Aislamiento primario de microglía a partir de cerebros de ratones postnatales

Resumen

El cultivo celular primario es uno de los enfoques más utilizados para estudiar la biología microglial in vitro. Aquí, desarrollamos un método para el aislamiento simple y rápido de la microglía desde el día postnatal del ratón 1 (P1) hasta el P4.

Resumen

La microglía son los fagocitos mononucleares del sistema nervioso central (SNC), que desempeñan un papel clave en el mantenimiento de la homeostasis y la regulación del proceso inflamatorio en el SNC. Para estudiar la biología microglial in vitro, la microglía primaria muestra grandes ventajas en comparación con las líneas celulares microgliales inmortalizadas. Sin embargo, el aislamiento de la microglía del cerebro de ratón postnatal es relativamente menos eficiente y requiere mucho tiempo. En este protocolo, proporcionamos un método rápido y fácil de seguir para aislar la microglía primaria del cerebro de ratón neonatal. Los pasos generales de este protocolo incluyen la disección del cerebro, el cultivo primario de células cerebrales y el aislamiento de la microglía. Con este enfoque, los investigadores pueden obtener microglía primaria con alta pureza. Además, la microglía primaria recolectada fue capaz de responder al desafío de los lipopolisacáridos, lo que indica que conservaron su función inmunitaria. Colectivamente, desarrollamos un enfoque simplificado para aislar de manera eficiente la microglía primaria con alta pureza, lo que facilita una amplia gama de investigaciones de biología microglial in vitro.

Introducción

La microglía, las células inmunitarias residentes en el sistema nervioso central (SNC), desempeñan un papel fundamental en el mantenimiento de la homeostasis, que responde a los desafíos neuropatológicos¹. Recientemente, se han llevado a cabo investigaciones intensivas para descubrir las funciones fisiológicas de la microglía, por ejemplo, en la enfermedad de Alzheimer². En la actualidad, el perfil transcripcional de la microglía a la resolución de una sola célula obtenida durante el desarrollo del SNC, el envejecimiento y la enfermedad proporciona una mejor comprensión de la función microglial en^{cerebros sanos} y enfermos. Estudios previos identificaron un subtipo microglial asociado a la enfermedad en la EA y otras enfermedades neurodegenerativas ^4,5,6. Esta subpoblación es proximal al depósito de β amiloide (Aβ). Se encontró que los genes asociados con la fagocitosis y el metabolismo de los lípidos (p. ej., Apoe, Tyrobp) están regulados al alza en estas poblaciones ^6,7. Sin embargo, los procesos subcelulares, las vías de señalización extracelular e intracelular que regulan los cambios dinámicos en el perfil molecular en la microglía no se comprenden completamente. En particular, el mecanismo que subyace a la activación microglial crónica en las enfermedades neurodegenerativas sigue siendo difícil de alcanzar. Por lo tanto, es crucial comprender los mecanismos celulares involucrados en la microglía, ya que las respuestas de la microglía contribuyen claramente al desarrollo del cerebro y a la progresión de la neurodegeneración.

Aunque existen un par de herramientas in vivo e in vitro para estudiar la microglía, todavía existen algunas limitaciones. Es técnicamente difícil obtener un número suficientemente grande de células microgliales con alta pureza para llevar a cabo experimentos rutinarios, como el Western blot, para dilucidar las vías de señalización intracelular. El cultivo primario de microglía proporciona un medio alternativo para estudiar la biología de la microglía. La microglía primaria cultivada se puede aplicar para analizar la capacidad fagocítica de la microglía después de la manipulación génica y evaluar la producción de citocinas proinflamatorias y antiinflamatorias en respuesta a estímulos inflamatorios, y otros aspectos biológicos para comprender sus roles en el cerebro⁸. Aquí, presentamos un nuevo protocolo y describimos una instrucción paso a paso para el aislamiento y cultivo de microglía primaria a partir de cerebro de ratón neonatal, con énfasis en los pasos que son críticos para obtener células microgliales primarias sanas y puras.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocolo

Todos los procedimientos con animales fueron aprobados por el comité de Investigación Animal y el panel de administración institucional de cuidado de animales de laboratorio de la Universidad Jiao Tong de Shanghai. Se ha hecho todo lo posible para minimizar el sufrimiento de los animales.

1. Preparación del tampón de cultivo, matraces y cubreobjetos

1. Medio de cultivo y medio de cultivo de microglía: Complementar DMEM con un 10% de FBS para hacer el medio de cultivo. El medio de cultivo de microglía se fabrica añadiendo un 10% de FBS y un 20% de medio acondicionado LADMAC al DMEM. Agregue 1% de penicilina/estreptomicina a ambos medios.
   1. Para preparar el medio acondicionado LADMAC al 20%, recoja el medio de cultivo de las células LADMAC, centrifugue a 200 x g durante 10 min, filtre con un colador de células de 0,22 μm y, a continuación, almacene las alícuotas a -80 °C.
2. Tampón de digestión: Prepare el tampón de digestión añadiendo 8 U/mL de papaína y 125 U/mL de DNasa al DMEM.
   NOTA: Para obtener los mejores resultados, el tampón de digestión debe prepararse fresco. Calcule la cantidad deseada en función del número de cachorros (1 ml de solución por cada 2 cachorros).
3. Matraces de recubrimiento: Utilice matraces T25 o T75 para pre-sembrar las células cerebrales aisladas. Antes de la disección del cerebro, rebozar los matraces T25 con 2 mL (o 4 mL para un matraz T75) de 0,1 mg/mL de Poly-D-lisina (PDL) e incubar a 37 °C durante al menos 1 h. Aspire la solución de PDL, lave dos veces con 1x PBS y luego deje que el matraz se seque al aire en la campana de cultivo celular.
   NOTA: El tamaño y el número de frascos utilizados en el experimento dependieron del número de cachorros postnatales. Para permitir que las células lleguen a la capa de células de astrocitos confluentes en poco tiempo, prepare un matraz T25 para 3-5 cerebros, o un matraz T75 para 5 cerebros. Los matraces recubiertos sin usar pueden almacenarse a 4 °C durante un máximo de un mes. Para ahorrar tiempo, se puede preparar una solución madre de PDL 10x (1 mg/mL) antes del inicio del experimento y almacenarla a -20 °C como alícuotas de un solo uso. Diluya las alícuotas en 1x PBS estéril justo antes de usar.
4. Prepare los cubreobjetos: Lave los cubreobjetos de vidrio comercial con 0,1 M HCl durante 1 h, enjuague dos veces con agua de autoclave y luego guárdelos en etanol al 100%. Antes de usar, flamee los cubreobjetos con pinzas finas con una lámpara de quemador para eliminar el etanol residual. Los cubreobjetos de vidrio de 8 mm se pueden colocar en una placa de 48 pocillos, y los cubreobjetos de vidrio de 12 mm se pueden colocar en una placa de 24 pocillos.
5. Prepare las herramientas de disección: Remoje las tijeras finas, las pinzas y las microcucharas de acero inoxidable en etanol al 75% durante al menos 20 minutos. A continuación, coloque estas herramientas bajo radiación ultravioleta en la campana de cultivo de tejidos durante 30 minutos.

2. Disección del cerebro de ratón

NOTA: Para evaluar la eficacia del protocolo, aquí utilizamos ratones knock-in CX3CR1^GFP para el rastreo de la microglía⁹. Los ratones CX3CR1^GFP/GFP y las hembras C57BL/6J de tipo salvaje a los 2 a 8 meses se cruzaron para generar ratones CX3CR1^+/GFP , ambos se obtuvieron originalmente de fuentes comerciales. Los ratones se alojaron bajo un ciclo de luz-oscuridad de 12-12 h en un entorno específico libre de patógenos (SPF) en la Universidad Jiao Tong de Shanghai. Las crías desde el día 1 hasta el día 4 después del parto se pueden utilizar para este protocolo.

1. Decapita a todos los cachorros con tijeras quirúrgicas. Para minimizar la contaminación, enjuague todos los cabezales con etanol al 75% y colóquelos rápidamente en el PBS 1x helado. Mientras tanto, calentar el tampón de digestión y el medio de cocultivo en un baño de agua a 37 °C.
   NOTA: Decapitar y aislar el tejido cerebral de un cachorro a la vez para preservar la integridad estructural. Para evitar la contaminación, todos los instrumentos quirúrgicos deben colocarse en etanol al 75% entre la decapitación.
2. Use tijeras finas de disección para cortar el cráneo junto con el bulbo raquídeo. Coloque una microcuchara de acero inoxidable debajo del tejido cerebral desde el sitio de corte para exprimir el cerebro de la cavidad de la cabeza. Transfiéralo a una nueva placa refrigerada de 6 pocillos que contenga 2 mL de prefrío 1x PBS por pocillo.
3. Corta y desecha el cerebelo y los bulbos olfativos. Transfiera suavemente el tejido cerebral restante a una placa fría de 6 pocillos que contenga 2 ml de 1x PBS prefrío.
   NOTA: Coloque 4-5 tejidos cerebrales en un pocillo.
4. Repita el mismo procedimiento para las cabezas restantes hasta que se recoja todo el tejido.

3. Siembra las células primarias mezcladas

1. Aspire 1,5 ml de 1x PBS en la placa de 6 pocillos y triture completamente el tejido cerebral en trozos pequeños (aproximadamente 1 mm²) con la ayuda de unas tijeras de resorte.
   NOTA: Para reducir la cantidad de residuos finos, no pique demasiado el pañuelo.
2. Añada la cantidad deseada de tampón de digestión al pocillo (0,5 mL de tampón de digestión por cerebro), luego coloque la placa en la incubadora humidificada al 5% de CO₂, a 37 °C durante 20 min. Agite el plato cada 10 minutos.
   NOTA: Durante el tiempo de incubación, humedezca un colador de células de 70 μm con medio de cultivo (10% de FBS en DMEM) y luego coloque el colador de células en un tubo de recolección nuevo de 50 mL.
3. Saque la placa de la incubadora y termine la digestión de la papaína agregando 3 mL de medio de cultivo a cada pocillo. Pipetea suavemente las células hacia arriba y hacia abajo 10 veces con una pipeta de 1 mL. Transfiera la mezcla a un tubo de 15 ml y déjela reposar durante 1 minuto. En la parte inferior se puede ver una bolita de celda turbia. Para eliminar los grumos grandes y los restos de células, pase con cuidado la suspensión de células a través de un filtro de células de 70 μm y recoja el flujo en el tubo de recolección de 50 ml.
4. Agregue 3 mL de medio de cultivo calentado (10% FBS en DMEM) a la pellet de célula no disociada en el tubo de 15 mL. Triture 10 veces como en los pasos 3.3 para continuar la disociación. Deje que el tejido se asiente durante 1 minuto y luego pase la suspensión celular a través del colador hasta el tubo de recolección de 50 mL. Repita este paso y deseche los restos de celda restantes.
5. Transfiera la suspensión celular del tubo de recolección de 50 mL a tubos de 15 mL y centrifugue las celdas a 200 x g durante 10 min a temperatura ambiente.
6. Aspirar el sobrenadante y resuspender las células en 5 mL de medio de cultivo. Siembre las células primarias en un matraz T25 o T75 con una densidad celular de aproximadamente 5 x 10⁶ y cultive en la incubadora humidificada (5% de CO₂, 37 °C). Este es el día 0 en este horario cultural.
   NOTA: Si las células se siembran en un matraz T25, un volumen final de 5 mL de medio por matraz es suficiente. Agregue 5 mL adicionales de medio de cultivo a cada matraz cuando se siembre en un matraz T75.

4. Recolección de microglía primaria

1. Evaluar la confluencia de las células mezcladas al día siguiente (Día 1). Dado que las células mezcladas se sembraron a una densidad bastante alta, los astrocitos tardan entre 3 y 4 días en alcanzar la confluencia, lo que permite recolectar la microglía 1 o 2 días después.
   NOTA: Tenga cuidado si las células no están adheridas al fondo del matraz al día siguiente; Puede deberse a la contaminación celular o a la muerte celular causada por una digestión excesiva o una manipulación brusca.
2. El día 2, lave los matraces con 3 mL de PBS 1x tibio dos veces y cambie el medio añadiendo 3-5 mL de medio de cultivo fresco a cada matraz T25 (7-10 mL para un matraz T75). El medio de cultivo desechado contiene restos celulares y varios tipos de células, incluidas neuronas, oligodendrocitos y microglía.
3. El día 4, asegúrese de que los astrocitos adheridos al fondo del matraz estén al 100% de confluencia. Mientras tanto, una subpoblación de microglía está débilmente unida a la capa superficial de la célula mixta que puede desprenderse fácilmente de la superficie y flotar en el medio de cultivo mediante un apretón de manos. Transfiera el medio de cultivo a una placa fresca de 6 pocillos, y durante este proceso se recolectará la microglía primaria enriquecida en el medio. A continuación, proporcione a las células de la placa original de 6 pocillos un medio de cultivo fresco para una mayor recolección de células.
   NOTA: Golpear los matraces en la mesa o agitar los matraces en un agitador de laboratorio a 180 rpm durante 30 minutos antes de la transferencia del medio es apropiado para producir más celdas.
4. Coloque con cuidado los 6 pocillos en la incubadora para permitir la fijación de las células. Aproximadamente 2 h después de la incubación, todas las células se unirán a la placa. Cuando las células estén unidas, lávelas suavemente con PBS tibio 1x dos veces para eliminar los agregados celulares y los desechos celulares; luego, suministre a las células 3 mL de medio de cultivo de microglía fresco. Las células de microglía aisladas se pueden mantener durante más de un mes in vitro refrescando el medio de cultivo de microglía cada 2 días.
   NOTA: El factor estimulante de colonias 1 (CSF1) es un factor de crecimiento importante para apoyar la supervivencia de la microglía in vitro. Estudios anteriores informan que CSF1 puede secretarse a partir de la línea celular LADMAC, que es una línea celular transformada originada a partir de células de médula ósea de ratón. El medio acondicionado LADMAC se puede recolectar centrifugando el cultivo LADMAC a 200 x g durante 10 min; A continuación, pase el sobrenadante a través de un filtro de células de 0,22 μm. El medio de cultivo de microglía se preparó añadiendo un 20% de medio acondicionado LADMAC al medio de cultivo (10% FBS, DMEM).
5. Cada 2-3 días, continúe recolectando la microglía del medio de cultivo celular mezclado como en el paso 4.4. Cultive las células mezcladas restantes en el matraz y utilícelas para recolectar microglía de manera constante cada 2-3 días durante un máximo de 1 mes.
   NOTA: La microglía se puede cosechar con éxito recolectando el medio en células de cultivo mixto durante un máximo de 50 días. Cada vez, el medio de cocultivo recolectado producirá aproximadamente ~ 1-3 x 10⁵ células de microglía por matraz T75. Combine las células microgliales, si es necesario.
6. Utilice células microgliales primarias para el ensayo funcional deseado.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Resultados

En la Figura 1 se demostró la microglía primaria recolectada de CX3CR1^+/GFP en el día 7 y el día 35 después de la siembra de células. Como se muestra en la tinción por inmunofluorescencia del marcador de células IBA1 de microglía/macrófago, todas las células positivas para IBA1 son positivas para las señales de GFP y negativas para S100β (marcador de astrocitos) y CC1 (marcador de oligodendrocitos), lo que sugiere que las células pos...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discusión

Este protocolo se basa en los métodos descritos anteriormente con algunas modificaciones¹¹. A continuación se enumeran consejos para mejorar la viabilidad y la pureza de la microglía aislada. En primer lugar, tenga cuidado de evitar la contaminación al preparar los tampones utilizados para el aislamiento de tejidos y el cultivo celular. Asegúrese de que las herramientas quirúrgicas, los recipientes y el equipo de plástico estén estériles. Por lo general, ...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
Cell strainers, 40 µm	ThermoFisher Scientific	22-363-547
DNase I	Sigma	11284932001
Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM)	Gibco by Life Technologies	C11995500BT
Dulbecco's Phosphate Buffered Saline (DPBS)	Gibco by Life Technologies	14190-144
Fetal Bovine Serum (FBS)	Gibco by Life Technologies	10099141
Papain, Suspension	Sangon Biotech	Papain, Suspension
Penicillin-Streptomycin 100X solution	Hyclone	SV30010
Poly-D-Lysine	ThermoFisher Scientific	A3890401