Imagerie de l’intestin avec « CLARITY »

Résumé

Nous décrivons le protocole de coloration passive CLARITY (PACT) de l’intestin de souris pour permettre la visualisation des tissus sous-épithéliaux, y compris les neurones, les cellules gliales et les cellules entéroendocrines (EEC) sans sectionnement tissulaire. Le protocole implique l’incorporation d’hydrogel dans les tissus fixés au formaldéhyde, puis la délipidation à l’aide d’un détergent anionique pour « nettoyer » les tissus.

Résumé

CLARITY (Clear Lipid-exchanged Acrylamide-hybridized Rigid Imaging compatible Tissue hYdrogel) a récemment évolué comme une technique précieuse impliquant l’intégration d’acrylamide pour délipider le tissu (sans section) et pour préserver la structure tissulaire 3D pour l’immunomarquage. La technique est très pertinente pour l’imagerie de l’environnement intestinal dynamique où différents types de cellules interagissent pendant l’homéostasie et les états pathologiques. Cette méthode optimisée pour l’intestin de souris est décrite ici, qui permet de tracer des types de cellules comme les épithéliums, les entéroendocrines, les neurones, la glie et les projections neuronales dans les cellules épithéliales ou entéroendocrines qui médient respectivement la détection microbienne ou la détection de chimiothérapie des nutriments. Le tissu intestinal (1-1,5 cm) est fixé dans du paraformaldéhyde (PFA) à 4 % dans une solution saline tamponnée au phosphate (PBS) à 4 °C pendant la nuit du 1er jour. Le jour 2, le PFA est jeté et le tissu est lavé trois fois avec du PBS. Le tissu est enrobé d’hydrogel pour préserver son intégrité par incubation dans une solution d’hydrogel à 4 % (acrylamide) dans du PBS (dilué à partir de 30 % de ProtoGel) pendant une nuit à 4 °C. Le jour 3, la solution tissulaire-hydrogel est incubée à 37 °C pendant 1 h pour permettre la polymérisation de l’hydrogel. Le tissu est ensuite lavé trois fois doucement avec du PBS pour éliminer l’excès d’hydrogel. L’étape suivante de la délipidation (éclaircissement) implique l’incubation tissulaire dans du dodécylsulfate de sodium (8 % de SDS dans le PBS) à 37 °C pendant 2 jours (jours 4 et 5) sur un agitateur à température ambiante (RT). Le 6e jour, le tissu éliminé est soigneusement lavé avec du PBS pour éliminer le SDS. Les tissus peuvent être immunomarqués par incubation dans des anticorps primaires (dilués dans du sérum d’âne normal à 0,5 % dans du PBS contenant 0,3 % de Triton X-100), pendant une nuit à 4 °C, puis par incubation dans des anticorps secondaires Alexa Fluor appropriés pendant 1,5 h à RT, et par coloration nucléaire avec DAPI (1:10000). Le tissu est transféré sur une lame de verre propre et monté à l’aide de VectaShield pour l’imagerie confocale.

Introduction

CLARITY (Clear Lipid-exchanged Acrylamide-hybridized Rigid Imaging compatible Tissue hYdrogel) a récemment évolué comme une technique précieuse impliquant l’enrobage d’acrylamide (hydrogel) et la délipidation tissulaire pour préserver la structure tissulaire 3D pour l’immunomarquage (sans section^)1,2. Le tissu intégré à l’hydrogel est optiquement transparent et perméable aux macromolécules, les protéines et les acides nucléiques étant préservés après l’élimination des lipides par détergent. CLARITY a été reconnu comme l’une des dix percées notables en 2013 par Science³. Bien qu’elle ait été développée à l’origine pour imager les tissus cérébraux riches en lipides où les lipides affectent la diffusion de la lumière et la qualité de l’imagerie, la technique est actuellement largement utilisée pour l’imagerie d’autres tissus comme l’intestin, le foie, les reins et le cœur. La technique offre la possibilité de colorer et d’imager un tissu en éliminant le besoin de sectionnement, ce qui pourrait autrement entraîner une évaluation biaisée des interactions cellule-cellule en raison de la distribution irrégulière des types de cellules. La technique offre également la possibilité d’effectuer des empilements z confocaux et de recréer une image tridimensionnelle du tissu, ce qui peut aider à déterminer les densités, la microarchitecture et l’interaction cellule-cellule entre divers types de cellules de manière plus réaliste qu’à partir d’une coupe de tissu. De plus, la technique a été modifiée pour permettre l’immunomarquage de tissus denses comme l’os, ainsi que des études d’hybridation in situ. Le tissu 3D intégré à l’hydrogel offre une plate-forme attrayante pour élucider les interactions entre les cellules épithéliales, entéroendocrines, gliales et neuronales, qui ont récemment été citées comme cruciales pour la compréhension de la physiopathologie de maladies telles que la maladie de Parkinson, la maladie d’Alzheimer, les troubles du spectre autistique,^{etc. 4}.

Protocole

Toutes les expériences sur les animaux décrites ont été approuvées par le Comité de l’Université Emory sur l’utilisation et le soin des animaux. Les souris C57BL/6 (mâles et femelles peuvent être utilisées) à l’âge de 8 à 12 semaines ont eu libre accès à la nourriture et à l’eau avant l’euthanasie.

1. Ablation de l’intestin (jour 1)

1. Euthanasier la souris par asphyxie au dioxyde de carbone, à un débit de 1,6 mL de dioxyde de carbone gazeux jusqu’à ce que l’arrêt de la respiration soit observé pendant 2 minutes.
2. Placez la souris en décubitus dorsal sur une planche de dissection avec les membres épinglés. Stérilisez l’abdomen avec de l’éthanol à 70 %. À l’aide d’une pince, ouvrez la peau avec des ciseaux.
3. Soulevez doucement le foie et identifiez l’estomac. Ensuite, en tenant l’estomac avec des pinces, coupez l’œsophage juste au-dessus de l’estomac. En tenant l’estomac avec des pinces, coupez doucement les mésentères et détachez l’intestin de la cavité abdominale jusqu’au rectum. Coupez l’intestin détaché au niveau du rectum.
4. Transférez l’intestin détaché dans une solution de PBS glacée dans une boîte de Pétri. Maintenant, coupez doucement le mésentère entre les segments iléaux et redressez l’intestin de sorte qu’en commençant par l’estomac, tous les mésentères soient coupés, jusqu’au côlon.
5. Coupez 1 à 1,5 cm de la région intestinale souhaitée pour la coloration CLARITY dans une nouvelle boîte de Pétri contenant du PBS glacé.
6. À l’aide d’une seringue de 5 mL fixée à l’extrémité émoussée d’une aiguille de 20 G, rincer le contenu fécal avec du PBS glacé.
   REMARQUE : N’importe quelle région de l’intestin peut être utilisée pour la coloration CLARITY en utilisant la même technique. Le segment intestinal peut être ouvert le long du mésentère ou utilisé intact pour les étapes suivantes.

2. Fixation du tissu intestinal (Jour 1)

1. Fixez le tissu dans une solution de paraformaldéhyde (PFA) à 4 % dans du PBS.
2. Transférez un morceau de 1 à 1,5 cm du segment intestinal d’intérêt dans un tube conique de 15 mL rempli de PFA à 4 % à 4 °C pendant la nuit pour la fixation.

3. Enrobage d’hydrogel (Jour 2)

1. Transférez le segment intestinal d’une solution de PFA à 4 % à l’aide d’une pince dans un nouveau tube conique de 15 mL avec une solution de PBS et lavez-le trois fois (5 min chacune, sur un agitateur à 150-200 tr/min) pour éliminer tout résidu de PFA.
2. Préparation de l’hydrogel à 4 %
   1. Utilisez la solution de gel à 30 % (ProtoGel) pour préparer l’hydrogel. Pour préparer une solution d’hydrogel à 4 %, diluer la solution mère à 30 % est diluée dans du PBS. Pour préparer 12 ml d’hydrogel à 4 %, prendre 1,6 ml de solution de gel à 30 % et ajouter 10,4 ml de PBS.
3. Transférez le tissu fixé à partir de l’étape 3.1. à la solution d’hydrogel à 4 % dans du PBS dans un tube conique de 15 ml et incubé à 4 °C pendant la nuit.
   REMARQUE : Il est fortement recommandé de laver le tissu sans PFA à l’aide de PBS après une nuit d’incubation. Les tissus stockés plus longtemps dans le PFA ne donnent pas de bons résultats avec les étapes et la coloration ultérieures. Le tissu fixé après les lavages PBS peut être stocké à 4 °C pendant une semaine.

4. Étape de polymérisation et de délipidation de l’hydrogel (éclaircissement) (Jour 3)

1. Prélever le tube conique contenant le tissu dans une solution d’hydrogel à partir de 4 °C. Transférer dans un bain-marie à 37 °C et incuber pendant 1 h. Cette étape permet la polymérisation de l’hydrogel.
2. Après 1 h, retirez le tube conique contenant le tissu incrusté dans l’hydrogel du bain-marie et versez la solution d’acrylamide. Maintenant, rincez doucement le mouchoir avec un seul lavage PBS à température ambiante pour éliminer l’excès d’hydrogel.
3. Étape de délipidation
   1. Délipidate en incubant le tissu dans du dodécylsulfate de sodium (8 % SDS) dans du PBS. Transférez le tissu incrusté d’hydrogel de l’étape 4.2 dans une solution de SDS à 8 % dans un tube conique de 50 ml. Assurez-vous que le tissu est complètement immergé dans la solution SDS et que le tube est bouché.
   2. Transférez le tube bouché de 50 ml contenant le tissu en FDS dans un agitateur à 37 °C (200 tr/min) à température ambiante pendant 2 jours (jours 4 et 5) pour permettre la délipidation.
      REMARQUE : S’assurer que la solution SDS est remplie à au moins 20-25 mL dans le tube conique de 50 mL, pour compenser toute évaporation qui pourrait se produire à 37 °C pendant les 2 jours d’incubation.
4. Les jours 4 et 5, incubez le tissu dans SDS à 37 °C (200 tr/min) à température ambiante.

5. Lavage du détergent du tissu nettoyé (jour 6)

1. Prélever le tissu de la solution SDS. Le tissu apparaîtra « clair » ou transparent.
2. Transférez le mouchoir dans un nouveau tube comical de 50 ml avec une solution de PBS et lavez-le au cours de la journée sur un agitateur (150-200 tr/min) à température ambiante avec plusieurs changements de PBS, pour s’assurer que toutes les traces de SDS sont éliminées. Au moins 10 changements de solution PBS garantiront que les tissus sont exempts de la FDS, et une bonne règle de base est de vérifier si le lavage final du PBS n’a pas de traces de mousse/mousse de la FDS. Il s’agit d’une étape critique car les SDS peuvent interférer avec les étapes de coloration ultérieures.
   REMARQUE : À la fin de la journée, le tissu éliminé après plusieurs lavages dans le PBS est maintenant prêt pour l’immunocoloration ou peut-être stocké à 4 °C jusqu’à 3 semaines.
3. Le stockage des tissus intestinaux clairsemés pendant plus d’un mois dans une solution de PBS affectera l’intégrité des tissus et la qualité de la coloration. Utilisez le tissu intestinal nettoyé immédiatement ou dans les 1 à 2 semaines suivant l’élimination pour de meilleurs résultats.

6. Coloration immunofluorescente des neurones, des cellules gliales et entéroendocrines

1. Transférez le tissu éliminé dans un tube de 1,5 ou 2 ml et incubez dans un volume de 500 μL des anticorps primaires respectifs dilués dans du sérum d’âne normal à 0,5 % dans du PBS contenant 0,3 % de Triton X-100) pendant une nuit à 4 °C. Les anticorps (Ab) utilisés : Tuj1 ou β-3-tubuline (marqueur neuronal Pan, 1:1000), protéine d’acide fibrillaire glial (GFAP, 1:500), chromogranine A (1:250).
2. Après une nuit d’incubation, soumettre le tissu à 3 lavages de PBS (5 minutes chacun avec 1 à 1,5 ml de PBS) pour éliminer les anticorps primaires non liés.
3. Transférez le tissu dans un nouveau tube, puis incubez avec 500 μL d’Alexa Fluor Ab (AF) secondaire approprié pendant 1,5 h à température ambiante dans l’obscurité. Les Ab secondaires utilisés sont AF 488 pour Tuj1 (1:1000), AF-555 pour GFAP (1:500) et AF 555 (1:250) pour Chromogranine A.
4. Après l’incubation, lavez le tissu trois fois avec du PBS comme à l’étape 6.2.
5. Pour colorer les noyaux, incuber le tissu dans du DAPI (dilution 1:10000 ou 0,2 μL dans 2 mL de PBS) pendant 5 min à température ambiante.
6. Enfin, transférez le tissu coloré sur une lame de verre propre, ajoutez une lamelle sur le tissu et fixez-le à l’aide de 100 μL de VectaShield pour l’imagerie confocale.
7. Placez les lames dans l’obscurité à température ambiante dans un support de lames pendant 30 min pour le séchage, après quoi elles peuvent être imagées ou stockées à -20 °C. La paroi intestinale de souris est assez mince et une fois ouverte le long du mésentère, elle peut être montée sur des lames de verre directement avec une lamelle. Si vous travaillez avec des tissus plus gros comme la rate, les reins, des lames de chambre (cavité) ou des espaceurs peuvent être utilisés. Pour les tissus plus gros comme, une lame de cavité peut être utilisée pour le montage.
   REMARQUE : Il est à noter que si le segment intestinal n’a pas été ouvert au début de l’étape (voir la note à l’étape 1), il est conseillé d’ouvrir le tube intestinal avec des micro-ciseaux qui faciliteront les étapes de montage.

7. Imagerie confocale

REMARQUE : Le tissu clair, coloré et monté peut être imagé immédiatement ou peut être stocké dans des boîtes à lames à -20°C.

1. Image à l’aide d’un microscope confocal (p. ex., Olympus FV1000).
2. Prenez des empilements z sur 50 m d’épaisseur du tissu intestinal pour visualiser les régions de la lumière intestinale vers la couche séreuse.
3. Stockez les images de la pile z sous forme de fichiers image, .avi fichiers vidéo ou convertissez-les en image 3D à l’aide du logiciel⁵.

Résultats

Les images du tissu intestinal de souris clarifié par CLARITY sont représentées à la figure 1. Une mise en œuvre réussie du protocole permet d’obtenir des images nettes de haute qualité où tous les détails cellulaires peuvent être visualisés clairement. La coloration DAPI des noyaux est un très bon indice pour évaluer la qualité du protocole CLARITY et de l’immunocoloration ultérieure, car elle peut décrire l’intégrité du tissu. De pl...

Discussion

La méthode CLARITY est très utile pour colorer l’intestin de souris afin de visualiser divers types de cellules, y compris les épithéliums, les neurones et les cellules gliales en 3D, en particulier le réseau de projections neuronales qui s’étendent à travers la paroi intestinale jusqu’à la lumière⁵ et leur innervation aux cellules gliales et EEC. La méthode présentée ici a été modifiée selon l’étude originale de Yang et al. 2014

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
4% paraformaldehyde (PFA)  in PBS	ThermoFischer Scientific	J19943	Used for tissue fixation
4',6-Diamidino-2-Phenylindole, Dihydrochloride (DAPI)	ThermoFischer Scientific	D1306	1/10,000 dilution
Alexa Fluor-488	ThermoFischer Scientific	A-11034	1/1000 dilution
Alexa Fluor-555	ThermoFischer Scientific	A-21428	1/500 dilution
Anti- GFAP (Glial Fibrillary Acid Protein)	Abcam	ab7260	1/500 dilution
Anti-beta III Tubulin (or Tuj1)	Abcam	ab18207	1/1000 dilution
Chromogranin A	Abcam	ab15160	1/250 dilution
ProtoGel  30%	National Diagnostics	EC-890	Toxic, hazardous, handle with care- make 4% solution in PBS for use
Sodium dodecyl sulfate	ThermoFischer Scientific	28364	8% in PBS
Vectashield mounting medium	Vector Laboratories	H-1000