تصوير الأمعاء ب "الوضوح"

Summary

نصف بروتوكول تلطيخ الوضوح السلبي (PACT) لأمعاء الفأر لتمكين تصور الأنسجة تحت الظهارية ، بما في ذلك الخلايا العصبية والخلايا الدبقية وخلايا الغدد الصم المعوية (EEC) بدون تقطيع الأنسجة. يتضمن البروتوكول تضمين الهيدروجيل للأنسجة الثابتة بالفورمالديهايد ، وإزالة الدهون اللاحقة باستخدام منظف أنيوني "لتنظيف" الأنسجة.

Abstract

تطورت CLARITY (الأنسجة الجامدة المتوافقة مع التصوير الصلب المهجن بالدهون الشفافة hYydrogel) مؤخرا كتقنية قيمة تتضمن تضمين مادة الأكريلاميد في أنسجة إزالة الشحوم (بدون تقسيم) وللحفاظ على بنية الأنسجة ثلاثية الأبعاد للتلوين المناعي. هذه التقنية ذات صلة كبيرة في تصوير بيئة الأمعاء الديناميكية حيث تتفاعل أنواع الخلايا المختلفة أثناء التوازن وحالات المرض. يتم وصف هذه الطريقة المحسنة لأمعاء الفأر هنا ، مما يساعد على تتبع أنواع الخلايا مثل الظهارة ، والغدد الصم المعوية ، والخلايا العصبية ، والخلايا الدبقية ، والإسقاطات العصبية في الظهارة أو خلايا الغدد الصم المعوية التي تتوسط الاستشعار الميكروبي أو الاستشعار الكيميائي للمغذيات على التوالي. يتم تثبيت أنسجة الأمعاء (1-1.5 سم) في 4٪ بارافورمالدهيد (PFA) في محلول ملحي مخزن بالفوسفات (PBS) عند 4 درجات مئوية بين عشية وضحاها في اليوم الأول. في اليوم 2 ، يتم التخلص من PFA ، ويتم غسل الأنسجة ثلاث مرات باستخدام PBS. يتم تضمين الأنسجة هيدروجيل للحفاظ على سلامتها عن طريق الحضانة في محلول هيدروجيل 4٪ (أكريلاميد) في PBS (مخفف من 30٪ ProtoGel) بين عشية وضحاها عند 4 درجات مئوية. في اليوم 3 ، يتم تحضين محلول هيدروجيل الأنسجة عند 37  درجة مئوية لمدة ساعة واحدة للسماح ببلمرة الهيدروجيل. ثم يتم غسل الأنسجة ثلاث مرات برفق باستخدام PBS لإزالة الهيدروجيل الزائد. تتضمن الخطوة اللاحقة من إزالة الشحوم (التطهير) حضانة الأنسجة في كبريتات دوديسيل الصوديوم (8٪ SDS في PBS) عند 37 درجة مئوية لمدة يومين (اليومين 4 و 5) على شاكر في درجة حرارة الغرفة (RT). في اليوم 6 ، يتم غسل الأنسجة التي تم تطهيرها جيدا باستخدام PBS لإزالة SDS. يمكن تلطيخ الأنسجة مناعية عن طريق الحضانة في الأجسام المضادة الأولية (مخفف في مصل الحمار العادي بنسبة 0.5٪ في PBS الذي يحتوي على 0.3٪ Triton X-100) ، بين عشية وضحاها عند 4 درجات مئوية ، والحضانة اللاحقة في الأجسام المضادة الثانوية المناسبة Alexa Fluor لمدة 1.5 ساعة في RT ، والتلوين النووي باستخدام DAPI (1: 10000). يتم نقل الأنسجة على شريحة زجاجية نظيفة وتركيبها باستخدام VectaShield للتصوير متحد البؤر.

Introduction

تطورت CLARITY (الأنسجة الصافية المتبادلة بالدهون الشفافة المتبادلة مع الأكريلاميد والتصوير الصلب المتوافق مع الأنسجة hYdrogel) مؤخرا كتقنية قيمة تتضمن تضمين مادة الأكريلاميد (الهيدروجيل) وإزالة دهون الأنسجة للحفاظ على بنية الأنسجة ثلاثية الأبعاد للتلوين المناعي (بدون تقسيم) ^1،2. الأنسجة المضمنة في الهيدروجيل شفافة بصريا ونفاذية للجزيئات الكبيرة ، حيث يتم الحفاظ على البروتينات والأحماض النووية بعد إزالة الدهون بواسطة المنظفات. تم الاعتراف ب CLARITY كواحد من بين عشرة اختراقات بارزة في عام 2013 بواسطة Science³. على الرغم من أنها تم تطويرها في البداية لتصوير أنسجة المخ الغنية بالدهون حيث تؤثر الدهون على تشتت الضوء وجودة التصوير ، إلا أن هذه التقنية تستخدم حاليا على نطاق واسع لتصوير الأنسجة الأخرى مثل الأمعاء والكبد والكلى والقلب. توفر هذه التقنية القدرة على تلطيخ الأنسجة وتصويرها عن طريق التخلص من الحاجة إلى التقسيم ، مما قد يؤدي إلى تقييم متحيز لتفاعلات الخلية الخلوية بسبب التوزيع غير المنتظم لأنواع الخلايا. توفر هذه التقنية أيضا الفرصة لإجراء مكدسات z متحدة البؤر وإعادة إنشاء صورة ثلاثية الأبعاد للأنسجة ، والتي يمكن أن تساعد في تحديد الكثافة والهندسة المعمارية الدقيقة وتفاعل الخلية بين أنواع الخلايا المختلفة بشكل أكثر واقعية من قسم الأنسجة. علاوة على ذلك ، تم تعديل هذه التقنية للسماح بالتلوين المناعي للأنسجة الكثيفة مثل العظام ، وكذلك دراسات التهجين في الموقع. يوفر النسيج ثلاثي الأبعاد المدمج في الهيدروجيل منصة جذابة لتوضيح التفاعلات بين الخلايا الظهارية والغدد الصم المعوية والدبقية والخلايا العصبية ، والتي تم الاستشهاد بها مؤخرا لتكون حاسمة لفهم الفيزيولوجيا المرضية لأمراض مثل مرض باركنسون ومرض الزهايمر واضطرابات طيف التوحد وما إلى^{ذلك 4}.

Protocol

تمت الموافقة على جميع التجارب على الموصوفة من قبل لجنة جامعة إيموري لاستخدام ورعايتها. سمح لفئران C57BL / 6 (يمكن استخدام الذكور والإناث) في عمر 8-12 أسبوعا من العمر بحرية الوصول إلى الطعام والماء قبل القتل الرحيم.

1. إزالة الأمعاء (اليوم 1)

1. القتل الرحيم للفأر بطريقة الاختناق بثاني أكسيد الكربون ، بمعدل تدفق 1.6 مل من غاز ثاني أكسيد الكربون حتى يتم ملاحظة توقف التنفس لمدة دقيقتين).
2. ضع الفأر ضعيفا على لوح تشريح مع تثبيت الأطراف. تعقيم البطن بنسبة 70٪ من الإيثانول. باستخدام الملقط ، افتح الجلد بالمقص.
3. ارفع الكبد برفق وحدد المعدة. ثم أمسك المعدة بالملقط ، وقطع المريء فوق المعدة مباشرة. أمسك المعدة بالملقط ، وقم بقص المساريقيين برفق وافصل الأمعاء عن تجويف البطن حتى المستقيم. قطع الأمعاء المنفصلة عند المستقيم.
4. انقل الأمعاء المنفصلة إلى محلول PBS مثلج في طبق بتري. الآن قم بقص المساريق برفق بين الأجزاء اللفائفية وقم بتصويب الأمعاء بحيث يتم قطع جميع المساريق بدءا من المعدة ، حتى القولون.
5. قم بقص 1-1.5 سم من المنطقة المعوية المرغوبة لتلوين CLARITY في طبق بتري جديد يحتوي على PBS مثلج.
6. باستخدام حقنة سعة 5 مل متصلة بنهاية غير حادة لإبرة 20 جم ، اغسل محتويات البراز باستخدام PBS المثلج.
   ملاحظة: يمكن استخدام أي منطقة من الأمعاء لتلوين CLARITY باستخدام نفس التقنية. يمكن قطع الجزء المعوي على طول المساريق أو استخدامه سليما في الخطوات اللاحقة.

2. تثبيت الأنسجة المعوية (اليوم 1)

1. قم بإصلاح الأنسجة في محلول بارافورمالدهيد (PFA) بنسبة 4٪ في PBS.
2. انقل قطعة من 1-1.5 سم من الجزء المعوي ذي الأهمية إلى أنبوب مخروطي سعة 15 مل مملوء بنسبة 4٪ PFA عند 4 درجات مئوية طوال الليل للتثبيت.

3. تضمين الهيدروجيل (اليوم 2)

1. انقل الجزء المعوي من محلول PFA بنسبة 4٪ باستخدام ملقط إلى أنبوب مخروطي جديد سعة 15 مل مع محلول PBS واغسله ثلاث مرات (5 دقائق لكل منهما ، على شاكر عند 150-200 دورة في الدقيقة) لإزالة أي بقايا PFA.
2. تحضير هيدروجيل 4٪
   1. استخدم محلول الجل بنسبة 30٪ (ProtoGel) لتحضير الهيدروجيل. لتحضير محلول هيدروجيل بنسبة 4٪ ، يتم تخفيف محلول المخزون بنسبة 30٪ في PBS. لتحضير 12 مل من هيدروجيل 4٪ ، خذ 1.6 مل من محلول الجل 30٪ وأضف 10.4 مل من PBS.
3. انقل الأنسجة الثابتة من الخطوة 3.1. إلى محلول هيدروجيل 4٪ في PBS في أنبوب مخروطي سعة 15 مل ويحتضن عند 4 درجات مئوية بين عشية وضحاها.
   ملاحظة: يوصى بشدة بغسل الأنسجة خالية من PFA باستخدام PBS بعد الحضانة طوال الليل. لا تعطي الأنسجة المخزنة لفترة أطول في PFA نتائج جيدة مع الخطوات اللاحقة والتلطيخ. يمكن تخزين الأنسجة الثابتة بعد غسل PBS عند 4 درجات مئوية لمدة أسبوع.

4. خطوة بلمرة الهيدروجيل وإزالة الدهون (المقاصة) (اليوم 3)

1. أخرج الأنبوب المخروطي الذي يحتوي على الأنسجة في محلول الهيدروجيل من 4 درجات مئوية. انقله إلى حمام مائي 37 درجة مئوية واحتضنه لمدة 1 ساعة. تسمح هذه الخطوة ببلمرة الهيدروجيل.
2. بعد 1 ساعة ، أخرج الأنبوب المخروطي الذي يحتوي على أنسجة الهيدروجيل المدمجة في الحمام المائي ، واسكب محلول الأكريلاميد. الآن اشطف المنديل برفق بغسول PBS واحد في درجة حرارة الغرفة لإزالة الهيدروجيل الزائد.
3. خطوة إزالة الدهون
   1. Delipidate عن طريق احتضان الأنسجة في كبريتات دوديسيل الصوديوم (8٪ SDS) في PBS. انقل الأنسجة المضمنة في الهيدروجيل من الخطوة 4.2 إلى محلول SDS بنسبة 8٪ في أنبوب مخروطي سعة 50 مل. تأكد من أن الأنسجة مغمورة تماما في محلول SDS ، وأن الأنبوب مغطى.
   2. انقل الأنبوب المغطى بسعة 50 مل الذي يحتوي على الأنسجة الموجودة في SDS إلى شاكر 37 درجة مئوية (200 دورة في الدقيقة) في درجة حرارة الغرفة لمدة يومين (اليومين 4 و 5) للسماح بإزالة الدهون.
      ملاحظة: تأكد من ملء محلول SDS حتى 20-25 مل على الأقل في الأنبوب المخروطي سعة 50 مل ، للتعويض عن أي تبخر قد يحدث عند 37 درجة مئوية خلال يومي الحضانة.
4. في اليومين 4 و 5 ، احتضان الأنسجة في SDS عند شاكر 37 درجة مئوية (200 دورة في الدقيقة) في درجة حرارة الغرفة.

5. غسل المنظف من الأنسجة التي تم تطهيرها (اليوم 6)

1. خذ الأنسجة من محلول SDS. ستظهر الأنسجة "شفافة" أو شفافة.
2. انقل الأنسجة إلى أنبوب كوميدي جديد سعة 50 مل بمحلول PBS واغسله على مدار اليوم على شاكر (150-200 دورة في الدقيقة) في درجة حرارة الغرفة مع عدة تغييرات في PBS ، لضمان إزالة جميع آثار SDS. ستضمن 10 تغييرات على الأقل في محلول PBS أن الأنسجة خالية من SDS ، والقاعدة الأساسية الجيدة هي التحقق مما إذا كان غسل PBS النهائي لا يحتوي على آثار للرغوة / الرغوة من SDS. هذه خطوة حاسمة حيث يمكن أن تتداخل SDS مع خطوات التلوين اللاحقة.
   ملاحظة: في نهاية اليوم ، تكون الأنسجة التي تم تطهيرها بعد عدة غسلات في PBS جاهزة الآن للتلوين المناعي أو ربما يتم تخزينها عند 4 درجات مئوية لمدة تصل إلى 3 أسابيع.
3. سيؤثر تخزين الأنسجة المعوية التي تم تطهيرها لأكثر من شهر في محلول PBS على سلامة الأنسجة وجودة تلطيخها. استخدم الأنسجة المعوية التي تم تطهيرها على الفور أو في غضون 1-2 أسابيع من التطهير للحصول على أفضل النتائج.

6. تلطيخ الفلورسنت المناعي للخلايا العصبية والخلايا الدبقية وخلايا الغدد الصم المعوية

1. انقل الأنسجة التي تم تطهيرها إلى أنبوب 1.5 أو 2 مل واحتضان حجم 500 ميكرولتر من الأجسام المضادة الأولية المخففة في مصل حمار عادي بنسبة 0.5٪ في PBS يحتوي على 0.3٪ Triton X-100) بين عشية وضحاها عند 4 درجات مئوية. الأجسام المضادة (Ab) المستخدمة: Tuj1 أو β-3-tubulin (علامة عموم الخلايا العصبية ، 1: 1000) ، بروتين حمض الرجفان الدبقي (GFAP ، 1: 500) ، الكروموجرانين A (1: 250).
2. بعد الحضانة بين عشية وضحاها ، قم بإخضاع الأنسجة ل 3 غسلات PBS (5 دقائق لكل منها باستخدام 1-1.5 مل من PBS) لإزالة Ab الأولية غير المرتبطة.
3. انقل الأنسجة إلى أنبوب جديد ، ثم احتضن 500 ميكرولتر من Alexa Fluor Ab الثانوي المناسب (AF) لمدة 1.5 ساعة في درجة حرارة الغرفة في الظلام. Ab الثانوي المستخدم هو AF 488 ل Tuj1 (1: 1000) و AF-555 ل GFAP (1: 500) و AF 555 (1: 250) للكروموجرانين A.
4. بعد الحضانة ، اغسل الأنسجة ثلاث مرات باستخدام PBS كما في الخطوة 6.2.
5. لتلوين النوى ، احتضان الأنسجة في DAPI (1: 10000 تخفيف أو 0.2 ميكرولتر في 2 مل PBS) لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة.
6. أخيرا ، انقل الأنسجة الملطخة إلى شريحة زجاجية نظيفة ، وأضف غطاء أعلى المنديل وقم بتثبيته باستخدام 100 ميكرولتر من VectaShield للتصوير متحد البؤر.
7. ضع الشرائح في الظلام في درجة حرارة الغرفة في حامل منزلق لمدة 30 دقيقة للتجفيف ، وبعد ذلك يمكن تصويرها أو تخزينها عند -20 درجة مئوية. جدار أمعاء الفأر رقيق إلى حد ما وبمجرد فتحه على طول المساريق ، يمكن تركيبه على شرائح زجاجية مباشرة مع غطاء. إذا كنت تعمل مع أنسجة أكبر مثل الطحال, الكلى, الغرفة (تجويف) الشرائح أو الفواصل. بالنسبة للأنسجة الأكبر حجما مثل ، يمكن استخدام شريحة تجويف للتركيب.
   ملاحظة: تجدر الإشارة إلى أنه إذا لم يتم قطع الجزء المعوي في الخطوة الأولى (راجع الملاحظة في الخطوة 1) ، فمن المستحسن قطع الأنبوب المعوي بمقص دقيق يسهل الخطوات التي تنطوي على التركيب.

7. التصوير متحد البؤر

ملاحظة: يمكن تصوير الأنسجة التي تم تطهيرها وملطخها والتركيب على الفور أو يمكن تخزينها في صناديق منزلقة عند -20 درجة مئوية.

1. الصورة باستخدام مجهر متحد البؤر (على سبيل المثال ، أوليمبوس FV1000).
2. خذ مداخن z عبر سمك 50 ميكرومتر من أنسجة الأمعاء لتصور المناطق من تجويف الأمعاء باتجاه الطبقة المصلية.
3. قم بتخزين صور المكدس z كملفات صور أو ملفات .avi أفلام أو تحويلها إلى صورة ثلاثية الأبعاد بمساعدة البرنامج⁵.

النتائج

يتم تمثيل الصور من أنسجة أمعاء الفأر التي تم تطهيرها بتقنية CLARITY في الشكل 1. ينتج عن الإكمال الناجح للبروتوكول صورا عالية الجودة ونقية حيث يمكن تصور جميع التفاصيل الخلوية بوضوح. يعد تلطيخ DAPI للنوى مؤشرا جيدا جدا لتقييم جودة بروتوكول CLARITY والتلوين المناعي ?...

Discussion

طريقة CLARITY مفيدة للغاية لتلوين أمعاء الفئران لتصور أنواع مختلفة من الخلايا بما في ذلك الظهارة والخلايا العصبية والخلايا الدبقية في 3D ، وخاصة شبكة الإسقاطات العصبية التي تمتد عبر جدار الأمعاء إلى التجويف⁵ وتعصيبها إلى الخلايا الدبقية والخلايا EEC. تم تعديل ال...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
4% paraformaldehyde (PFA)  in PBS	ThermoFischer Scientific	J19943	Used for tissue fixation
4',6-Diamidino-2-Phenylindole, Dihydrochloride (DAPI)	ThermoFischer Scientific	D1306	1/10,000 dilution
Alexa Fluor-488	ThermoFischer Scientific	A-11034	1/1000 dilution
Alexa Fluor-555	ThermoFischer Scientific	A-21428	1/500 dilution
Anti- GFAP (Glial Fibrillary Acid Protein)	Abcam	ab7260	1/500 dilution
Anti-beta III Tubulin (or Tuj1)	Abcam	ab18207	1/1000 dilution
Chromogranin A	Abcam	ab15160	1/250 dilution
ProtoGel  30%	National Diagnostics	EC-890	Toxic, hazardous, handle with care- make 4% solution in PBS for use
Sodium dodecyl sulfate	ThermoFischer Scientific	28364	8% in PBS
Vectashield mounting medium	Vector Laboratories	H-1000