoneale Injektion von 100 mg/kg Ketamin 10 mg/kg Xylazin verabreichen.
5. Tragen Sie die Augencreme (z. B. Refresh P.M.) vorsichtig mit einem Wattestäbchen auf das Auge auf, um die Trockenheit zu reduzieren.
6. Überwachen Sie physiologische Parameter wie Atemfrequenz, Hautfärbung und Körpertemperatur während der gesamten Operation.

4. Dorsale Exzisionschirurgie mit voller Dicke

1. Beurteilen Sie die chirurgische Ebene der Anästhesie durch Zehenklemme und Überwachung der Atemfrequenz und -anstrengung. Rasieren Sie die dorsale Oberfläche und tragen Sie eine Enthaarungscreme für 10 Minuten (oder gemäß den Anweisungen des Produkts) auf, wonach Sie sie sanft entfernen und sicherstellen, dass die Haut trocken ist.
2. Zur Schmerzbehandlung 0,05 ml Lidocain subkutan in den zu entfernenden Bereich verabreichen und 0,02 ml Buprenorphin subkutan in den Halsspritze injizieren. Warten Sie 10 Minuten, um sicherzustellen, dass die Schmerzbehandlung erreicht wurde.
3. Vor der Exzision die dorsale Oberfläche mit einem Alkoholtupfer desinfizieren und einen Kreis mit einem Durchmesser von 1,5 cm in Richtung des hinteren Teils des Rückens ziehen. Pflegen Sie während des gesamten Eingriffs ein steriles Operationsfeld und verwenden Sie autoklavierte Instrumente und sterile Handschuhe. Um die Kontamination zu begrenzen, führen Sie die Operation mit einem beleuchteten Bunsenbrenner durch und verwenden Sie saubere Werkzeuge für jedes Tier.
4. Verabreichen Sie eine hautgroße, exzisive Hautwunde auf das Niveau des Panniculus-Muskels mit einer chirurgischen Schere.
5. Nach der Exzision die Wunden sofort mit einem semipermeablen Polyurethanverband abdecken.
6. Injizieren Sie etwa 10⁴ KBE Bakterien in 100 μL PBS unter dem Verband auf das Wundbett, um eine Infektion zu etablieren.
   HINWEIS: Wunden können auch mit mehreren Bakterienarten und / oder Pilzen gleichzeitig infiziert werden, oder indem vorgeformte Biofilme¹²oder sogar Debridementgewebe von Patienten¹⁹auf das Wundbett gelegt werden.
7. Legen Sie die Mäuse nach der Infektion in einen Käfig mit Heizkissen und überwachen Sie, bis sie ihren Aufrichtreflex wiedererlangt haben.
   HINWEIS: Stellen Sie sicher, dass Mäuse nicht erkältet werden, da dies zum Tod führen kann.
8. Stellen Sie Wundinfektionen für 48 h fest.
9. Überprüfen Sie die Klebeverbände täglich auf Risse und Bereiche mit Nichthaftung und ersetzen Sie sie bei Bedarf.

5. In-vivo-Ausbreitungsbehandlung

HINWEIS: Hier beschreiben wir die Verabreichung der Dispersionsmittel durch Anwendung einer Reihe von 3 topischen Wundbewässerungslösungen (Abbildung 1). Das Protokoll kann jedoch für andere Arten der Verabreichung wie das Auftragen von Gelen, Cremes oder Dressings angepasst werden.

1. Legen Sie Mäuse während der Verabreichung der Behandlungen unter Isoflurananästhesie (bei 3% und 1 L pro Minute Sauerstoff).
2. Bereiten Sie drei 1-ml-Spritzen mit 25 G-Nadeln vor, die 200 μL Behandlung für jede Maus enthalten.
3. Injizieren Sie 200 μL Enzymlösung oder PBS-Kontrolle auf die Wunde, indem Sie die Haut vorsichtig mit einer Zette etwas oberhalb der Wunde in Richtung des Kopfes des Tieres anheben und einklemmen. Stechen Sie die Spritze vorsichtig durch die angehobene Haut und injizieren Sie die Lösung langsam zwischen dem Verband und dem Wundbett. Der in dieser Studie verwendete Verband haftet oft sowohl am Wundbett als auch am umgebenden Gewebe.
   1. Um sicherzustellen, dass das gesamte Wundbett mit Lösung bedeckt ist, heben Sie den Verband vorsichtig mit einer Zette an, ziehen Sie ihn vom Wundbett weg, während Sie die Lösung langsam injizieren.
4. Nach der Behandlung legen Sie die Mäuse für 30 Minuten wieder in ihre Käfige.
5. Nach 30 Minuten Exposition gegenüber der Behandlung die Mäuse erneut mit Isofluran betäuben und die Lösung mit einer Spritze absaugen, wobei Sie sicherstellen, dass sie im selben Bereich wie zuvor punktiert wird.
   HINWEIS: Diese aspirierte Lösung enthält dispergierte Bakterienzellen, die für verschiedene nachgeschaltete Analysen gespeichert werden können.
6. Verabreichen Sie die zweite und dritte Bewässerungsbehandlung als erste, wobei Sie jedes Mal eine neue Spritze verwenden.

6. In-vivo-Ausbreitungsbildgebung und -analyse

HINWEIS: Wenn ein lumineszierender Bakterienstamm verwendet wird, um eine Infektion auszulösen, kann ein In Vivo Imaging System (IVIS) verwendet werden, um die Ausbreitung aus dem Wundbett zu visualisieren.

1. Bild von Mäusen unmittelbar vor und nach der Behandlung und nach 10 und 20 Stunden nach der Behandlung (Abbildung 2 und ergänzende Abbildung 1).
2. Führen Sie die Bildgebung durch, während Mäuse unter Betäubung stehen, indem Sie sie einzeln in das IVIS legen und jede für 5 s bei einer Wellenlänge von 560 nm abbilden. Speichern Sie Bilder zur weiteren Analyse.
   HINWEIS: Die optimale Wellenlänge und Belichtungszeit hängt vom verwendeten Reporter und dem IVIS-Instrument und der Bildgebungssoftware ab.
3. Zur Analyse öffnen Sie Bilder in der IVIS-Software und wählen den zu analysierenden Bereich in der Werkzeugpalette aus.
4. Um den Hintergrund zu berücksichtigen, platzieren Sie einen Kreis auf dem Hintergrund eines Fotos und platzieren Sie dann den gleich großen Kreis auf dem Wundbett für jede Maus.
5. Um Messwerte hochzuladen, wählen Sie View -> Region of Interest (ROI)-Messungen (Region of Interest) und laden Sie die Messtabelle in eine Tabelle hoch. Subtrahieren Sie den Hintergrundkreiswert von jeder der Wundbettmessungen, um die Lumineszenz für jede Probe zu berechnen. Berechnen Sie die prozentuale Lumineszenz, die sich geändert hat durch:
   ROI Vorbehandlung-ROI Nachbehandlung/ ROI Vorbehandlung) x 100.
   HINWEIS: Kontroll- und behandelte Mäuse sollten gleichzeitig analysiert werden, um variablen zu normalisieren, die die Bildaufnahme oder Die Strahlungsstärke beeinflussen können.

7. Bewertung der Ausbreitung durch Bestimmung der KBE

1. Mäuse durch intraperitoneale Injektion von 0,2 ml Pentobarbitalnatrium (z. B. Fatal Plus) unter Anästhesie mit 100 mg/kg Ketamin 10 mg/kg Xylazin human einschläfern.
2. Ernten Sie Wundbettgewebe, indem Sie zuerst den Verband vorsichtig mit einer sterilen Handzette entfernen und dann mit einer sterilen chirurgischen Schere um den Umfang des Wundbettes schneiden. Heben Sie vorsichtig ein Ende des Wundbettes mit einer Zette an, während Sie die Probe mit einer Schere von der Muskelschicht abschneiden / necken.
3. Legen Sie das Gewebe aus dem Wundbett in ein vormarkiertes und vorgewogenes 2-ml-Homogenisierungsröhrchen mit 1 ml PBS. Wiegen Sie die Röhrchen nach dem Einsetzen der Proben erneut und kehren Sie dann vorsichtig 3-5 Mal um, um dispergierte oder lose anhaftende Bakterien abzuspülen, und entfernen Sie das PBS. Fügen Sie 1 ml frisches PBS hinzu.
4. Um die Milz zu ernten, legen Sie Mäuse in eine anatomische Rückenlage und sichern Sie sie, indem Sie ihre Extremitäten an eine Sezieroberfläche heften. Weichen Sie den zu sezierenden Bereich mit 70% Ethanol ein, um den Bereich zu desinfizieren und zu verhindern, dass das Fell die Probe kontaminiert.
5. Machen Sie vorsichtig einen kleinen Schnitt senkrecht zur Mittellinie mit einer chirurgischen Schere in der Dermis des Unterbauchs und achten Sie darauf, die Haut von den inneren Organen nach oben und weg zu ziehen. Setzen Sie den Schnitt innerlich entlang der Mittellinie fort, bis das Brustbein erreicht ist. Sobald die Peritonealhöhle freigelegt war und die inneren Organe sichtbar waren, trennen Sie die Milz vorsichtig vom Bindegewebe und legen Sie sie in ein separates Homogenisierungsröhrchen.
6. Milz wiegen und mit PBS abspülen, wie für das Wundbettgewebe beschrieben.
   HINWEIS: Andere Organe von Interesse können in ähnlicher Weise entnommen werden.
   1. Achten Sie beim ersten Schnitt darauf, dass der Darm oder andere Organe nicht punktiert werden.
7. Homogenisieren Sie Proben in 2 ml vorgefüllten Perlenmühlenröhrchen mit einem Tischhomogenisator bei 5 m/s für 60 s zweimal.
8. Um die KBE aufzuzählen, verdünnen Sie Proben und Spot-Plate seriell auf selektivem Agar. Zur seriellen Verdünnung 100 μL der Probe in 900 μL PBS in einem 1,5 ml Röhrchen, Wirbel, pipetten und 5 Mal wiederholen. Pipetten Sie 10 μL jeder Verdünnung auf eine Agarplatte, wie in Abbildung 3 dargestellt.
   HINWEIS: Wenn eine genauere CFU-Quantifizierung erforderlich ist, verteilen Sie 100 μL jeder Verdünnung der Probe auf separate Agarplatten.

8. Ex-vivo-Bewertung der Ausbreitung (Abbildung 4)

1. Verwundete Mäuse und infizieren Sie sich mit etwa 10⁴ PAO1 wie oben beschrieben, und euthanasieren Sie dann 48 h nach der Infektion.
2. Entfernen Sie den Verband vorsichtig mit einer Zette, mit steriler Technik und ohne das Wundbett zu stören.
3. Verwenden Sie eine sterile chirurgische Schere, um den Umfang des Wundbettes von der nicht infizierten Haut wegzuschneiden, indem Sie mit einer Ziffe ein Ende des Wundbettes anheben, und eine Schere, um infiziertes Wundgewebe aus der Muskelschicht unter und um das nicht infizierte Gewebe zu entfernen. Wundbettproben in gleiche Teile aufteilen oder ganz verwenden.
4. Wundgewebe in leere, vorgewogene 2 mL Perlenmühle Homogenisierungsröhrchen geben. Wiegen Sie die Röhrchen nach dem Hinzufügen der Probe erneut. Berechnen Sie das Gewicht der Probe wie:
   Gewicht nach dem Hinzufügen der Probe - Gewicht vor dem Hinzufügen der Probe.
5. Fügen Sie 1 ml PBS hinzu und kehren Sie das Röhrchen 3-5 Mal vorsichtig um, um die Probe zu spülen und alle planktonischen Zellen zu entfernen. Entfernen und verwerfen Sie das PBS.
6. 1 ml GH-Behandlung (oder PBS als Negativkontrolle) in die Probe geben und 2 h bei 37 °C mit Schütteln bei 80 U/min inkubieren.
7. Entfernen Sie die Biofilm-Dispergierlösung und legen Sie sie in ein separates 1,5-ml-Röhrchen. Diese enthält die dispergierten Zellen.
8. Fügen Sie 1 ml PBS zur verbleibenden Gewebeprobe hinzu und kehren Sie vorsichtig 3-5 Mal um, um die verbleibenden dispergierten Zellen abzuspülen. Entfernen und verwerfen Sie das PBS.
9. Fügen Sie 1 ml PBS zum verbleibenden Gewebe hinzu und homogenisieren Sie mit 5 m/s für 60 s mit einem Tischhomogenisator.
10. Verdünnen Sie die Lösung der dispergierten Zellen und die homogenisierte Gewebeprobe seriell, indem Sie 100 μL der Probe in 900 μL PBS in einem 1,5-ml-Röhrchen geben und fünfmal für insgesamt 6 Verdünnungen wiederholen.
11. Spotplatte 10 μL jeder Verdünnung auf medienselektives Agar (z. B. Pseudomonas Isolation Agar für P. aeruginosa) und inkubieren die Platten bei 37 °C über Nacht.
12. Zählen Sie die CFU und berechnen Sie den "prozentual dispergierten" als (CFU im Überstand/ (CFU im Überstand+ CFU im Biofilmgewebe)) x 100.

Ergebnisse

In diesem Experiment wurden 8-10 Wochen alte weibliche Schweizer Webster-Mäuse mit 10⁴ KBE PAO1 infiziert, die das Lumineszenzplasmid pQF50-lux trugen. Wie oben beschrieben, durfte eine Infektion für 48 h etabliert werden, bevor 3 x 30 Minuten Behandlungen von entweder PBS (Fahrzeugkontrolle) oder 10% GH (Behandlung) verabreicht wurden, um das Biofilm-EPS zu verdauen. Mäuse wurden vor der Behandlung, direkt nach der Behandlung (0 h) und nach 10 h und 20 h nach der Behandlung abgebildet.

Diskussion

Hier beschreiben wir Protokolle, mit denen die Wirksamkeit von Biofilm-Dispersionsmitteln untersucht werden kann. Diese Protokolle können leicht an die Verwendung mit verschiedenen Arten von Ausbreitungsmitteln, Bakterienarten oder Ex-vivo-Proben, einschließlich klinischer Debridementproben, angepasst werden. Dieses Protokoll bietet auch ein klinisch relevantes Modell zur Sammlung und Untersuchung verteilter Bakterienzellen. Es wurde gezeigt, dass sich die Phänotypen verteilter Bakterienzellen von denen der p...

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
1.5 mL microcentrifuge tube	Fisher	14823434	Use to complete serial dilutions of samples
25G 58 in needle	Fisher	14823434	Attaches to 1 mL syringe
Ampicillin Sodium Salt	Fisher	BP1760-5	Make a 50 mg/ mL stock solution and add 100 µL to 10 mL of LB broth for both overnight and subculture
Amylase	MP Biomedicals	2100447	Make a 5% w/v solution, vortex- other dispersal agents can be used
Buprenorphine SR-LAB 5 mL (1 mg/mL)	ZooPharm	RX216118	Use as pain mainagement- may use other options
Cellulase	MP Biomedicals	2150583	Add 5% w/v to the 5% w/v amylase solution, vortex, activate at 37 °C for 30 min- other dispersal agents can be used
Depilatory cream	Walmart	287746	Use a small amount to massage into the hair follicles on the back of the animal and allot 10 min to remove hair
Dressing Forceps, Serrated Tips	Fisher	12-460-536	Can use other forms of forceps
Erlenmeyer flasks baffled 125 mL	Fisher	101406	Use to grow overnights and sub-cultures of bacteria
FastPrep-24 Benchtop Homogenizer	MP Biomedicals	6VFV9	Use 5 m/s for 60 s two times to homogenize tissue
Fatal Plus	Vortech Pharmaceuticals	0298-9373-68	Inject 0.2 mL intraperitaneal for each mouse
Homogenizing tubes (Bead Tube 2 mL 2.4 mm Metal)	Fisher	15340151	Used to homogenize samples for plating
Isoflurane	Diamond Back Drugs
Ketamine hydrochloride/xylazine hydrochloride solution C-IIIN	Sigma Aldrich	K4138	Use as anasethia- other options can also be utilized to gain a surgical field of anasethia
LB broth, Miller	Fisher	BP1426-2	Add 25 g/L and autoclave
Lidocaine 2% Injectable	Diamond Back Drugs	2468	Inject 0.05 mL through the side of the marked wound bed area so it is deposited in the center of the mark. Allot 10 min prior to cutting
Meropenem	Sigma Aldrich	PHR1772-500MG	Make 5 mg/mL to add to the GH solution to apply topically and a 15 mg/mL solution to inject intraperitaneal 4 h prior and 6 h post-treatment
Non-sterile cotton gauze sponges	Fisher	13-761-52	Use to remove the depilatory cream
PAO1 pQF50-lux bacterial strain	Ref [13]	N/A	PAO1 pgF50-lux was used as the P. aeruginosa strain of interest in this paper's representative results
Petri dishes	Fisher	PHR1772-500MG
Phosphate Buffer Saline 10x	Fisher	BP3991	Dilute 10x to 1x prior to use
Polyurethane dressing	Mckesson	66024007	Cut the rounded edge off and cut the remaining square into 4 equal sections
Pseudomonas isolation agar	VWR	90004-394	Add 20 mL/L of glycerol and 45 g/mL to water, autoclave, and pour 20 mL into petri dishes
Refresh P.M.	Walmart		Use on eyes to reduce dryness during procedure.
Sterile Alcohol Prep Pads	Fisher	22-363-750	Use to clean the skin immediately prior to wounding to disinfect the area
Straight Delicate Scissors	Fisher	89515	Can also use curved scissors
Swiss Webster mice	Charles River	551NCISWWEB	Other mice strains can be used
Syring Slip Tip 1 mL	Fisher	14823434	Used to administer drugs and enzyme treatment