Primäre Mikroglia-Isolierung aus postnatalen Mausgehirnen

Zusammenfassung

Die primäre Zellkultur ist einer der primär genutzten Ansätze zur Erforschung der Mikrogliabiologie in vitro. In dieser Arbeit haben wir eine Methode zur einfachen und schnellen Isolierung von Mikroglia von der Maus am postnatalen Tag 1 (P1) bis zum P4 entwickelt.

Zusammenfassung

Mikroglia sind die mononukleären Fresszellen im Zentralnervensystem (ZNS), die eine Schlüsselrolle bei der Aufrechterhaltung der Homöostase und der Regulierung des Entzündungsprozesses im ZNS spielen. Um die Mikrogliabiologie in vitro zu untersuchen, zeigen primäre Mikroglia große Vorteile im Vergleich zu immortalisierten Mikrogliazelllinien. Die Isolierung von Mikroglia aus dem postnatalen Gehirn von Mäusen ist jedoch relativ weniger effizient und zeitaufwändig. In diesem Protokoll bieten wir eine schnelle und einfach zu befolgende Methode zur Isolierung primärer Mikroglia aus dem neonatalen Mausgehirn. Die Gesamtschritte dieses Protokolls umfassen die Dissektion des Gehirns, die primäre Gehirnzellkultur und die Isolierung von Mikroglia. Mit diesem Ansatz können Forscher primäre Mikroglia mit hoher Reinheit erhalten. Darüber hinaus waren die geernteten primären Mikroglia in der Lage, auf die Lipopolysaccharid-Herausforderung zu reagieren, was darauf hindeutet, dass sie ihre Immunfunktion behielten. Gemeinsam haben wir einen vereinfachten Ansatz entwickelt, um primäre Mikroglia effizient und mit hoher Reinheit zu isolieren, der ein breites Spektrum an mikrogliabiologischen Untersuchungen in vitro ermöglicht.

Einleitung

Mikroglia, die residenten Immunzellen im Zentralnervensystem (ZNS), spielen eine zentrale Rolle bei der Aufrechterhaltung der Homöostase, die auf die neuropathologischen Herausforderungen reagiert¹. In jüngster Zeit wurden intensive Untersuchungen durchgeführt, um die physiologischen Funktionen von Mikroglia herauszufinden, z.B. bei der Alzheimer-Krankheit². Derzeit ermöglicht das Transkriptionsprofil von Mikroglia mit der Einzelzellauflösung, das während der ZNS-Entwicklung, des Alterns und der Krankheit erhalten wurde, ein besseres Verständnis der Mikrogliafunktion in gesunden und kranken Gehirnen³. Frühere Studien identifizierten einen krankheitsassoziierten Mikroglia-Subtyp bei AD und anderen neurodegenerativen Erkrankungen ^4,5,6. Diese Subpopulation befindet sich proximal zur Amyloid-β (Aβ)-Ablagerung. Es wurde festgestellt, dass Gene, die mit Phagozytose und Fettstoffwechsel assoziiert sind (z. B. Apoe, Tyrobp), in diesen Populationen hochreguliert sind ^6,7. Die subzellulären Prozesse, extrazellulären und intrazellulären Signalwege, die die dynamischen molekularen Profiländerungen in Mikroglia regulieren, sind jedoch nicht vollständig verstanden. Insbesondere der Mechanismus, der der chronischen Mikrogliaaktivierung bei neurodegenerativen Erkrankungen zugrunde liegt, ist nach wie vor schwer fassbar. Daher ist es von entscheidender Bedeutung, die an Mikroglia beteiligten zellulären Mechanismen zu verstehen, da die Reaktionen der Mikroglia eindeutig zur Entwicklung des Gehirns und zum Fortschreiten der Neurodegeneration beitragen.

Obwohl es eine Reihe von In-vivo- und In-vitro-Werkzeugen zur Untersuchung von Mikroglia gibt, gibt es immer noch einige Einschränkungen. Es ist technisch schwierig, eine ausreichend große Anzahl von Mikrogliazellen mit hoher Reinheit für die routinemäßige Durchführung von Experimenten, wie z. B. Western Blot, zur Aufklärung intrazellulärer Signalwege zu erhalten. Die primäre Mikroglia-Kultur bietet ein alternatives Mittel, um die Biologie der Mikroglia zu untersuchen. Die kultivierten primären Mikroglia können verwendet werden, um die phagozytische Kapazität der Mikroglia nach Genmanipulation zu analysieren und die Produktion von pro- und antiinflammatorischen Zytokinen als Reaktion auf Entzündungsreize und andere biologische Aspekte zu bewerten, um ihre Rolle im Gehirn zu verstehen⁸. Hier stellen wir ein neues Protokoll vor und beschreiben eine Schritt-für-Schritt-Anleitung für die Isolierung und Kultivierung von primären Mikroglia aus neonatalen Mausgehirnen, wobei der Schwerpunkt auf den Schritten liegt, die für die Gewinnung gesunder und reiner primärer Mikrogliazellen entscheidend sind.

Protokoll

Alle tierexperimentellen Verfahren wurden vom Ausschuss für Tierversuche und dem institutionellen Verwaltungsausschuss für die Pflege von Versuchstieren an der Shanghai Jiao Tong Universität genehmigt. Es wurden alle Anstrengungen unternommen, um das Leid der Tiere so gering wie möglich zu halten.

1. Vorbereitung von Kulturpuffer, Kolben und Deckgläsern

1. Nährmedium und Mikroglia-Kulturmedium: Ergänzen Sie DMEM mit 10 % FBS, um das Kulturmedium herzustellen. Das Mikroglia-Kulturmedium wird hergestellt, indem dem DMEM 10 % FBS und 20 % LADMAC-konditioniertes Medium zugesetzt werden. Fügen Sie 1% Penicillin/Streptomycin zu beiden Medien hinzu.
   1. Zur Herstellung von 20 % LADMAC-konditioniertem Medium wird das Kulturmedium aus den LADMAC-Zellen entnommen, 10 Minuten lang bei 200 x g zentrifugiert, mit einem 0,22-μm-Zellsieb filtriert und die Aliquote dann bei -80 °C gelagert.
2. Aufschlusspuffer: Bereiten Sie den Aufschlusspuffer vor, indem Sie DMEM 8 U/ml Papain und 125 U/ml DNase hinzufügen.
   HINWEIS: Für beste Ergebnisse sollte der Aufschlusspuffer frisch zubereitet werden. Berechnen Sie die gewünschte Menge basierend auf der Anzahl der Welpen (1 ml Lösung pro 2 Jungtiere).
3. Beschichtungskolben: Verwenden Sie T25- oder T75-Kolben zur Vorbeschichtung der isolierten Gehirnzellen. Vor der Dissektion des Gehirns sind T25-Kolben mit 2 ml (oder 4 mL für einen T75-Kolben) mit 0,1 mg/ml Poly-D-Lysin (PDL) zu beschichten und mindestens 1 h bei 37 °C zu inkubieren. Aspirieren Sie die PDL-Lösung, waschen Sie sie zweimal mit 1x PBS und lassen Sie den Kolben dann in der Zellkulturhaube an der Luft trocknen.
   HINWEIS: Die Größe und Anzahl der im Versuch verwendeten Kolben hing von der Anzahl der postnatalen Welpen ab. Damit die Zellen in kurzer Zeit die konfluente Astrozytenzellschicht erreichen können, bereiten Sie einen T25-Kolben für 3-5 Gehirne oder einen T75-Kolben für 5 Gehirne vor. Unbenutzte beschichtete Kolben können bis zu einem Monat bei 4 °C gelagert werden. Um Zeit zu sparen, kann vor Beginn des Experiments eine 10-fache (1 mg/ml) PDL-Stammlösung hergestellt und bei -20 °C als Einmal-Aliquots gelagert werden. Verdünnen Sie die Aliquote direkt vor Gebrauch in sterilem 1x PBS.
4. Deckgläser vorbereiten: Handelsübliche Glasdeckgläser 1 h lang mit 0,1 M HCl waschen, zweimal mit Autoklavenwasser spülen und dann in 100% Ethanol lagern. Brennen Sie die Deckgläser vor dem Gebrauch mit einer feinen Pinzette mit einer Brennerlampe, um Ethanolreste zu entfernen. 8-mm-Glasdeckgläser können in eine 48-Well-Platte eingelegt werden, und 12-mm-Glasdeckgläser können in eine 24-Well-Platte eingelegt werden.
5. Präparierwerkzeuge vorbereiten: Feine Scheren, Pinzetten und Mikrolöffel aus Edelstahl mindestens 20 Minuten in 75%igem Ethanol einweichen. Legen Sie diese Werkzeuge dann für 30 Minuten unter ultravioletter Strahlung in die Gewebekulturhaube.

2. Sezierung des Gehirns der Maus

HINWEIS: Um die Wirksamkeit des Protokolls zu bewerten, haben wir hier CX3CR1 GFP-Knock-in-Mäuse zur Rückverfolgung von Mikroglia 9 verwendet. CX3CR1^{GFP/GFP-Mäuse} und Wildtyp-C57BL/6J-Weibchen im Alter von 2 bis 8 Monaten wurden gekreuzt, um CX3CR1^+/GFP-Mäuse zu erzeugen, die beide ursprünglich aus kommerziellen Quellen gewonnen wurden. Die Mäuse wurden unter einem 12-12-stündigen Hell-Dunkel-Zyklus in einer spezifischen pathogenfreien (SPF) Umgebung an der Shanghai Jiao Tong University untergebracht. Welpen vom postnatalen Tag 1 bis zum Tag 4 können für dieses Protokoll verwendet werden.

1. Enthaupten Sie alle Welpen mit einer chirurgischen Schere. Um die Kontamination zu minimieren, spülen Sie alle Köpfe mit 75% Ethanol aus und geben Sie schnell das eiskalte 1x PBS hinein. In der Zwischenzeit den Aufschlusspuffer und das Co-Kulturmedium in einem 37 °C warmen Wasserbad erwärmen.
   HINWEIS: Enthaupten und isolieren Sie Hirngewebe von jeweils einem Welpen, um die strukturelle Integrität zu erhalten. Um eine Kontamination zu vermeiden, sollten alle chirurgischen Instrumente zwischen der Enthauptung in 75%iges Ethanol eingelegt werden.
2. Schneide den Schädel mit einer feinen Präparierschere zusammen mit der Medulla oblongata ab. Legen Sie einen Mikrolöffel aus Edelstahl von der Schnittstelle unter das Hirngewebe, um das Gehirn aus der Kopfhöhle herauszudrücken. Übertragen Sie es auf eine neue gekühlte 6-Well-Platte mit 2 ml vorkaltem 1x PBS pro Well.
3. Schneiden Sie das Kleinhirn und die Riechkolben ab und entsorgen Sie sie. Übertragen Sie das restliche Hirngewebe vorsichtig auf eine gekühlte 6-Well-Platte mit 2 ml vorkaltem 1x PBS.
   HINWEIS: Geben Sie 4-5 Gehirngewebe in eine Vertiefung.
4. Wiederholen Sie den gleichen Vorgang für die restlichen Köpfe, bis das gesamte Gewebe entnommen ist.

3. Aussaat der gemischten Primärzellen

1. Aspirieren Sie 1,5 mL 1x PBS in der 6-Well-Platte und zerkleinern Sie das Hirngewebe mit Hilfe einer Federschere vollständig in kleine Stücke (ca. 1 mm²).
   HINWEIS: Um die Menge an feinen Ablagerungen zu reduzieren, hacken Sie das Taschentuch nicht zu sehr.
2. Geben Sie die gewünschte Menge Aufschlusspuffer in die Vertiefung (0,5 ml Verdauungspuffer pro Gehirn) und legen Sie die Platte dann für 20 Minuten in den befeuchteten Inkubator mit 5 % CO_{2 2} und 37 °C. Den Teller alle 10 Min. schwenken.
   HINWEIS: Befeuchten Sie während der Inkubationszeit ein 70-μm-Zellsieb mit Kulturmedium (10 % FBS in DMEM) und legen Sie das Zellsieb dann auf ein frisches 50-ml-Entnahmeröhrchen.
3. Nehmen Sie die Platte aus dem Inkubator und beenden Sie die Papainverdauung, indem Sie 3 ml Nährmedium in jede Vertiefung geben. Pipettieren Sie die Zellen 10 Mal mit einer 1-ml-Pipette leicht auf und ab. Füllen Sie die Mischung in ein 15-ml-Röhrchen und lassen Sie sie 1 Minute lang ruhen. Am unteren Rand ist ein trübes Zellpellet zu sehen. Um große Klumpen und Zelltrümmer zu entfernen, passieren Sie die Zellsuspension vorsichtig durch ein 70-μm-Zellsieb und sammeln Sie den Durchfluss im 50-ml-Sammelröhrchen.
4. Geben Sie 3 ml erwärmtes Kulturmedium (10 % FBS in DMEM) zu dem undissoziierten Zellpellet im 15-ml-Röhrchen. Triturieren Sie 10 Mal wie in Schritt 3.3, um die Dissoziation fortzusetzen. Lassen Sie das Gewebe 1 Minute lang ruhen und geben Sie dann die Zellsuspension durch das Sieb in das 50-ml-Entnahmeröhrchen. Wiederholen Sie diesen Schritt, und entsorgen Sie die verbleibenden Zellreste.
5. Übertragen Sie die Zellsuspension aus dem 50-ml-Entnahmeröhrchen auf 15 ml-Röhrchen und zentrifugieren Sie die Zellen bei 200 x g für 10 min bei Raumtemperatur.
6. Aspirieren Sie den Überstand und resuspendieren Sie die Zellen in 5 ml Kulturmedium. Die Primärzellen werden in einen T25- oder T75-Kolben mit einer Zelldichte von etwa 5 x 10⁶ ausgesät und im befeuchteten Inkubator (5 % CO₂, 37 °C) kultiviert. Dies ist Tag 0 in diesem Kulturplan.
   HINWEIS: Werden Zellen in einen T25-Kolben ausgesät, so ist ein Endvolumen von 5 ml Medium pro Kolben ausreichend. Geben Sie zusätzliche 5 ml Nährmedium in jeden Kolben, wenn er in einen T75-Kolben eingesät wird.

4. Entnahme von primären Mikroglia

1. Bewerten Sie die Konfluenz der gemischten Zellen am nächsten Tag (Tag 1). Da die gemischten Zellen mit einer ziemlich hohen Dichte ausgesät wurden, dauert es 3-4 Tage, bis die Astrozyten konfluenzfähig sind, so dass die Mikroglia 1-2 Tage später entnommen werden können.
   HINWEIS: Seien Sie vorsichtig, wenn am nächsten Tag keine Zellen am Boden des Kolbens befestigt sind. Es kann auf Zellkontamination oder Zelltod zurückzuführen sein, die durch Überverdauung oder raue Handhabung verursacht werden.
2. Waschen Sie die Kolben an Tag 2 zweimal mit 3 mL warmem 1x PBS und wechseln Sie das Medium, indem Sie jedem T25-Kolben 3-5 mL frisches Nährmedium zusetzen (7-10 mL für einen T75-Kolben). Das verworfene Kulturmedium enthält Zelltrümmer und verschiedene Zelltypen, darunter Neuronen, Oligodendrozyten und Mikroglia.
3. Stellen Sie an Tag 4 sicher, dass die Astrozyten, die am Boden des Kolbens befestigt sind, eine Konfluenz von 100 % aufweisen. In der Zwischenzeit ist eine Subpopulation von Mikroglia lose an die gemischte Zelloberflächenschicht gebunden, die sich leicht von der Oberfläche lösen und durch Händeschütteln im Kulturmedium schwimmen kann. Übertragen Sie das Kulturmedium auf eine frische 6-Well-Platte, und während dieses Prozesses werden primäre Mikroglia, die mit dem Medium angereichert sind, gesammelt. Stellen Sie anschließend die Zellen auf der ursprünglichen 6-Well-Platte mit frischem Kulturmedium für die weitere Zellentnahme bereit.
   HINWEIS: Es ist angebracht, die Kolben auf den Tisch zu klopfen oder die Kolben auf einem Laborschüttler 30 Minuten lang bei 180 U/min zu schütteln, bevor das Medium umgefüllt wird, um mehr Zellen zu erhalten.
4. Platzieren Sie die 6-Well-Well-Maschine vorsichtig in den Inkubator, um die Zellanhaftung zu ermöglichen. Etwa 2 Stunden nach der Inkubation werden alle Zellen an der Platte befestigt. Wenn die Zellen anhaften, waschen Sie sie vorsichtig zweimal mit warmem 1x PBS, um Zellaggregate und Zelltrümmer zu entfernen. versorgen Sie die Zellen dann mit 3 ml frischem Mikroglia-Kulturmedium. Die isolierten Mikrogliazellen können in vitro länger als einen Monat aufbewahrt werden, indem das Mikroglia-Kulturmedium alle 2 Tage aufgefrischt wird.
   HINWEIS: Der Kolonie-stimulierende Faktor 1 (CSF1) ist ein wichtiger Wachstumsfaktor zur Unterstützung des Überlebens der Mikroglia in vitro. Frühere Studien berichten, dass CSF1 aus der LADMAC-Zelllinie sezerniert werden kann, bei der es sich um eine transformierte Zelllinie handelt, die aus Knochenmarkzellen der Maus stammt. Das LADMAC-konditionierte Medium kann durch Zentrifugieren der LADMAC-Kultur bei 200 x g für 10 min gesammelt werden. Anschließend wird der Überstand durch ein 0,22 μm Zellsieb geleitet. Das Mikroglia-Kulturmedium wurde durch Zugabe von 20 % LADMAC-konditioniertem Medium zum Kulturmedium (10 % FBS, DMEM) hergestellt.
5. Fahren Sie fort, alle 2-3 Tage die Mikroglia aus dem gemischten Zellkulturmedium zu entnehmen, wie in Schritt 4.4 beschrieben. Kulturieren Sie die verbleibenden gemischten Zellen im Kolben und verwenden Sie sie für die konsequente Entnahme von Mikroglia alle 2-3 Tage für bis zu 1 Monat.
   HINWEIS: Mikroglia können erfolgreich geerntet werden, indem das Medium aus Mischkulturzellen für bis zu 50 Tage gesammelt wird. Jedes Mal ergibt das gesammelte Co-Kulturmedium etwa ~1-3 x 10⁵ Mikrogliazellen pro T75-Kolben. Kombinieren Sie bei Bedarf Mikrogliazellen.
6. Verwenden Sie primäre Mikrogliazellen für den gewünschten funktionellen Assay.

Ergebnisse

Primäre Mikroglia, die an Tag 7 und Tag 35 nach der Zellaussaat aus CX3CR1^+/GFP entnommen wurden, wurden in Abbildung 1 gezeigt. Wie in der Immunfluoreszenzfärbung des Mikroglia-/Makrophagenzellmarkers IBA1 gezeigt, sind alle IBA1-positiven Zellen positiv für die GFP-Signale und negativ für S100β (Astrozytenmarker) und CC1 (Oligodendrozytenmarker), was darauf hindeutet, dass es sich bei den gereinigten GFP-positiven Zellen tatsächlich um Mik...

Diskussion

Dieses Protokoll basiert auf den zuvor beschriebenen Methoden mit einigen Modifikationen¹¹. Tipps zur Verbesserung der Lebensfähigkeit und Reinheit isolierter Mikroglia sind wie folgt aufgeführt. Achten Sie zunächst darauf, eine Kontamination bei der Vorbereitung von Puffern für die Gewebeisolierung und Zellkultur zu vermeiden. Stellen Sie sicher, dass die chirurgischen Werkzeuge, Behälter und Kunststoffgeräte steril sind. In der Regel führen wir die Hirndi...

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
Cell strainers, 40 µm	ThermoFisher Scientific	22-363-547
DNase I	Sigma	11284932001
Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM)	Gibco by Life Technologies	C11995500BT
Dulbecco's Phosphate Buffered Saline (DPBS)	Gibco by Life Technologies	14190-144
Fetal Bovine Serum (FBS)	Gibco by Life Technologies	10099141
Papain, Suspension	Sangon Biotech	Papain, Suspension
Penicillin-Streptomycin 100X solution	Hyclone	SV30010
Poly-D-Lysine	ThermoFisher Scientific	A3890401