Murine Yaralarında Biyofilm Dağılımının Değerlendirilmesi

Özet

Burada, farelerdeki bir yara enfeksiyonundan bakteriyel dağılımı değerlendirmek için ex vivo ve in vivo yöntemlerini açıklıyoruz. Bu protokol, topikal antimikrobiyal ve anti-biyofilm tedavilerinin etkinliğini test etmek veya farklı bakteri suşlarının veya türlerinin dağılım kapasitesini değerlendirmek için kullanılabilir.

Özet

Biyofilme bağlı enfeksiyonlar, iyileşmeyen diyabetik ayak ülserleri, kronik sinüzit, tekrarlayan otitis media ve daha fazlası gibi çok çeşitli kronik durumlara bulaşmıştır. Bu enfeksiyonların içindeki mikrobiyal hücreler, antibiyotiklerin ve konak bağışıklık hücrelerinin enfeksiyonu temizlemesini önleyebilen hücre dışı polimerik bir madde (EPS) ile korunmaktadır. Bu engeli aşmak için, araştırmacılar potansiyel terapötikler olarak dispersiyon ajanları geliştirmeye başladılar. Bu ajanlar biyofilm EPS içindeki çeşitli bileşenleri hedef alarak yapıyı zayıflatır ve teorik olarak antibiyotik gücünü ve bağışıklık açıklığını artırabilen bakterilerin dağılmasını başlatır. Dispersiyon ajanlarının yara enfeksiyonları için etkinliğini belirlemek için, biyofilm dispersiyonunu ölçen protokoller geliştirdik hem ex vivo hem de in vivo . Biyofilm ile ilişkili kronik yara enfeksiyonları oluşturmak için iyi tanımlanmış bir fare cerrahi eksizyon modeli kullanıyoruz. Dispersiyon in vivoizlemek için, yaralara luciferaz eksprese bakteriyel suşları bulaştırırız. Olgun enfeksiyonlar ortaya çıktıktan sonra, yaraları biyofilm EPS bileşenlerini bozan enzimler içeren bir çözelti ile sularız. Daha sonra elde edilen dağılım seviyesi hakkında bilgi sağlamak için yara ve filtreleme organlarındaki parlaklık sinyalinin yerini ve yoğunluğunu izliyoruz. Biyofilm dispersiyonunun ex vivo analizi için, enfekte yara dokusu biyofilm bozan enzim çözeltisi içine batırılır, daha sonra dokuda kalan bakteri yükü ile çözeltideki bakteri yükü değerlendirilir. Her iki protokol de güçlü ve zayıf yönleri vardır ve dağılım tedavilerinin etkinliğini doğru bir şekilde belirlemeye yardımcı olmak için optimize edilebilir.

Giriş

Dünya çapında antibiyotik direncinin artması, çeşitli bakteriyel enfeksiyonları tedavi etmek için antibiyotik seçeneklerinin eksikliğine yol açar¹. Antibiyotik direncine ek olarak, bakteriler biyofilm ile ilişkili bir yaşam tarzı benimseyerek antibiyotik toleransı kazanabilir². Biyofilm, toplu olarak hücre dışı polimerik madde (EPS) olarak adlandırılan polisakkaritler, hücre dışı DNA, lipitler ve^{proteinler 3}matrisi ile korunan bir mikroorganizma topluluğudur. Antibiyotik direnci krizi devam ettikçe, antibiyotiklerin kullanımını uzatan veya etkinliğini etkileyen yeni stratejilere şiddetle ihtiyaç vardır. Anti-biyofilm ajanları umut verici bir çözümdür⁴.

Önerilen farklı anti-biyofilm stratejileri arasında, biyofilm EPS'nin farklı bileşenlerini hedefleyen dispersal ajanların kullanımı terapötik gelişimin ön saflarında yer almaktadır⁵. Glikozit hidrolazları (GH) bu tür bir dispersiyon maddesi sınıfıdır. GH, EPS'ye yapısal bütünlük sağlayan polisakkaritler içindeki farklı bağların bölünmesini katalİze eden büyük bir enzim sınıfıdır. Grubumuz ve diğerleri, GH'nin biyofilmleri etkili bir şekilde bozabileceğini, dağılmayı teşvik edebildiği ve hem in vitro hem de in vivo6 , 7 ,⁸,^9,10,11gibi bir dizi farklı bakteri türü için antibiyotik etkinliğini artırabileceğini göstermiştir.

Biyofilm dispersiyona artan bir ilgi ile, dispersiyon etkinliğini değerlendiren etkili yöntemler geliştirmek önemlidir. Burada, farelerde bir dispersiyon ajanı ile biyofilm ilişkili yara enfeksiyonlarının tedavisi ve dağılım etkinliğinin değerlendirilmesi için ayrıntılı bir protokol sunuyoruz, in vivo ve ex vivo. Genel amaç, biyofilm dağılımını etkili ve verimli bir şekilde ölçmek için preklinik modellerle kullanılabilecek etkili yöntemler sağlamaktır.

Bu çalışmalarda biyofilm ilişkili bir enfeksiyon oluşturmak için bir murine cerrahi eksizyon enfeksiyon modeli kullanılmıştır. Biz 15 yılı aşkın bir süredir bu modeli kullandık ve gözlemlerimizi kapsamlı bir şekilde yayınladık^{7,9,12,13,14,15,16,17,18,19,20,21}. Genel olarak, bu, bakterilerin yara yatağına lokalize kaldığı ve biyofilm ile ilişkili olduğu (EPS ile çevrili agregalarda görülen bakteriler), 3 haftaya kadar süren kronik bir enfeksiyon oluşturan ölümcül olmayan bir enfeksiyon modelidir. Bununla birlikte, fareler bağışıklık sistemik olarak (örneğin Tip 1 diyabet ile) bağışıklık kazanırsa, bu modelde ölümcül bir sistemik enfeksiyon geliştirmeye daha duyarlı hale gelebilirler.

Bu raporda, hem in vivo hem de ex vivo bir yaradan bakterilerin dağılımını değerlendirmek için protokoller sunuyoruz. Her iki protokol de bir dağılım ajanının etkinliğini incelemek ve kendi güçlü ve zayıf yönlerine sahip olmak için kullanılabilir. Örneğin, dağılım in vivo'nun değerlendirilmesi, bakterilerin dağıldıktan sonra vücudun diğer bölgelerine yayılması ve konağın nasıl tepki verdiği hakkında önemli, gerçek zamanlı bilgiler sağlayabilir. Öte yandan, dispersiyon ex vivo'nun değerlendirilmesi, doku ayrı ayrı test edilebilen birden fazla bölüme ayrılabileceğinden, gerekli fare sayısını azaltabileceğinden, birden fazla ajanın, dozun veya formülasyonun taranması için daha arzu edilebilir. Birden fazla ajanı değerlendirirken, genellikle daha önce açıklandığı gibi dispersiyon ilk in vitro ölçüldü ^6,9,22. Daha sonra en etkili ex vivo'yu test ediyoruz ve sınırlı sayıda çok umut verici ajan için in vivo testini ayırıyoruz.

Protokol

Bu hayvan protokolü Texas Tech Üniversitesi Sağlık Bilimleri Merkezi Kurumsal Hayvan Bakım ve Kullanım Komitesi (protokol numarası 07044) tarafından gözden geçirilmiş ve onaylanmıştır. Bu çalışma, Ulusal Sağlık Enstitüleri Laboratuvar Hayvanlarının Bakımı ve Kullanımı Kılavuzu'ndaki önerilere uygun olarak gerçekleştirildi.

1. Fare enfeksiyonlarına bakteri hazırlama

NOT: Burada fareleri sadece Pseudomonas aeruginosaile enfekte etmeyi açıklıyoruz. Bununla birlikte, enfeksiyona neden olmak için diğer bakteri türleri kullanılabilir. Bakteriyel suşlar ve malzemeler Malzeme Tablosunda ayrıntılı olarak yer almaktadır.

1. Daha önce açıklandığı gibi bu deneyler için lüminesans plazmid pQF50-lux²³ taşıyan Pseudomonas aeruginosa vahşi tip suşu PAO1 kullanın⁷.
2. 16 ila 20 saat boyunca 37 °C'de Luria-Bertani (LB) suyunda, 200 rpm'de sallanarak, şaşkın Erlenmeyer şişelerinde P. aeruginosa suşlarını yetiştirin. Plazmid'in bakımı için PAO1(pQF50-lux) geceleme kültürüne 100 μg/mL ampisilin son konsantrasyonu ekleyin.
3. Alt kültür P. aeruginosa, 100 μg/mL ampisilin konsantrasyonuna sahip 10 mL LB suyu içeren bir Erlenmeyer şişesine 100 μL geceleme kültürü ekleyerek. Daha sonra sallama ile 37 ° C'de 2-2.5 saat boyunca_{büyüyün, 0.4'ün 600 nm'si} bir OD'ye ve ardından yaklaşık 10 4 hücreli bir enfekte doz için üç kez seri olarak seyreltin (1:10).

2. Biyofilm dispersiyon enziminin hazırlanması

NOT: Bu çalışma için dispersiyon tedavisi için "GH" olarak adlandırılacak eşit parça amilaz ve selüloz (her birinin% 5'i) %10'luk bir çözelti kullanıyoruz.

1. 1x fosfat tampon salin (PBS) ile seyreltilmiş% 10 GH çözeltisi (bacillus altyazısından)ve mantar selülalü (Aspergillus nijer'den)kullanın. Araç kontrol tedavisi olarak PBS kullanın.
2. Enzim aktivasyonu için tüm tedavileri 30 dakika boyunca 37 °C'ye ısıtın.

3. Deneysel hayvanlar ve ameliyat öncesi kurulum

1. Ev fareleri, kafes başına 5 çöp arkadaşı, çevre kontrollü koşullarda, 12 saat açık / karanlık döngüler ve yiyecek ve suya uygun erişim.
2. Tercihen, 8 ila 10 haftalık dişi İsviçre Webster fareleri kullanın.
3. Uygulanacak uygun anestezi miktarını belirlemek için fareleri tartın.
4. 100 mg/kg ketamin 10 mg/kg ksilazinin intraperitoneal enjeksiyonu ile anestezi uygulayın.
5. Kuruluğu azaltmak için pamuklu çubuk kullanarak göze dikkatlice göz kremi (örneğin, Tazele P.M.) uygulayın.
6. Ameliyat boyunca solunum hızı, cilt renklendirmesi ve vücut ısısı dahil olmak üzere fizyolojik parametreleri izleyin.

4. Dorsal tam kalınlık eksizyon cerrahisi

1. Anestezinin cerrahi düzlemini parmak sıkışması ve solunum hızı ve çabasının izlenmesi ile değerlendirin. Sırt yüzeyini tıraş edin ve cildin kurumasını sağlamak için 10 dakika (veya ürünün talimatlarına göre) bir depilatör krem uygulayın, ardından hafifçe çıkarın.
2. Ağrı yönetimi için, eksize edilecek bölgeye 0,05 mL lidokin deri altı uygular ve boynun scruff'ına deri altından 0,02 mL buprenorfin enjekte edin. Ağrı yönetimine ulaşıldığından emin olmak için 10 dakika bekleyin.
3. Eksizyondan önce, dorsal yüzeyi bir alkol çubuğu kullanarak dezenfekte edin ve sırtın arka kısmına doğru 1,5 cm çapında bir daire çizin. İşlem boyunca steril bir cerrahi alan sağlayın ve otoklavlı aletler ve steril eldivenler kullanın. Kontaminasyonu sınırlamak için, ameliyatı aydınlatılmış bir Bunsen brülörü ile yapın ve her hayvan için temiz aletler kullanın.
4. Cerrahi makasla panniculus kas seviyesine tam kalınlıklı, eksizyonel bir cilt yarası sürün.
5. Eksizyondan sonra, yaraları hemen yarı geçirgen bir poliüretan pansuman ile örtün.
6. Bir enfeksiyon oluşturmak için pansumanın altındaki 100 μL PBS'de yaklaşık 10⁴ CFU bakteriyi yara yatağına enjekte edin.
   NOT: Yaralar aynı anda birden fazla bakteri ve/veya mantar türüyle veya¹⁹yaşındaki hastalardan çıkarılan önceden oluşturulmuş biyofilmler¹²veya hatta debridman dokusunu yara yatağına yerleştirerek de enfekte olabilir.
7. Enfeksiyondan sonra, fareleri ısıtma pedleri ile kafese yerleştirin ve sağ reflekslerini geri kazanana kadar izleyin.
   NOT: Farelerin üşümediğine emin olun, çünkü bu ölüme yol açabilir.
8. 48 saat boyunca yara enfeksiyonları oluşturun.
9. Yapışkan pansumanları her gün gözyaşı ve yapışmama alanları için inceleyin ve gerekirse değiştirin.

5. In vivo dispersal tedavi

NOT: Burada 3 topikal yara sulama solüsyöyleri serisi uygulayarak dispersiyon maddelerinin yönetimini açıklıyoruz (Şekil 1). Bununla birlikte, protokol jellerin, kremlerin veya pansumanların uygulanması gibi diğer teslimat türleri için uyarlanabilir.

1. Tedavileri uygularken fareleri izofluran anestezisi altına (% 3 ve dakikada 1 L oksijen) yerleştirin.
2. Her fare için 200 μL tedavi içeren 25 G iğneli üç adet 1 mL şırınga hazırlayın.
3. Cildi dikkatlice kaldırarak ve forsepsle sıkıştırarak, yaranın biraz üzerinde hayvanın başına doğru 200 μL enzim çözeltisi veya PBS kontrolü enjekte edin. Şırınnayı kaldırılan deriden dikkatlice delin ve çözeltiyi pansuman ile yara yatağı arasına yavaşça enjekte edin. Bu çalışmada kullanılan pansuman genellikle hem yara yatağına hem de çevre dokuya yapışır.
   1. Tüm yara yatağının çözelti ile kap olduğundan emin olmak için, çözeltiyi yavaşça enjekte ederken, pansumanı forsepsle hafifçe kaldırın, yara yatağından çekin.
4. Tedaviden sonra, fareleri 30 dakika boyunca kafeslerine geri yerleştirin.
5. Tedaviye 30 dakika maruz kaldıktan sonra, fareleri izofluran ile yeniden uyuşturun ve çözeltiyi bir şırınna ile epire edin, daha önce olduğu gibi aynı bölgede delinmeyi unutmayın.
   NOT: Bu aspire edilmiş çözelti, çeşitli aşağı akış analizleri için kaydedilebilecek dağınık bakteri hücreleri içerir.
6. her seferinde yeni bir şırıng kullanarak ikinci ve üçüncü sulama arıtmalarını birinci olarak uygulayın.

6. In vivo dispersiyon görüntüleme ve analizi

NOT: Enfeksiyonu başlatmak için parlak bir bakteri türü kullanılırsa, yara yatağından dağılımı görselleştirmek için bir In Vivo Görüntüleme Sistemi (IVIS) kullanılabilir.

1. Görüntü fareleri tedaviden hemen önce ve sonra ve tedavi sonrası 10 ve 20 saat(Şekil 2 ve Ek Şekil 1).
2. Fareler anestezi altındayken IVIS'e ayrı ayrı yerleştirerek ve her birini 560 nm dalga boyunda 5 sn boyunca görüntüleyerek görüntülemeyi gerçekleştirin. Daha fazla analiz için görüntüleri kaydedin.
   NOT: Optimum dalga boyu ve pozlama süresi, kullanılan muhabire ve IVIS cihazına ve görüntüleme yazılımına bağlı olacaktır.
3. Analiz için, görüntüleri IVIS yazılımında açın ve Araç Paleti'nde analiz edilecek alanı seçin.
4. Arka planı hesaba katmak için, bir fotoğrafın arka planına bir daire yerleştirin ve ardından her fare için yara yatağının üzerine aynı büyüklükteki daireyi yerleştirin.
5. Ölçüm değerlerini karşıya yüklemek için İlgi Alanı (> ROI) ölçümlerini görüntüle'yi seçin ve ölçüm tablosunu bir elektronik tabloya yükleyin. Her numune için lüminesansı hesaplamak için yara yatağı ölçümlerinin her birinden arka plan dairesi okumasını çıkarın. Değişen yüzde lüminesansı hesapla:
   Yatırım getirisi ön tedavi-ROI tedavi sonrası/ YATıRıM GETIRISI ön tedavi) x 100.
   NOT: Görüntü alımını veya parlaklığı etkileyebilecek değişkenler için normalleştirmek için kontrol ve tedavi edilen fareler aynı anda analiz edilmelidir.

7. CFU'yu belirleyerek dağılımın değerlendirilmesi

1. 100 mg/kg ketamin 10 mg/kg ksilazin ile anestezi altında 0.2 mL pentobarbital sodyum (örneğin Fatal Plus) intraperitoneal enjeksiyon ile fareleri insanca ötenazi.
2. Önce pansumanı steril önps ile nazikçe çıkararak yara yatağı dokusunu hasat edin ve ardından steril cerrahi makasla yara yatağının çevresini kesin. Örneği kas tabakasından kesmek /alay etmek için makas kullanırken yara yatağının bir ucunun bir ucunun önps ile hafifçe kaldırın.
3. Yara yatağındaki dokuyu 1 mL PBS içeren önceden etiketlenmiş ve önceden tartılmış 2 mL homojenizasyon tüpüne yerleştirin. Numuneleri yerleştirdikten sonra tüpleri tekrar tartın ve dağınık veya gevşek yapışmış bakterileri durulamak için 3-5 kez hafifçe ters çevirin ve PBS'yi çıkarın. 1 mL taze PBS ekleyin.
4. Dalakları hasat etmek için, fareleri arka anatomik bir konuma yerleştirin ve ekstremitelerini bir diseksiyon yüzeyine sabitleyerek sabitleyin. Bölgeyi dezenfekte etmek ve kürkün numuneyi kirletmemesi için% 70 etanol ile parçalanacak alanı ıslatın.
5. Alt karın derminde cerrahi makasla orta çizgiye dik küçük bir kesi yaparak cildi yukarı ve iç organlardan uzaklaştırdığından emin olun. Sternuma ulaşılana kadar kesiği iç kısım boyunca, orta hat boyunca devam ettir. Periton boşluğu açığa çıktıktan ve iç organlar görünür olduğunda, dalağını bağ dokusundan hafifçe ayırın ve ayrı bir homojenizasyon tüpüne yerleştirin.
6. Dalağını tartın ve yara yatağı dokusu için açıklandığı gibi PBS ile durulayın.
   NOT: Diğer ilgi organları da benzer şekilde hasat edilebilir.
   1. İlk kesiği yaparken, bağırsakların veya diğer organların delinmemesine dikkat edin.
7. Örnekleri 2 mL önceden doldurulmuş boncuk değirmeni tüplerinde 60 sn boyunca 5 m/s'de tezgah üstü homojenizatör kullanarak iki kez homojenize edin.
8. CFU'yu numaralandırmak için, seçici agar üzerinde örnekleri ve spot plakayı seri olarak seyreltin. Seri seyreltme için, numunenin pipeti 100 μL'yi 1,5 mL'lik bir tüpte 900 μL PBS'ye, girdap ve 5 kez tekrarlayın. Pipet 10 μL her seyreltme şekil 3'tegösterildiği gibi bir agar plakası üzerine.
   NOT: Daha hassas CFU nicelasyonu gerekiyorsa, numunenin her seyreltilmesinden 100 μL'yi ayrı agar plakalara yayın.

8. Dağılım ex vivo değerlendirmesi (Şekil 4)

1. Fareleri yarala ve yukarıda açıklandığı gibi yaklaşık^{10 4} PAO1 ile enfekte et ve enfeksiyondan sonra 48 saat ötenazi.
2. Pansumanı steril teknik kullanarak ve yara yatağını bozmadan, asalarla dikkatlice çıkarın.
3. Yara yatağının bir ucunun kaldırılması için önseçimler kullanarak yara yatağının çevresini enfekte edilmemiş deriden kesmek için steril cerrahi makas ve enfekte olmayan dokunun altındaki kas tabakasından enfekte yara dokusunu çıkarmak için makas kullanın. Yara yatağı örneklerini eşit parçalara bölün veya bütün kullanın.
4. Yara dokusunu boş, önceden tartılmış 2 mL boncuk değirmeni homojenizasyon tüplerine yerleştirin. Daha sonra numuneyi ekledikten sonra tüpleri tekrar tartın. Örneğin ağırlığını şu şekilde hesaplayın:
   örnek ekledikten sonra ağırlık - örnek eklemeden önce ağırlık.
5. 1 mL PBS ekleyin ve numuneyi durulamak ve planktonik hücreleri çıkarmak için tüpü 3-5 kez hafifçe ters çevirin. PBS'yi çıkarın ve atın.
6. Numuneye 1 mL GH tedavisi (veya negatif kontrol olarak PBS) ekleyin ve 80 rpm'de sallanarak 37 °C'de 2 saat kuluçkaya yatırın.
7. Biyofilm dispersiyon çözeltisini çıkarın ve ayrı bir 1,5 mL tüpe yerleştirin. Bu dağınık hücreleri içerir.
8. Kalan doku örneğine 1 mL PBS ekleyin ve kalan dağınık hücreleri durulamak için 3-5 kez hafifçe ters çevirin. PBS'yi çıkarın ve atın.
9. Kalan dokuya 1 mL PBS ekleyin ve tezgah üstü homojenizatör kullanarak 60 sn boyunca 5 m/s'de homojenize edin.
10. 1,5 mL'lik bir tüpe 900 μL PBS'ye 100 μL numune yerleştirerek ve toplam 6 seyreltme için beş kez tekrarlayarak dağınık hücrelerin ve homojenize doku örneğinin çözeltisini seri olarak seyreltin.
11. Spot plaka 10 μL her seyreltme media seçici agar üzerine (örneğin, P. aeruginosaiçin Pseudomonas İzolasyon Agar) ve plakaları bir gecede 37 ° C'de kuluçkaya yatır.
12. CFU'ları sayın ve 'dağılan yüzdeyi' (süpernatantta CFU/ (biyofilm dokusunda süpernatant+ CFU'da CFU)) x 100 olarak hesaplayın.

Sonuçlar

Bu deneyde, 8-10 haftalık dişi İsviçre Webster farelerine lüminesans plazmid pQF50-lux taşıyan^{10 4} CFU PAO1 ile enfekte edildi. Yukarıda açıklandığı gibi, biyofilm EPS'yi sindirmek için PBS (araç kontrolü) veya% 10 GH (tedavi) 3 x 30 dakikalık tedavileri uygulamadan önce 48 saat boyunca bir enfeksiyon kurulmasına izin verildi. Fareler tedaviden hemen sonra (0 h) ve tedavi sonrası 10 saat 20 saat olarak görüntülendi. Şekil 2A ve Ek Şekil 1,

Tartışmalar

Burada biyofilm dispersiyon ajanlarının etkinliğini incelemek için kullanılabilecek protokolleri açıklıyoruz. Bu protokoller, klinik debridman örnekleri de dahil olmak üzere farklı dispersiyon ajanları, bakteri türleri veya ex vivo örnekleri ile kullanıma kolayca uyarlanabilir. Bu protokol ayrıca dağınık bakteri hücrelerini toplamak ve incelemek için klinik olarak ilgili bir model sağlar. Dağınık bakteri hücrelerinin fenotiplerinin planktonik veya biyofilm ^{hücrelerind...}

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
1.5 mL microcentrifuge tube	Fisher	14823434	Use to complete serial dilutions of samples
25G 58 in needle	Fisher	14823434	Attaches to 1 mL syringe
Ampicillin Sodium Salt	Fisher	BP1760-5	Make a 50 mg/ mL stock solution and add 100 µL to 10 mL of LB broth for both overnight and subculture
Amylase	MP Biomedicals	2100447	Make a 5% w/v solution, vortex- other dispersal agents can be used
Buprenorphine SR-LAB 5 mL (1 mg/mL)	ZooPharm	RX216118	Use as pain mainagement- may use other options
Cellulase	MP Biomedicals	2150583	Add 5% w/v to the 5% w/v amylase solution, vortex, activate at 37 °C for 30 min- other dispersal agents can be used
Depilatory cream	Walmart	287746	Use a small amount to massage into the hair follicles on the back of the animal and allot 10 min to remove hair
Dressing Forceps, Serrated Tips	Fisher	12-460-536	Can use other forms of forceps
Erlenmeyer flasks baffled 125 mL	Fisher	101406	Use to grow overnights and sub-cultures of bacteria
FastPrep-24 Benchtop Homogenizer	MP Biomedicals	6VFV9	Use 5 m/s for 60 s two times to homogenize tissue
Fatal Plus	Vortech Pharmaceuticals	0298-9373-68	Inject 0.2 mL intraperitaneal for each mouse
Homogenizing tubes (Bead Tube 2 mL 2.4 mm Metal)	Fisher	15340151	Used to homogenize samples for plating
Isoflurane	Diamond Back Drugs
Ketamine hydrochloride/xylazine hydrochloride solution C-IIIN	Sigma Aldrich	K4138	Use as anasethia- other options can also be utilized to gain a surgical field of anasethia
LB broth, Miller	Fisher	BP1426-2	Add 25 g/L and autoclave
Lidocaine 2% Injectable	Diamond Back Drugs	2468	Inject 0.05 mL through the side of the marked wound bed area so it is deposited in the center of the mark. Allot 10 min prior to cutting
Meropenem	Sigma Aldrich	PHR1772-500MG	Make 5 mg/mL to add to the GH solution to apply topically and a 15 mg/mL solution to inject intraperitaneal 4 h prior and 6 h post-treatment
Non-sterile cotton gauze sponges	Fisher	13-761-52	Use to remove the depilatory cream
PAO1 pQF50-lux bacterial strain	Ref [13]	N/A	PAO1 pgF50-lux was used as the P. aeruginosa strain of interest in this paper's representative results
Petri dishes	Fisher	PHR1772-500MG
Phosphate Buffer Saline 10x	Fisher	BP3991	Dilute 10x to 1x prior to use
Polyurethane dressing	Mckesson	66024007	Cut the rounded edge off and cut the remaining square into 4 equal sections
Pseudomonas isolation agar	VWR	90004-394	Add 20 mL/L of glycerol and 45 g/mL to water, autoclave, and pour 20 mL into petri dishes
Refresh P.M.	Walmart		Use on eyes to reduce dryness during procedure.
Sterile Alcohol Prep Pads	Fisher	22-363-750	Use to clean the skin immediately prior to wounding to disinfect the area
Straight Delicate Scissors	Fisher	89515	Can also use curved scissors
Swiss Webster mice	Charles River	551NCISWWEB	Other mice strains can be used
Syring Slip Tip 1 mL	Fisher	14823434	Used to administer drugs and enzyme treatment