"CLARITY"로 장을 이미지화하다

요약

조직 절편 없이 뉴런, 신경교세포, 장내분비세포(EEC)를 포함한 상피하 조직을 시각화할 수 있도록 마우스 장의 패시브 CLARITY(PACT) 염색 프로토콜에 대해 설명합니다. 이 프로토콜은 포름알데히드로 고정된 조직을 하이드로겔로 삽입하고 음이온 세제를 사용하여 조직을 "제거"하는 후속 탈지질을 포함합니다.

초록

CLARITY(Clear Lipid-exchanged Acrylamide-hybridized Rigid Imaging compatible Tissue hYdrogel)는 최근 탈lipidate 조직(절편 없이)하고 면역염색을 위한 3D 조직 구조를 보존하기 위한 아크릴아마이드 포매ing과 관련된 귀중한 기술로 발전했습니다. 이 기술은 항상성 및 질병 상태 동안 서로 다른 세포 유형이 상호 작용하는 역동적인 장 환경을 이미징하는 데 매우 관련이 있습니다. 쥐의 장에 최적화된 이 방법은 상피, 장내분비, 뉴런, 신경교세포와 같은 세포 유형을 추적하고 각각 미생물 감지 또는 영양 화학 감지를 매개하는 상피 또는 장 내분비 세포로의 뉴런 돌기를 추적하는 데 도움이 됩니다. 장 조직(1-1.5cm)은 1일차 4°C에서 하룻밤 동안 인산염 완충 식염수(PBS)의 4% 파라포름알데히드(PFA)로 고정됩니다. 2일차에는 PFA를 버리고 조직을 PBS로 세 번 세척합니다. 조직은 4 ° C에서 밤새 PBS (30 % ProtoGel에서 희석)의 4 % 하이드로 겔 (아크릴 아미드) 용액에서 배양하여 무결성을 보존하기 위해 하이드로 겔이 내장되어 있습니다. 3일차에는 조직-하이드로겔 용액을 37 °C에서 1시간 동안 배양하여 하이드로겔 중합을 허용합니다. 그런 다음 조직을 PBS로 부드럽게 세 번 세척하여 과도한 하이드로겔을 제거합니다. 탈lipidation(clearing)의 후속 단계에는 실온(RT)의 셰이커에서 2일(4일 및 5일) 동안 37°C에서 sodium dodecyl sulfate(PBS의 8% SDS)에서 조직 배양이 포함됩니다. 6일째에는 투명화된 조직을 PBS로 철저히 세척하여 SDS를 제거합니다. 조직은 1차 항체(0.3% Triton X-100을 함유한 PBS의 0.5% 일반 당나귀 혈청으로 희석)에서 4°C에서 하룻밤 동안 배양한 후 RT에서 1.5시간 동안 적절한 2차 Alexa Fluor 항체에서 배양하고 DAPI(1: 10000)로 핵 염색하여 면역 염색할 수 있습니다. 조직은 깨끗한 유리 슬라이드로 옮겨지고 컨포칼 이미징을 위해 VectaShield를 사용하여 장착됩니다.

서문

CLARITY(Clear Lipid-exchanged Acrylamide-hybridized Rigid Imaging compatible Tissue hYdrogel)는 최근 면역염색(절편 없이)을 위한 3D 조직 구조를 보존하기 위해 아크릴아마이드(하이드로겔) 포매 및 조직 탈립화와 관련된 유용한 기술로 발전했습니다^1,2. 하이드로겔이 포매된 조직은 광학적으로 투명하고 거대분자 투과성이 있으며, 단백질과 핵산은 세제로 지질을 제거한 후에도 보존됩니다. CLARITY는 2013년 Science³에서 주목할 만한 10가지 혁신 중 하나로 선정되었습니다. 처음에는 지질이 광 산란 및 이미징 품질에 영향을 미치는 지질이 풍부한 뇌 조직을 이미징하기 위해 개발되었지만, 현재 장, 간, 신장 및 심장과 같은 다른 조직을 이미징하는 데 널리 사용되고 있습니다. 이 기술은 절편의 필요성을 제거하여 조직을 염색하고 이미지화할 수 있는 기능을 제공하며, 그렇지 않으면 세포 유형의 불규칙한 분포로 인해 세포-세포 상호 작용에 대한 편향된 평가가 발생할 수 있습니다. 이 기술은 또한 컨포칼 z-스택을 수행하고 조직의 3차원 이미지를 재현할 수 있는 기회를 제공하여 조직 절편보다 더 사실적으로 다양한 세포 유형 간의 밀도, 미세 구조 및 세포 간 상호 작용을 결정하는 데 도움이 될 수 있습니다. 또한, 이 기술은 뼈와 같은 조밀한 조직의 면역 염색과 현장 교잡 연구를 가능하게 하도록 수정되었습니다. 하이드로겔에 내장된 3D 조직은 파킨슨병, 알츠하이머병, 자폐 스펙트럼 장애 등과 같은 질병의 병태생리학을 이해하는 데 결정적인 것으로 최근 인용된 상피세포, 장내분비세포, 신경교세포 및 신경세포 세포 간의 상호 작용을 설명하기 위한 매력적인 플랫폼을 제공합니다⁴.

프로토콜

설명된 모든 동물 실험은 동물의 사용 및 관리에 관한 에모리 대학 위원회의 승인을 받았습니다. 생후 8-12주령의 C57BL/6 마우스(수컷과 암컷 모두 사용 가능)는 안락사 전에 음식과 물을 자유롭게 이용할 수 있도록 허용되었습니다.

1. 장 제거 (1일차)

1. 이산화탄소 질식 방법으로 마우스를 1.6mL의 이산화탄소 가스의 유속으로 2분 동안 호흡이 멈출 때까지 안락사시킵니다.
2. 팔다리가 고정된 해부 보드에 마우스를 누운 상태로 놓습니다. 70% 에탄올로 복부를 살균하십시오. 집게를 사용하여 가위로 피부를 자릅니다.
3. 간을 부드럽게 들어 올리고 위를 확인합니다. 그런 다음 집게로 위를 잡고 위 바로 위의 식도를 잘라냅니다. 집게로 위를 잡고 장간막을 부드럽게 잘라내고 복강에서 직장까지 장을 분리합니다. 직장에서 분리된 장을 잘라냅니다.
4. 분리된 장을 페트리 접시에 담긴 얼음처럼 차가운 PBS 용액으로 옮깁니다. 이제 회장 분절 사이의 장간막을 부드럽게 잘라내고 장을 곧게 펴서 위부터 결장까지 모든 장간막이 잘려나가도록 합니다.
5. CLARITY 염색을 위해 원하는 장 부위의 1-1.5cm를 얼음처럼 차가운 PBS가 들어 있는 새 페트리 접시로 자릅니다.
6. 20G 바늘의 뭉툭한 끝 부분에 부착된 5mL 주사기를 사용하여 얼음처럼 차가운 PBS로 배설물 내용물을 씻어냅니다.
   참고: 장의 모든 부위를 동일한 기술을 사용하여 CLARITY 염색에 사용할 수 있습니다. 장 분절은 장간막을 따라 절단하여 열거나 후속 단계를 위해 그대로 사용할 수 있습니다.

2. 장 조직의 고정 (1일차)

1. PBS의 4% 파라포름알데히드(PFA) 용액에 조직을 고정합니다.
2. 1-1.5cm의 관심 장 분절 조각을 4°C에서 4% PFA로 채워진 15mL 원뿔형 튜브에 밤새 옮겨 고정합니다.

3. 하이드로겔 임베딩(2일차)

1. 집게가 있는 4% PFA 용액의 장 분절을 PBS 용액이 있는 새 15mL 원뿔형 튜브로 옮기고 세 번(150-200rpm의 셰이커에서 각각 5분) 세척하여 잔류 PFA를 제거합니다.
2. 4% 하이드로겔의 제조
   1. 30 % 겔 용액 (ProtoGel)을 사용하여 하이드로 겔을 준비하십시오. 4% 하이드로겔 용액을 제조하기 위해 30% 원액을 PBS에 희석하여 희석합니다. 12mL의 4% 하이드로겔을 준비하려면 1.6mL의 30% 겔 용액을 취하고 10.4mL의 PBS를 추가합니다.
3. 3.1단계에서 고정 조직을 옮깁니다. 15ml 원뿔형 튜브에 PBS의 4% 하이드로겔 용액을 넣고 4°C에서 하룻밤 동안 배양합니다.
   참고: 하룻밤 배양 후 PBS를 사용하여 조직을 PFA 없이 세척하는 것이 좋습니다. PFA에 더 오래 보관된 조직은 후속 단계 및 염색에서 좋은 결과를 제공하지 않습니다. PBS 세척 후 고정 조직은 일주일 동안 4°C에서 보관할 수 있습니다.

4. 하이드로겔 중합 및 탈지분(투명화) 단계(3일차)

1. 하이드로겔 용액에 조직을 담고 있는 원뿔형 튜브를 4°C에서 꺼냅니다. 37°C 수조로 옮기고 1시간 동안 배양합니다. 이 단계는 하이드로겔 중합을 허용합니다.
2. 1시간 후, 수조의 하이드로겔 내장 조직이 들어 있는 원뿔형 튜브를 꺼내고 아크릴아미드 용액을 붓습니다. 이제 실온에서 PBS 1회 세척으로 조직을 부드럽게 헹구어 과도한 하이드로겔을 제거합니다.
3. 탈lipidation 단계
   1. PBS에서 sodium dodecyl sulfate (8% SDS)에서 조직을 배양하여 탈지판류. 하이드로겔 내장 조직을 4.2단계에서 50mL 코니컬 튜브에 8% SDS 용액으로 옮깁니다. 조직이 SDS 용액에 완전히 잠겨 있고 튜브가 덮여 있는지 확인하십시오.
   2. SDS의 조직을 포함하는 뚜껑이 있는 50mL 튜브를 실온에서 37°C 쉐이커(200rpm)에 2일(4일 및 5일) 동안 옮겨 탈lipidation을 허용합니다.
      알림: 배양 2일 동안 37°C에서 발생할 수 있는 증발을 보상하기 위해 50mL 원추형 튜브에 SDS 용액이 최소 25-2mL까지 채워져 있는지 확인하십시오.
4. 4일차와 5일차에는 실온에서 37°C 쉐이커(200rpm)로 SDS에서 조직을 배양합니다.

5. 청소된 티슈에서 세제를 씻어냅니다(6일차)

1. SDS 용액에서 조직을 가져옵니다. 조직이 '투명'하거나 투명하게 나타납니다.
2. 조직을 PBS 용액이 든 새로운 50mL 코미컬 튜브로 옮기고 PBS를 여러 번 변경하여 실온에서 셰이커(150-200rpm)로 하루 동안 세척하여 SDS의 모든 흔적이 제거되도록 합니다. PBS 용액을 10회 이상 변경하면 조직이 SDS에서 벗어날 수 있으며, 최종 PBS 세척 시 SDS의 거품/거품 흔적이 없는지 확인하는 것이 좋습니다. SDS가 후속 염색 단계를 방해할 수 있으므로 이는 중요한 단계입니다.
   참고: 하루가 끝나면 PBS에서 여러 번 세척한 후 세척된 조직은 이제 면역 염색 준비가 되었거나 최대 3주 동안 4°C에서 보관할 수 있습니다.
3. 투명해진 장 조직을 PBS 용액에 한 달 이상 보관하면 조직의 무결성과 염색 품질에 영향을 미칩니다. 최상의 결과를 위해 세척된 장 조직을 즉시 또는 세척 후 1-2주 이내에 사용하십시오.

6. 신경세포, 신경교세포와 장내분비세포를 위한 면역형광성 염색

1. 세척된 조직을 1.5 또는 2 mL 튜브로 옮기고 0.3% Triton X-100)을 함유한 PBS의 0.5% 일반 당나귀 혈청에 희석된 각 1차 항체 500 μL 부피에서 4 °C에서 하룻밤 동안 배양합니다. 사용된 항체(Ab): Tuj1 또는 β-3-tubulin(Pan neuronal marker, 1:1000), Glial Fibrillary Acid Protein(GFAP, 1:500), Chromogranin A(1:250).
2. 하룻밤 배양 후, 조직을 3회 PBS 세척(1-1.5mL의 PBS를 사용하여 각각 5분)하여 결합되지 않은 원발성 Ab를 제거합니다.
3. 조직을 새 튜브로 옮긴 후 어두운 곳의 실온에서 1.5시간 동안 500μL의 적절한 2차 Alexa Fluor Ab(AF)로 배양합니다. 사용되는 2차 Ab는 Tuj1 (1:1000)에 대한 AF 488, GFAP (1:500)에 대한 AF-555 및 Chromogranin A에 대한 AF 555 (1:250)입니다.
4. 배양 후 6.2 단계와 같이 PBS로 조직을 세 번 씻습니다.
5. 핵을 염색하기 위해 실온에서 5분 동안 DAPI(1: 10000 희석 또는 2mL PBS에서 0.2μL)로 조직을 배양합니다.
6. 마지막으로, 염색된 조직을 깨끗한 유리 슬라이드로 옮기고, 조직 위에 커버슬립을 추가하고, 컨포칼 이미징을 위해 100μL의 VectaShield를 사용하여 장착합니다.
7. 건조를 위해 30분 동안 슬라이드 홀더에 실온의 어두운 곳에 슬라이드를 놓은 후 -20°C에서 이미지를 촬영하거나 보관할 수 있습니다. 쥐의 장 벽은 상당히 얇으며 장간막을 따라 열리면 커버슬립을 사용하여 유리 슬라이드에 직접 장착할 수 있습니다. 비장, 신장, 챔버(캐비티) 슬라이드 또는 스페이서와 같은 더 큰 조직으로 작업하는 경우 사용할 수 있습니다. 이와 같은 더 큰 조직의 경우 캐비티 슬라이드를 장착에 사용할 수 있습니다.
   알림: 시작 단계에서 장 분절을 절단하지 않은 경우(1단계의 참고 참조) 장착과 관련된 단계를 용이하게 하기 위해 마이크로 가위로 장 튜브를 절단하는 것이 좋습니다.

7. 컨포칼 이미징

참고: 투명하고 염색 및 장착된 조직은 즉시 이미징하거나 -20°C의 슬라이드 상자에 보관할 수 있습니다.

1. 컨포칼 현미경(예: Olympus FV1000)을 사용한 이미지.
2. 50μm 두께의 장 조직을 가로지르는 z-스택을 사용하여 장 내강에서 장액층까지의 영역을 시각화합니다.
3. z 스택 이미지를 이미지 파일로 저장하거나 .avi 동영상 파일로 저장하거나 소프트웨어의 도움으로 3D 이미지로 변환⁵.

결과

CLARITY가 제거된 쥐의 장 조직의 이미지는 그림 1에 나와 있습니다. 프로토콜이 성공적으로 완료되면 모든 세포 세부 사항을 명확하게 시각화할 수 있는 고품질의 선명한 이미지를 얻을 수 있습니다. 핵에 대한 DAPI 염색은 조직 무결성을 나타낼 수 있으므로 CLARITY 프로토콜과 후속 면역 염색의 품질을 평가하기 위한 매우 좋은 지표입니다. 또한, 세포 ...

토론

CLARITY 방법은 상피, 뉴런 및 신경교세포를 포함한 다양한 세포 유형, 특히 장 벽을 가로질러 내강⁵ 및 신경교세포 및 뇌파세포에 이르는 신경 분포를 3D로 시각화하기 위해 마우스 장을 염색하는 데 매우 유용합니다. 여기에 제시된 방법은 Yang et al., 2014,¹.

프로토콜의 중요한 단계에는 하룻밤 동안 장 조직을 고정한 ?...

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
4% paraformaldehyde (PFA)  in PBS	ThermoFischer Scientific	J19943	Used for tissue fixation
4',6-Diamidino-2-Phenylindole, Dihydrochloride (DAPI)	ThermoFischer Scientific	D1306	1/10,000 dilution
Alexa Fluor-488	ThermoFischer Scientific	A-11034	1/1000 dilution
Alexa Fluor-555	ThermoFischer Scientific	A-21428	1/500 dilution
Anti- GFAP (Glial Fibrillary Acid Protein)	Abcam	ab7260	1/500 dilution
Anti-beta III Tubulin (or Tuj1)	Abcam	ab18207	1/1000 dilution
Chromogranin A	Abcam	ab15160	1/250 dilution
ProtoGel  30%	National Diagnostics	EC-890	Toxic, hazardous, handle with care- make 4% solution in PBS for use
Sodium dodecyl sulfate	ThermoFischer Scientific	28364	8% in PBS
Vectashield mounting medium	Vector Laboratories	H-1000