JoVE Logo
Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • النتائج
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

تعد زراعة الخلايا الأولية أحد الأساليب المستخدمة بشكل أساسي لدراسة بيولوجيا الخلايا الدبقية الصغيرة في المختبر. هنا ، قمنا بتطوير طريقة لعزل الخلايا الدبقية الصغيرة البسيطة والسريعة من اليوم 1 بعد الولادة (P1) إلى P4.

Abstract

الخلايا الدبقية الصغيرة هي الخلايا البلعمية أحادية النواة في الجهاز العصبي المركزي (CNS) ، والتي تلعب أدوارا رئيسية في الحفاظ على التوازن وتنظيم العملية الالتهابية في الجهاز العصبي المركزي. لدراسة بيولوجيا الخلايا الدبقية الصغيرة في المختبر ، تظهر الخلايا الدبقية الصغيرة الأولية مزايا كبيرة مقارنة بخطوط الخلايا الدبقية الصغيرة الخالدة. ومع ذلك ، فإن عزل الخلايا الدبقية الصغيرة عن دماغ الفأر بعد الولادة أقل كفاءة نسبيا ويستغرق وقتا طويلا. في هذا البروتوكول ، نقدم طريقة سريعة وسهلة المتابعة لعزل الخلايا الدبقية الدقيقة الأولية عن دماغ الفأر حديثي الولادة. تشمل الخطوات العامة لهذا البروتوكول تشريح الدماغ ، وزراعة خلايا الدماغ الأولية ، وعزل الخلايا الدبقية الصغيرة. باستخدام هذا النهج ، يمكن للباحثين الحصول على الخلايا الدبقية الصغيرة الأولية بنقاوة عالية. بالإضافة إلى ذلك ، تمكنت الخلايا الدبقية الصغيرة الأولية المحصودة من الاستجابة لتحدي عديدات السكاريد الدهنية ، مما يشير إلى أنها احتفظت بوظيفتها المناعية. بشكل جماعي ، قمنا بتطوير نهج مبسط لعزل الخلايا الدبقية الصغيرة الأولية بكفاءة مع نقاء عال ، مما يسهل مجموعة واسعة من تحقيقات بيولوجيا الخلايا الدبقية الصغيرة في المختبر.

Introduction

تلعب الخلايا الدبقية الصغيرة ، وهي الخلايا المناعية المقيمة في الجهاز العصبي المركزي (CNS) ، أدوارا محورية في الحفاظ على التوازن ، والتي تستجيب للتحديات المرضية العصبية1. في الآونة الأخيرة ، تم إجراء تحقيقات مكثفة لمعرفة الوظائف الفسيولوجية للخلايا الدبقية الصغيرة ، على سبيل المثال ، في مرض الزهايمر2. حاليا ، يوفر الملف التصويري للخلايا الدبقية الصغيرة بدقة الخلية المفردة التي تم الحصول عليها أثناء تطور الجهاز العصبي المركزي والشيخوخة والمرض فهما أفضل لوظيفة الخلايا الدبقية الصغيرة في الأدمغة السليمةوالمريضة 3. حددت الدراسات السابقة نوعا فرعيا من الخلايا الدبقية الصغيرة المرتبطة بالمرض في مرض الزهايمر والأمراض التنكسية العصبيةالأخرى 4،5،6. هذه المجموعة الفرعية قريبة من ترسب β الأميلويد (Aβ). تم العثور على الجينات المرتبطة بالبلعمة واستقلاب الدهون (على سبيل المثال ، Apoe ، Tyrobp) ليتم تنظيمها في هذه المجموعات السكانية6،7. ومع ذلك ، فإن العمليات تحت الخلوية ومسارات الإشارات خارج الخلية وداخل الخلايا التي تنظم تغيرات المظهر الجزيئي الديناميكي في الخلايا الدبقية الصغيرة ليست مفهومة تماما. على وجه الخصوص ، لا تزال الآلية الكامنة وراء تنشيط الخلايا الدبقية الصغيرة المزمنة في الأمراض التنكسية العصبية بعيدة المنال. لذلك ، من الأهمية بمكان فهم الآليات الخلوية المتورطة في الخلايا الدبقية الصغيرة لأن استجابات الخلايا الدبقية الصغيرة تساهم بوضوح في نمو الدماغ وتطور التنكس العصبي.

على الرغم من وجود بعض الأدوات في الجسم الحي وفي المختبر لدراسة الخلايا الدبقية الصغيرة ، إلا أنه لا تزال هناك بعض القيود. من الصعب تقنيا الحصول على عدد كبير بما يكفي من الخلايا الدبقية الصغيرة ذات النقاء العالي لإجراء التجارب بشكل روتيني ، مثل اللطخة الغربية ، لتوضيح مسارات الإشارات داخل الخلايا. توفر ثقافة الخلايا الدبقية الصغيرة الأولية وسيلة بديلة لدراسة بيولوجيا الخلايا الدبقية الصغيرة. يمكن تطبيق الخلايا الدبقية الصغيرة الأولية المزروعة لتحليل قدرة البلعمة الدبقية الدقيقة بعد التلاعب بالجينات ، وتقييم إنتاج السيتوكينات المؤيدة والمضادة للالتهابات استجابة للمنبهات الالتهابية ، والجوانب البيولوجية الأخرى لفهم أدوارها في الدماغ8. هنا ، نقدم بروتوكولا جديدا ونصف تعليمات خطوة بخطوة لعزل واستزراع الخلايا الدبقية الدقيقة الأولية من دماغ الفئران حديثي الولادة ، مع التركيز على الخطوات الحاسمة للحصول على خلايا دبقية صغيرة أولية صحية ونقية.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

تمت الموافقة على جميع الإجراءات الحيوانية من قبل لجنة أبحاث ولجنة الإدارة المؤسسية لرعاية المختبر في جامعة شنغهاي جياو تونغ. تم بذل كل جهد ممكن لتقليل معاناة.

1. تحضير عازلة الثقافة والقوارير والأغطية

  1. وسط الاستزراع ووسط الاستزراع الدبقي الصغير: مكمل DMEM بنسبة 10٪ FBS لجعل وسط الاستزراع. يتم تصنيع وسط استزراع الخلايا الدبقية الصغيرة عن طريق إضافة 10٪ FBS و 20٪ وسط مكيف LADMAC إلى DMEM. أضف 1٪ بنسلين / ستربتومايسين إلى كلا الوسطين.
    1. لتحضير وسط مكيف بنسبة 20٪ من LADMAC ، اجمع وسط المزرعة من خلايا LADMAC ، وجهاز الطرد المركزي عند 200 × جم لمدة 10 دقائق ، ثم قم بالتصفية باستخدام مصفاة خلية 0.22 ميكرومتر ، ثم قم بتخزين الحصص عند -80 درجة مئوية.
  2. المخزن المؤقت للهضم: قم بإعداد المخزن المؤقت للهضم عن طريق إضافة 8 U / مل من غراء و 125 U / مل DNase إلى DMEM.
    ملاحظة: للحصول على أفضل النتائج ، يجب تحضير المخزن المؤقت للهضم طازجا. احسب الكمية المطلوبة بناء على عدد الجراء (محلول 1 مل لكل 2 صغار).
  3. قوارير الطلاء: استخدم قوارير T25 أو T75 للطلاء المسبق لخلايا الدماغ المعزولة. قبل تشريح الدماغ ، قم بتغطية قوارير T25 ب 2 مل (أو 4 مل لقارورة T75) من 0.1 مجم / مل Poly-D-lysine (PDL) واحتضانها عند 37 درجة مئوية لمدة ساعة واحدة على الأقل. قم بشفط محلول PDL ، واغسلها مرتين باستخدام 1x PBS ، ثم اترك القارورة تجف في الهواء في غطاء مزرعة الخلايا.
    ملاحظة: كان حجم وعدد القوارير المستخدمة في التجربة يعتمد على عدد صغار ما بعد الولادة. للسماح للخلايا بالوصول إلى طبقة الخلايا النجمية المتقاربة في وقت قصير ، قم بإعداد قارورة T25 واحدة ل 3-5 أدمغة ، أو قارورة T75 واحدة ل 5 أدمغة. يمكن تخزين القوارير المطلية غير المستخدمة عند 4 درجات مئوية لمدة تصل إلى شهر. لتوفير الوقت ، يمكن تحضير محلول مخزون 10x (1 مجم / مل) من PDL قبل بدء التجربة وتخزينه عند -20 درجة مئوية كحصص للاستخدام الواحد. خفف الكميات في معقم 1x PBS قبل الاستخدام مباشرة.
  4. تحضير أغطية: اغسل الأغطية الزجاجية التجارية ب 0.1 M HCl لمدة ساعة واحدة ، واشطفها مرتين بماء الأوتوكلاف ، ثم خزنها في الإيثانول بنسبة 100٪. قبل الاستخدام ، قم بإشعال الغطاء باستخدام ملقط ناعم بمصباح موقد لإزالة الإيثانول المتبقي. يمكن وضع أغطية زجاجية مقاس 8 مم في صفيحة 48 بئرا ، ويمكن وضع أغطية زجاجية مقاس 12 مم في لوح 24 بئرا.
  5. تحضير أدوات التشريح: انقع المقص الناعم والملقط والملاعق الدقيقة المصنوعة من الفولاذ المقاوم للصدأ في 75٪ من الإيثانول لمدة 20 دقيقة على الأقل. ثم ضع هذه الأدوات تحت الأشعة فوق البنفسجية في غطاء مزرعة الأنسجة لمدة 30 دقيقة.

2. تشريح دماغ الفأر

ملاحظة: لتقييم فعالية البروتوكول ، استخدمنا هنا الفئران CX3CR1GFP لتتبع الخلايا الدبقيةالصغيرة 9. تم تهجين الفئران CX3CR1GFP / GFP وإناث C57BL / 6J من النوع البري في عمر 2 إلى 8 أشهر لتوليد فئران CX3CR1 + / GFP ، وكلاهما تم الحصول عليه في الأصل من مصادر تجارية. تم إيواء الفئران تحت دورة فاتحة وظلام تتراوح من 12 إلى 12 ساعة في بيئة محددة خالية من مسببات الأمراض (SPF) في جامعة شنغهاي جياو تونغ. يمكن استخدام الجراء من اليوم 1 بعد الولادة إلى اليوم 4 لهذا البروتوكول.

  1. قطع رأس جميع الجراء بالمقص الجراحي. لتقليل التلوث ، اشطف جميع الرؤوس بنسبة 75٪ من الإيثانول وضعها بسرعة في 1x PBS المثلج. في هذه الأثناء ، قم بتسخين عازلة الهضم ووسط الزراعة المشتركة في حمام مائي 37 درجة مئوية.
    ملاحظة: قطع رأس وعزل أنسجة المخ من جرو واحد في كل مرة للحفاظ على السلامة الهيكلية. لمنع التلوث ، يجب وضع جميع الأدوات الجراحية في 75٪ من الإيثانول بين قطع الرأس.
  2. استخدم مقص تشريح ناعم لقطع الجمجمة مع النخاع المستطيل. ضع ملعقة صغيرة من الفولاذ المقاوم للصدأ أسفل أنسجة المخ من موقع القطع للضغط على الدماغ من تجويف الرأس. انقله إلى صفيحة جديدة مبردة من 6 آبار تحتوي على 2 مل من 1x PBS قبل البرودة لكل بئر.
  3. اقطع وتخلص من المخيخ والبصيلات الشمية. انقل أنسجة المخ المتبقية برفق إلى صفيحة مبردة من 6 آبار تحتوي على 2 مل من 1x PBS قبل البرودة.
    ملاحظة: ضع 4-5 أنسجة دماغية في بئر واحد.
  4. كرر نفس الإجراء للرؤوس المتبقية حتى يتم جمع كل الأنسجة.

3. زرع الخلايا الأولية المختلطة

  1. استنشق 1.5 مل من 1x PBS في اللوحة المكونة من 6 آبار ، وقم بفرم أنسجة المخ بالكامل إلى قطع صغيرة (حوالي 1 مم2) بمساعدة مقص الربيع.
    ملاحظة: لتقليل كمية الحطام الناعم ، لا تفرط في فرم الأنسجة.
  2. أضف الكمية المطلوبة من محلول الهضم إلى البئر (0.5 مل من عازلة الهضم لكل دماغ) ، ثم ضع الطبق في الحاضنة المرطبة بنسبة 5٪ ثاني أكسيد الكربون2 ، 37 درجة مئوية لمدة 20 دقيقة. حرك الطبق كل 10 دقائق.
    ملاحظة: خلال وقت الحضانة ، بلل مصفاة خلية 70 ميكرومتر بوسط مزرعة (10٪ FBS في DMEM) ، ثم ضع مصفاة الخلية على أنبوب تجميع جديد سعة 50 مل.
  3. أخرج الطبق من الحاضنة وقم بإنهاء هضم غراء بإضافة 3 مل من وسط الثقافة إلى كل بئر. قم بتحريك ماصة الخلايا لأعلى ولأسفل بشكل معتدل 10 مرات باستخدام ماصة سعة 1 مل. انقلي الخليط إلى أنبوب سعة 15 مل واتركيه يستقر لمدة 1 دقيقة. يمكن رؤية حبيبات خلية غائمة في الأسفل. لإزالة الكتل الكبيرة وحطام الخلايا ، قم بتمرير معلق الخلية بعناية عبر مصفاة خلية 70 ميكرومتر واجمع التدفق في أنبوب التجميع سعة 50 مل.
  4. أضف 3 مل من وسط الاستزراع الدافئ (10٪ FBS في DMEM) إلى حبيبات الخلية غير المنفصلة في أنبوب 15 مل. ثلاثي الأبعاد 10 مرات كما في الخطوات 3.3 لمواصلة التفكك. دع الأنسجة تستقر لمدة 1 دقيقة ثم مرر تعليق الخلية عبر المصفاة إلى أنبوب التجميع سعة 50 مل. كرر هذه الخطوة ، وتخلص من بقايا الخلية المتبقية.
  5. انقل معلق الخلية من أنبوب التجميع سعة 50 مل إلى أنابيب سعة 15 مل وقم بالطرد المركزي للخلايا عند 200 × جم لمدة 10 دقائق في درجة حرارة الغرفة.
  6. استنشق المادة الطافية ، وأعد تعليق الخلايا في 5 مل من وسط الثقافة. قم بزرع الخلايا الأولية في قارورة T25 أو T75 بكثافة خلية تبلغ حوالي 5 × 106 وزراعتها في الحاضنة المرطبة (5٪ CO2 ، 37 °C). هذا هو اليوم 0 في هذا الجدول الثقافي.
    ملاحظة: إذا تم زرع الخلايا في قارورة T25 ، فإن الحجم النهائي البالغ 5 مل متوسط لكل قارورة كاف. أضف 5 مل إضافية من وسط الاستزراع إلى كل قارورة عند زرعها في قارورة T75.

4. مجموعة الخلايا الدبقية الصغيرة الأولية

  1. تقييم التقاء الخلايا المختلطة في اليوم التالي (اليوم 1). نظرا لأن الخلايا المختلطة تم زرعها بكثافة عالية جدا ، فإن الأمر يستغرق من 3 إلى 4 أيام حتى تصل الخلايا النجمية إلى التقاء ، مما يسمح بجمع الخلايا الدبقية الصغيرة بعد 1-2 أيام.
    ملاحظة: كن حذرا إذا لم يتم ربط الخلايا بأسفل القارورة في اليوم التالي. قد يكون بسبب تلوث الخلايا أو موت الخلايا الناجم عن الإفراط في الهضم أو التعامل القاسي.
  2. في اليوم 2 ، اغسل القوارير ب 3 مل من 1x PBS الدافئ مرتين وقم بتغيير الوسط بإضافة 3-5 مل من وسط الاستزراع الطازج إلى كل قارورة T25 (7-10 مل لقارورة T75). يحتوي وسط الاستزراع المهمل على بقايا الخلايا وأنواع مختلفة من الخلايا ، بما في ذلك الخلايا العصبية والخلايا الدبقية قليلة التغصن والخلايا الدبقية الصغيرة.
  3. في اليوم 4 ، تأكد من أن الخلايا النجمية المتصلة بالجزء السفلي من القارورة عند التقاء 100٪. وفي الوقت نفسه ، ترتبط مجموعة سكانية فرعية من الخلايا الدبقية الصغيرة بشكل فضفاض بالطبقة السطحية للخلية المختلطة والتي يمكن أن تنفصل بسهولة عن السطح وتطفو في وسط الاستزراع عن طريق المصافحة. انقل وسط الاستزراع إلى صفيحة جديدة مكونة من 6 آبار ، ويتم جمع الخلايا الدبقية الصغيرة الأولية المخصبة في الوسط أثناء هذه العملية. بعد ذلك ، قم بتزويد الخلايا الموجودة على اللوحة الأصلية المكونة من 6 آبار بوسط ثقافة طازج لمزيد من جمع الخلايا.
    ملاحظة: يعد النقر على القوارير الموجودة على الطاولة أو هز القوارير على شاكر المختبر عند 180 دورة في الدقيقة لمدة 30 دقيقة قبل النقل المتوسط مناسبا لإنتاج المزيد من الخلايا.
  4. ضع 6 بئر بعناية في الحاضنة للسماح بربط الخلية. بعد حوالي 2 ساعة من الحضانة ، سيتم ربط جميع الخلايا باللوحة. عندما يتم إرفاق الخلايا ، اغسلها برفق باستخدام 1x PBS دافئ مرتين لإزالة مجاميع الخلايا وحطام الخلايا ؛ بعد ذلك ، قم بتزويد الخلايا ب 3 مل من وسط زراعة الخلايا الدبقية الصغيرة الطازجة. يمكن الحفاظ على خلايا الخلايا الدبقية الصغيرة المعزولة لأكثر من شهر في المختبر عن طريق تحديث وسط زراعة الخلايا الدبقية الصغيرة كل يومين.
    ملاحظة: العامل المحفز للمستعمرة 1 (CSF1) هو عامل نمو مهم لدعم بقاء الخلايا الدبقية الصغيرة في المختبر. تشير الدراسات السابقة إلى أنه يمكن إفراز السائل الدماغي النخاعي 1 من خط خلايا LADMAC ، وهو خط خلوي متحول نشأ من خلايا نخاع عظم الفأر. يمكن جمع الوسط المكيف LADMAC عن طريق الطرد المركزي لثقافة LADMAC عند 200 × جم لمدة 10 دقائق. ثم مرر المادة الطافية عبر مصفاة خلية 0.22 ميكرومتر. تم تحضير وسط الاستزراع الدبقي بإضافة 20٪ وسط مكيف LADMAC إلى وسط الاستزراع (10٪ FBS ، DMEM).
  5. كل 2-3 أيام ، استمر في جمع الخلايا الدبقية الصغيرة من وسط زراعة الخلايا المختلطة كما في الخطوة 4.4. استزراع الخلايا المختلطة المتبقية في القارورة واستخدمها لحصاد الخلايا الدبقية الصغيرة باستمرار كل 2-3 أيام لمدة تصل إلى شهر واحد.
    ملاحظة: يمكن حصاد الخلايا الدبقية الصغيرة بنجاح عن طريق جمع خلايا الثقافة المختلطة ذات الشكل المتوسط لمدة تصل إلى 50 يوما. في كل مرة ، ينتج عن وسط الزراعة المشتركة التي تم جمعها حوالي ~ 1-3 × 105 خلايا دبقية صغيرة لكل قارورة T75. اجمع بين الخلايا الدبقية الصغيرة ، إذا لزم الأمر.
  6. استخدم الخلايا الدبقية الصغيرة الأولية للفحص الوظيفي المطلوب.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

النتائج

تم عرض الخلايا الدبقية الصغيرة الأولية التي تم جمعها من CX3CR1 + / GFP في اليوم 7 واليوم 35 بعد بذر الخلايا في الشكل 1. كما هو موضح في تلطيخ التألق المناعي لعلامة الخلايا الدبقية الصغيرة / البلاعم IBA1 ، فإن جميع الخلايا الإيجابية IBA1 إيجابية لإشارات GFP ، وسلبية...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

يعتمد هذا البروتوكول على الطرق الموضحة سابقا مع بعض التعديلات11. يتم سرد نصائح لتحسين صلاحية ونقاء الخلايا الدبقية الصغيرة المعزولة على النحو التالي. أولا ، احرص على تجنب التلوث عند تحضير المخازن المؤقتة المستخدمة لعزل الأنسجة وزراعة الخلايا. تأكد من أن أدو...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

كشف جميع المؤلفين أنه لا يوجد تضارب في المصالح. يعلن جميع المؤلفين عدم وجود مصالح مالية متنافسة.

Acknowledgements

يود المؤلفون إظهار احترامهم للأبطال الذين يكافحون تفشي COVID-19. يشكر المؤلفون فانغ لي (جامعة فودان) على إدارة المختبرات الممتازة ، والدكتور زيكاي تشو ، والدكتور جينغ لي ، والدكتور جويكينغ خه (مركز شنغهاي للصحة العقلية) لمناقشة عزل الخلايا الدبقية الصغيرة. أخيرا وليس آخرا ، يظهر المؤلفون امتنانهم واحترامهم لجميع التي تم التضحية بها في هذه الدراسة. تم دعم هذه الدراسة من قبل البرنامج الوطني للبحث والتطوير الرئيسي في الصين (المنحة رقم 2017YFC0111202) (BP) ، والمؤسسة الوطنية للعلوم الطبيعية في الصين (المنحة رقم 31922027) (BP) و (المنحة رقم 32000678) (Y.R.) ، وبرنامج Shenzhen لأبحاث العلوم والتكنولوجيا (المنحة رقم. JCYJ20180507182033219 و JCYJ20170818163320865) (B.P.) و (رقم المنحة. JCYJ20170818161734072) (S.X.).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
Cell strainers, 40 µmThermoFisher Scientific22-363-547
DNase I Sigma11284932001
Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM)Gibco by Life TechnologiesC11995500BT
Dulbecco's Phosphate Buffered Saline (DPBS)Gibco by Life Technologies14190-144
Fetal Bovine Serum (FBS)Gibco by Life Technologies10099141
Papain, SuspensionSangon BiotechPapain, Suspension
Penicillin-Streptomycin 100X solutionHycloneSV30010
Poly-D-LysineThermoFisher ScientificA3890401

References

  1. Prinz, M., Jung, S., Priller, J. Microglia biology: one century of evolving concepts. Cell. 179 (2), 292-311 (2019).
  2. Perry, V. H., Nicoll, J. A., Holmes, C. Microglia in neurodegenerative disease. Nature Reviews. Neurology. 6 (4), 193-201 (2010).
  3. Parker, K. R., et al. Single-cell analyses identify brain mural cells expressing CD19 as potential off-tumor targets for CAR-T immunotherapies. Cell. 183 (1), 126-142 (2020).
  4. Tay, T. L., Dautzenberg, J. S., Grun, D., Prinz, M. Unique microglia recovery population revealed by single-cell RNAseq following neurodegeneration. Acta Neuropathologica Communications. 6 (1), 87(2018).
  5. Deczkowska, A., et al. Disease-associated microglia: a universal immune sensor of neurodegeneration. Cell. 173 (5), 1073-1081 (2018).
  6. Keren-Shaul, H., et al. A unique microglia type associated with restricting development of Alzheimer's disease. Cell. 169 (7), 1276-1290 (2017).
  7. Krishnaswami, S. R., et al. Using single nuclei for RNA-seq to capture the transcriptome of postmortem neurons. Nature Protocols. 11 (3), 499-524 (2016).
  8. Timmerman, R., Burm, S. M., Bajramovic, J. J. An overview of in vitro methods to study microglia. Frontiers in Cellular Neuroscience. 12, 242(2018).
  9. Huang, Y., et al. Repopulated microglia are solely derived from the proliferation of residual microglia after acute depletion. Nature Neuroscience. 21 (4), 530-540 (2018).
  10. Garcia, J. A., Cardona, S. M., Cardona, A. E. Analyses of microglia effector function using CX3CR1-GFP knock-in mice. Methods in Molecular Biology. 1041, 307-317 (2013).
  11. Lian, H., Roy, E., Zheng, H. Protocol for primary microglial culture preparation. Bio-protocol. 6 (21), (2016).
  12. Tamashiro, T. T., Dalgard, C. L., Byrnes, K. R. Primary microglia isolation from mixed glial cell cultures of neonatal rat brain tissue. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (66), e3814(2012).
  13. Caldeira, C., et al. Microglia change from a reactive to an age-like phenotype with the time in culture. Frontiers in Cellular Neuroscience. 8, 152(2014).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved