Bildgebung des Darms mit "KLARHEIT"

Zusammenfassung

Wir beschreiben das Protokoll für die passive CLARITY (PACT)-Färbung des Mausdarms, um die Visualisierung von subepithelialen Geweben, einschließlich Neuronen, Gliazellen und enteroendokrinen Zellen (EEC), ohne Gewebeschnitt zu ermöglichen. Das Protokoll beinhaltet die Einbettung von Formaldehyd-fixiertem Gewebe in ein Hydrogel und die anschließende Delipidisierung mit einem anionischen Detergens, um das Gewebe zu "reinigen".

Zusammenfassung

CLARITY (Clear Lipid-exchange Acrylamide-hybridized Rigid Imaging compatible Tissue hYdrogel) hat sich in jüngster Zeit zu einer wertvollen Technik entwickelt, bei der Acrylamid eingebettet wird, um Gewebe zu entfetten (ohne Schnitte) und die 3-D-Gewebestruktur für die Immunfärbung zu erhalten. Die Technik ist von großer Bedeutung für die Bildgebung der dynamischen Darmumgebung, in der verschiedene Zelltypen während der Homöostase und des Krankheitszustands interagieren. Diese für den Mäusedarm optimierte Methode wird hier beschrieben und hilft dabei, Zelltypen wie Epithelien, Enteroendokrine, Neuronen, Gliazellen und die neuronalen Projektionen in die Epithelien oder enteroendokrinen Zellen zu verfolgen, die die mikrobielle Sensorik bzw. die Nährstoffchemowahrnehmung vermitteln. Das Darmgewebe (1-1,5 cm) wird über Nacht an Tag 1 in 4% Paraformaldehyd (PFA) in phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS) bei 4 °C fixiert. An Tag 2 wird PFA verworfen und das Gewebe dreimal mit PBS gewaschen. Das Gewebe wird zur Erhaltung seiner Integrität in ein Hydrogel eingebettet, indem es über Nacht bei 4 °C in einer 4%igen Hydrogellösung (Acrylamid) in PBS (verdünnt aus 30 % ProtoGel) inkubiert wird. An Tag 3 wird die Gewebe-Hydrogel-Lösung 1 h lang bei 37  °C inkubiert, um eine Hydrogelpolymerisation zu ermöglichen. Das Gewebe wird dann dreimal vorsichtig mit PBS gewaschen, um überschüssiges Hydrogel zu entfernen. Der nächste Schritt der Delipidisierung (Clearing) umfasst die Inkubation des Gewebes in Natriumdodecylsulfat (8 % SDS in PBS) bei 37 °C für 2 Tage (Tage 4 und 5) auf einem Shaker bei Raumtemperatur (RT). Am Tag 6 wird das gereinigte Gewebe gründlich mit PBS gewaschen, um SDS zu entfernen. Das Gewebe kann immungefärbt werden durch Inkubation in Primärantikörpern (verdünnt in 0,5 % normalem Eselsserum in PBS mit 0,3 % Triton X-100), über Nacht bei 4 °C und anschließender Inkubation in geeigneten sekundären Alexa-Fluor-Antikörpern für 1,5 h bei RT und Kernfärbung mit DAPI (1: 10000). Das Gewebe wird auf einen sauberen Objektträger übertragen und mit VectaShield für die konfokale Bildgebung montiert.

Einleitung

CLARITY (Clear Lipid-exchange Acrylamide-hybridized Rigid Imaging compatible Tissue hYdrogel) hat sich in jüngster Zeit zu einer wertvollen Technik entwickelt, die die Einbettung von Acrylamid (Hydrogel) und die Delipidierung des Gewebes umfasst, um die 3-D-Gewebestruktur für die Immunfärbung (ohne ^{Schnittbildung)} zu erhalten1,2. Das in Hydrogel eingebettete Gewebe ist optisch transparent und makromoleküldurchlässig, wobei Proteine und Nukleinsäuren nach der Entfernung von Lipiden durch ein Detergens erhalten bleiben. CLARITY wurde 2013 von Science³ als einer von zehn bemerkenswerten Durchbrüchen ausgezeichnet. Obwohl die Technik ursprünglich entwickelt wurde, um lipidreiches Hirngewebe abzubilden, bei dem Lipide die Lichtstreuung und die Bildqualität beeinflussen, wird sie derzeit häufig für die Bildgebung anderer Gewebe wie Darm, Leber, Niere und Herz eingesetzt. Die Technik bietet die Möglichkeit, ein Gewebe zu färben und abzubilden, indem keine Schnitte erforderlich sind, die sonst aufgrund einer unregelmäßigen Verteilung der Zelltypen zu einer verzerrten Bewertung von Zell-Zell-Interaktionen führen könnten. Die Technik bietet auch die Möglichkeit, konfokale Z-Stacks durchzuführen und ein 3-dimensionales Bild des Gewebes zu erstellen, was dazu beitragen kann, die Dichten, die Mikroarchitektur und die Zell-Zell-Interaktion zwischen verschiedenen Zelltypen realistischer zu bestimmen als aus einem Gewebeschnitt. Darüber hinaus wurde die Technik modifiziert, um die Immunfärbung von dichten Geweben wie Knochen sowie In-situ-Hybridisierungsstudien zu ermöglichen. Das in das Hydrogel eingebettete 3D-Gewebe bietet eine attraktive Plattform zur Aufklärung der Wechselwirkungen zwischen epithelialen, enteroendokrinen, glialen und neuronalen Zellen, die kürzlich als entscheidend für das Verständnis der Pathophysiologie von Krankheiten wie Parkinson, Alzheimer, Autismus-Spektrum-Störungen usw. genannt wurden⁴.

Protokoll

Alle beschriebenen Tierversuche wurden vom Emory University Committee on the Use and Care of Animals genehmigt. C57BL/6-Mäuse (sowohl männliche als auch weibliche Mäuse können verwendet werden) im Alter von 8-12 Wochen erhielten vor der Euthanasie freien Zugang zu Futter und Wasser.

1. Entfernung des Darms (Tag 1)

1. Euthanasieren Sie die Maus durch Kohlendioxid-Erstickungsmethode bei einer Flussrate von 1,6 ml Kohlendioxidgas, bis eine Atempause von 2 Minuten beobachtet wird.
2. Lege die Maus in Rückenlage mit festgesteckten Gliedmaßen auf ein Präparierbrett. Sterilisieren Sie den Bauch mit 70% Ethanol. Schneiden Sie die Haut mit einer Pinzette mit einer Schere auf.
3. Heben Sie die Leber vorsichtig an und identifizieren Sie den Magen. Halten Sie dann den Magen mit einer Pinzette fest und schneiden Sie die Speiseröhre direkt über dem Magen ab. Halten Sie den Magen mit einer Pinzette fest, schneiden Sie vorsichtig die Mesenterien ab und lösen Sie den Darm von der Bauchhöhle bis zum Enddarm. Schneiden Sie den abgelösten Darm am Enddarm ab.
4. Den abgelösten Darm in eine eiskalte PBS-Lösung in eine Petrischale überführen. Schneiden Sie nun vorsichtig das Mesenterium zwischen den Ileumsegmenten ab und richten Sie den Darm so aus, dass vom Magen ausgehend alle Mesenterien bis zum Dickdarm abgeschnitten werden.
5. Schneiden Sie 1-1,5 cm der gewünschten Darmregion für die CLARITY-Färbung in eine neue Petrischale, die eiskaltes PBS enthält.
6. Spülen Sie mit einer 5-ml-Spritze, die an einem stumpfen Ende einer 20-g-Nadel befestigt ist, den Stuhlinhalt mit eiskaltem PBS aus.
   HINWEIS: Jede Region des Darms kann mit der gleichen Technik für die CLARITY-Färbung verwendet werden. Das Darmsegment kann entlang des Mesenteriums aufgeschnitten oder intakt für die folgenden Schritte verwendet werden.

2. Fixierung des Darmgewebes (Tag 1)

1. Fixieren Sie das Gewebe in 4%iger Paraformaldehyd (PFA)-Lösung in PBS.
2. Übertragen Sie ein 1-1,5 cm großes Stück des interessierenden Darmsegments über Nacht zur Fixierung in ein konisches 15-ml-Röhrchen, das mit 4 % PFA bei 4 °C gefüllt ist.

3. Hydrogel-Einbettung (Tag 2)

1. Übertragen Sie das Darmsegment aus 4% iger PFA-Lösung mit einer Pinzette in ein neues konisches 15-ml-Röhrchen mit PBS-Lösung und waschen Sie es dreimal (jeweils 5 Minuten, auf einem Schüttler bei 150-200 U/min), um alle PFA-Reste zu entfernen.
2. Herstellung von 4% Hydrogel
   1. Verwenden Sie die 30%ige Gellösung (ProtoGel), um das Hydrogel herzustellen. Zur Herstellung einer 4%igen Hydrogellösung verdünnen Sie die 30%ige Stammlösung in PBS. Um 12 ml 4% Hydrogel herzustellen, nehmen Sie 1,6 ml 30% ige Gellösung und fügen Sie 10,4 ml PBS hinzu.
3. Übertragen Sie das fixierte Gewebe aus Schritt 3.1. in die 4%ige Hydrogellösung in PBS in einem konischen 15-ml-Röhrchen geben und über Nacht bei 4 °C inkubieren.
   HINWEIS: Es wird dringend empfohlen, das Gewebe nach der Inkubation über Nacht mit PBS von PFA zu waschen. Gewebe, das länger in PFA gelagert wird, führt bei den nachfolgenden Schritten und der Färbung zu keinen guten Ergebnissen. Das fixierte Gewebe nach PBS-Waschungen kann eine Woche lang bei 4 °C gelagert werden.

4. Schritt der Hydrogelpolymerisation und -delipidisierung (Clearing) (Tag 3)

1. Das konische Röhrchen, das das Gewebe in Hydrogellösung enthält, wird aus 4 °C herausgenommen. In ein 37 °C warmes Wasserbad geben und 1 h inkubieren. Dieser Schritt ermöglicht die Polymerisation des Hydrogels.
2. Nehmen Sie nach 1 h das konische Röhrchen mit dem in Hydrogel eingebetteten Gewebe des Wasserbades heraus und gießen Sie die Acrylamidlösung ab. Spülen Sie nun das Tuch vorsichtig mit einer einzigen PBS-Wäsche bei Raumtemperatur aus, um das überschüssige Hydrogel zu entfernen.
3. Schritt der Entfettung
   1. Delipidieren Sie, indem Sie das Gewebe in Natriumdodecylsulfat (8% SDS) in PBS inkubieren. Übertragen Sie das in Hydrogel eingebettete Gewebe aus Schritt 4.2 in eine 8%ige SDS-Lösung in einem konischen 50-ml-Röhrchen. Stellen Sie sicher, dass das Gewebe vollständig in die SDS-Lösung eingetaucht ist und dass das Röhrchen verschlossen ist.
   2. Übertragen Sie das verschlossene 50-ml-Röhrchen mit dem Gewebe in SDS 2 Tage lang (Tag 4 und 5) bei Raumtemperatur auf einen 37 °C heißen Schüttler (200 U/min), um eine Entfettung zu ermöglichen.
      HINWEIS: Stellen Sie sicher, dass die SDS-Lösung bis zu mindestens 20-25 ml in das konische 50-ml-Röhrchen gefüllt ist, um eine eventuelle Verdunstung auszugleichen, die während der 2-tägigen Inkubation bei 37 °C auftreten kann.
4. An den Tagen 4 und 5 wird das Gewebe im SDS bei 37 °C Schüttler (200 U/min) bei Raumtemperatur inkubiert.

5. Waschen Sie das Waschmittel vom gereinigten Tuch ab (Tag 6)

1. Entnehmen Sie das Gewebe aus der SDS-Lösung. Das Gewebe erscheint "klar" oder transparent.
2. Übertragen Sie das Gewebe in ein neues 50-ml-Röhrchen mit PBS-Lösung und waschen Sie es im Laufe des Tages auf einem Schüttler (150-200 U/min) bei Raumtemperatur mit mehreren PBS-Wechseln, um sicherzustellen, dass alle Spuren von SDS entfernt werden. Mindestens 10 Wechsel der PBS-Lösung stellen sicher, dass das Gewebe vom SDS befreit ist, und eine gute Faustregel ist, zu überprüfen, ob die abschließende PBS-Wäsche keine Spuren von Schaum/Schaum aus dem SDS aufweist. Dies ist ein kritischer Schritt, da SDS die nachfolgenden Färbeschritte beeinträchtigen kann.
   HINWEIS: Am Ende des Tages ist das gereinigte Gewebe nach mehreren Wäschen in PBS nun bereit für die Immunfärbung oder kann möglicherweise bis zu 3 Wochen bei 4 °C gelagert werden.
3. Die Lagerung von gereinigtem Darmgewebe für mehr als einen Monat in PBS-Lösung wirkt sich auf die Integrität des Gewebes und die Qualität der Färbung aus. Verwenden Sie das gereinigte Darmgewebe sofort oder innerhalb von 1-2 Wochen nach der Reinigung, um beste Ergebnisse zu erzielen.

6. Immunfluoreszenzfärbung für Neuronen, Gliazellen und enteroendokrine Zellen

1. Das gereinigte Gewebe wird in ein 1,5- oder 2-ml-Röhrchen überführt und über Nacht bei 4 °C in 500 μl Volumen der entsprechenden Primärantikörper inkubiert, verdünnt in 0,5 % normalem Eselsserum in PBS mit 0,3 % Triton X-100. Die verwendeten Antikörper (Ab): Tuj1 oder β-3-Tubulin (Pan neuronaler Marker, 1: 1000), Glial Fibrillary Acid Protein (GFAP, 1: 500), Chromogranin A (1: 250).
2. Nach der Inkubation über Nacht wird das Gewebe 3 PBS-Waschungen (jeweils 5 Minuten mit 1-1,5 ml PBS) unterzogen, um ungebundenes primäres Ab zu entfernen.
3. Übertragen Sie das Gewebe in ein neues Röhrchen und inkubieren Sie es anschließend mit 500 μl geeignetem sekundärem Alexa Fluor Ab (AF) für 1,5 h bei Raumtemperatur im Dunkeln. Die verwendeten sekundären Ab sind AF 488 für Tuj1 (1: 1000), AF-555 für GFAP (1: 500) und AF 555 (1 : 250) für Chromogranin A.
4. Waschen Sie das Gewebe nach der Inkubation dreimal mit PBS wie in Schritt 6.2.
5. Zur Färbung der Zellkerne inkubieren Sie das Gewebe in DAPI (1: 10000 Verdünnung oder 0,2 μl in 2 mL PBS) für 5 min bei Raumtemperatur.
6. Übertragen Sie abschließend das gefärbte Gewebe auf einen sauberen Objektträger, legen Sie Deckglas auf das Gewebe und montieren Sie es mit 100 μl VectaShield für die konfokale Bildgebung.
7. Legen Sie die Objektträger zum Trocknen im Dunkeln bei Raumtemperatur in einen Objektträgerhalter für 30 Minuten, danach können sie abgebildet oder bei -20 °C gelagert werden. Die Wand des Mausdarms ist ziemlich dünn und kann, sobald sie entlang des Mesenteriums geöffnet ist, direkt mit Deckglas auf Glasobjektträger montiert werden. Bei der Arbeit mit größeren Geweben wie Milz, Nieren, Kammer-Objektträgern oder Abstandshaltern können verwendet werden. Für größere Gewebe wie z.B. kann ein Kavitätenschieber zur Montage verwendet werden.
   HINWEIS: Es ist zu beachten, dass, wenn das Darmsegment nicht zu Beginn des Schritts aufgeschnitten wurde (siehe Hinweis in Schritt 1), es ratsam ist, den Darmschlauch mit einer Mikroschere aufzuschneiden, die die Montageschritte erleichtert.

7. Konfokale Bildgebung

HINWEIS: Das geklärte, gefärbte und montierte Gewebe kann sofort abgebildet oder in Objektträgerboxen bei -20°C gelagert werden.

1. Aufnahme mit einem konfokalen Mikroskop (z. B. Olympus FV1000).
2. Nehmen Sie Z-Stacks über eine Dicke von 50 μm des Darmgewebes, um die Regionen vom Darmlumen bis zur Serosalschicht zu visualisieren.
3. Speichern Sie die Z-Stapel-Bilder als Bilddateien, .avi Filmdateien oder konvertieren Sie sie mit Hilfe der Software in 3D-Bilder⁵.

Ergebnisse

Die Bilder aus dem CLARITY-clearierten Darmgewebe der Maus sind in Abbildung 1 dargestellt. Ein erfolgreicher Abschluss des Protokolls führt zu qualitativ hochwertigen, gestochen scharfen Bildern, bei denen alle zellularen Details klar visualisiert werden können. Die DAPI-Färbung für Zellkerne ist ein sehr guter Index zur Beurteilung der Qualität des CLARITY-Protokolls und der anschließenden Immunfärbung, da sie die Gewebeintegrität abbilden kann. Da...

Diskussion

Die CLARITY-Methode ist sehr nützlich für die Färbung des Darms von Mäusen, um verschiedene Zelltypen wie Epithelien, Neuronen und Gliazellen in 3D zu visualisieren, insbesondere das Netzwerk neuronaler Projektionen, das sich über die Darmwand bis zum Lumen⁵ und deren Innervation zu Glia- und EEC-Zellen erstreckt. Die hier vorgestellte Methode wurde entsprechend der Originalstudie von Yang et al. 2014^{modifiziert 1}.

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
4% paraformaldehyde (PFA)  in PBS	ThermoFischer Scientific	J19943	Used for tissue fixation
4',6-Diamidino-2-Phenylindole, Dihydrochloride (DAPI)	ThermoFischer Scientific	D1306	1/10,000 dilution
Alexa Fluor-488	ThermoFischer Scientific	A-11034	1/1000 dilution
Alexa Fluor-555	ThermoFischer Scientific	A-21428	1/500 dilution
Anti- GFAP (Glial Fibrillary Acid Protein)	Abcam	ab7260	1/500 dilution
Anti-beta III Tubulin (or Tuj1)	Abcam	ab18207	1/1000 dilution
Chromogranin A	Abcam	ab15160	1/250 dilution
ProtoGel  30%	National Diagnostics	EC-890	Toxic, hazardous, handle with care- make 4% solution in PBS for use
Sodium dodecyl sulfate	ThermoFischer Scientific	28364	8% in PBS
Vectashield mounting medium	Vector Laboratories	H-1000