בידוד מיקרוגליה ראשוני ממוחות של עכברים לאחר לידה

Summary

תרבית תאים ראשונית היא אחת הגישות המשמשות בעיקר לחקר ביולוגיה של מיקרוגליה במבחנה. כאן, פיתחנו שיטה לבידוד פשוט ומהיר של מיקרוגליה מהיום הראשון (P1) של העכבר לאחר הלידה ל-P4.

Abstract

מיקרוגליה הם הפגוציטים החד-גרעיניים במערכת העצבים המרכזית (CNS), הממלאים תפקידי מפתח בשמירה על הומאוסטזיס וויסות התהליך הדלקתי במערכת העצבים המרכזית. כדי לחקור את הביולוגיה של המיקרוגליה במבחנה, מיקרוגליה ראשונית מראה יתרונות גדולים בהשוואה לקווי תאי מיקרוגליה אימורטליים. עם זאת, בידוד מיקרוגליה ממוח העכבר לאחר הלידה הוא יחסית פחות יעיל וגוזל זמן. בפרוטוקול זה, אנו מספקים שיטה מהירה וקלה לביצוע לבידוד מיקרוגליה ראשונית ממוח העכבר היילוד. השלבים הכוללים של פרוטוקול זה כוללים דיסקציה של המוח, תרבית תאי מוח ראשונית ובידוד מיקרוגליה. באמצעות גישה זו, חוקרים יכולים להשיג מיקרוגליה ראשונית עם טוהר גבוה. בנוסף, תאי המיקרוגליה הראשוניים שנקטפו הצליחו להגיב לאתגר הליפופוליסכרידים, מה שמצביע על כך שהם שמרו על תפקודם החיסוני. באופן קולקטיבי, פיתחנו גישה פשוטה לבידוד יעיל של מיקרוגליה ראשונית עם טוהר גבוה, המאפשרת מגוון רחב של חקירות ביולוגיה של מיקרוגליה במבחנה.

Introduction

מיקרוגליה, תאי החיסון השוכנים במערכת העצבים המרכזית (CNS), ממלאים תפקידים מרכזיים בשמירה על הומאוסטזיס, המגיבים לאתגרים הנוירופתולוגיים¹. לאחרונה נערכו מחקרים אינטנסיביים כדי להבין את הפונקציות הפיזיולוגיות של מיקרוגליה, למשל, במחלת אלצהיימר². נכון לעכשיו, פרופיל השעתוק של מיקרוגליה ברזולוציה של תא בודד המתקבל במהלך התפתחות מערכת העצבים המרכזית, הזדקנות ומחלות מספק הבנה טובה יותר של תפקוד המיקרוגליה במוחות בריאים וחולים³. מחקרים קודמים זיהו תת-סוג מיקרוגליאלי הקשור למחלה במחלת אלצהיימר ומחלות ניווניות אחרות ^4,5,6. תת-אוכלוסייה זו קרובה לתצהיר β העמילואיד (Aβ). גנים הקשורים לפגוציטוזיס ומטבוליזם של שומנים (למשל, אפואה, טירוב) נמצאו מווסתים באוכלוסיות אלה ^6,7. עם זאת, התהליכים התת-תאיים, מסלולי האיתות החוץ-תאיים והתוך-תאיים המווסתים את שינויי הפרופיל המולקולרי הדינמי במיקרוגליה אינם מובנים במלואם. בפרט, המנגנון העומד בבסיס הפעלת מיקרוגליה כרונית במחלות ניווניות נותר חמקמק. לכן, חיוני להבין את המנגנונים התאיים המעורבים במיקרוגליה מכיוון שתגובות מיקרוגליה תורמות בבירור להתפתחות המוח ולהתקדמות ניוון עצבי.

למרות שיש כמה כלים in vivo ו-in vitro לחקר מיקרוגליה, עדיין יש כמה מגבלות. קשה מבחינה טכנית להשיג מספר גדול מספיק של תאי מיקרוגליה עם טוהר גבוה לביצוע ניסויים באופן שגרתי, כגון כתם מערבי, כדי להבהיר מסלולי איתות תוך-תאיים. תרבית מיקרוגליה ראשונית מספקת אמצעי חלופי לחקר הביולוגיה של מיקרוגליה. ניתן ליישם את המיקרוגליה הראשונית המתורבתת כדי לנתח את היכולת הפגוציטית של מיקרוגליה לאחר מניפולציה גנטית, ולהעריך ייצור ציטוקינים פרו-דלקתיים ואנטי דלקתיים בתגובה לגירויים דלקתיים, והיבטים ביולוגיים אחרים כדי להבין את תפקידיהם^במוח. כאן, אנו מציגים פרוטוקול חדש ומתארים הוראות שלב אחר שלב לבידוד ותרבית של מיקרוגליה ראשונית ממוח עכבר יילודים, עם דגש על הצעדים הקריטיים להשגת תאי מיקרוגליה ראשוניים בריאים וטהורים.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

כל ההליכים בבעלי חיים אושרו על ידי הוועדה לחקר בעלי חיים והפאנל המוסדי לטיפול בחיות מעבדה באוניברסיטת שנחאי ג'יאו טונג. נעשה כל מאמץ למזער את סבלם של בעלי החיים.

1. הכנת חיץ תרבית, צלוחיות וכיסויים

1. מדיום תרבית ומדיום תרבית מיקרוגליה: השלם DMEM עם 10% FBS כדי להפוך את מדיום התרבית. מדיום תרבית המיקרוגליה מיוצר על ידי הוספת 10% FBS ו-20% מדיום מותנה LADMAC ל-DMEM. הוסף 1% פניצילין/סטרפטומיצין לשני המדיום.
   1. להכנת מדיום מותנה של 20% LADMAC, אסוף את מדיום התרבות מתאי LADMAC, צנטריפוגה ב-200 x גרם למשך 10 דקות, סנן באמצעות מסננת תאים של 0.22 מיקרומטר ולאחר מכן אחסן את המינונים ב-80 מעלות צלזיוס.
2. מאגר עיכול: הכן מאגר עיכול על ידי הוספת 8 U/mL פפאין ו-125 U/mL DNase ל-DMEM.
   הערה: לקבלת התוצאות הטובות ביותר, יש להכין את מאגר העיכול טרי. חשב את הכמות הרצויה על סמך מספר הגורים (תמיסה של 1 מ"ל לכל 2 גורים).
3. צלוחיות ציפוי: השתמש בצלוחיות T25 או T75 לציפוי מראש של תאי המוח המבודדים. לפני דיסקציה של המוח, יש לצפות את צלוחיות T25 ב-2 מ"ל (או 4 מ"ל לבקבוק T75) של 0.1 מ"ג/מ"ל פולי-D-ליזין (PDL) ולדגור בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך שעה אחת לפחות. שאפו את תמיסת ה-PDL, שטפו פעמיים עם 1x PBS ולאחר מכן הניחו לבקבוק להתייבש באוויר במכסה המנוע.
   הערה: גודל ומספר הצלוחיות ששימשו בניסוי היו תלויים במספר הגורים לאחר הלידה. כדי לאפשר לתאים להגיע לשכבת תאי האסטרוציטים תוך זמן קצר, הכינו בקבוק T25 אחד ל-3-5 מוחות, או בקבוק T75 אחד ל-5 מוחות. ניתן לאחסן צלוחיות מצופות שאינן בשימוש בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס עד חודש. כדי לחסוך זמן, ניתן להכין תמיסת מלאי של 10x (1 מ"ג/מ"ל) של PDL לפני תחילת הניסוי ולאחסן בטמפרטורה של -20 מעלות צלזיוס כמנות חד פעמיות. יש לדלל את הכמויות ב-PBS סטרילי 1x ממש לפני השימוש.
4. הכן כיסויים: שטפו כיסויי זכוכית מסחריים עם 0.1 M HCl למשך שעה, שטפו פעמיים במי חיטוי ולאחר מכן אחסנו ב-100% אתנול. לפני השימוש, יש להדליק את הכיסויים באמצעות מלקחיים עדינים עם מבער lamp כדי להסיר שאריות אתנול. ניתן להניח כיסויי זכוכית 8 מ"מ בצלחת של 48 בארות, וניתן להניח כיסויי זכוכית 12 מ"מ בצלחת של 24 בארות.
5. הכן כלי חיתוך: משרים מספריים עדינים, מלקחיים ומיקרו כפות נירוסטה באתנול 75% למשך 20 דקות לפחות. לאחר מכן הנח את הכלים הללו תחת קרינה אולטרה סגולה במכסה המנוע של תרבית הרקמה למשך 30 דקות.

2. דיסקציה של מוח העכבר

הערה: כדי להעריך את יעילות הפרוטוקול, כאן השתמשנו בעכברי דפיקה CX3CR1^GFP למעקב אחר מיקרוגליה⁹. עכברי CX3CR1^GFP/GFP ונקבות C57BL/6J מסוג בר בגיל 2 עד 8 חודשים הוכלאו כדי ליצור עכברי CX3CR1^+/GFP , שניהם הושגו במקור ממקורות מסחריים. עכברים שוכנו במחזור אור-חושך של 12-12 שעות בסביבה ספציפית נטולת פתוגנים (SPF) באוניברסיטת שנחאי ג'יאו טונג. ניתן להשתמש בגורים מהיום הראשון עד היום הרביעי לאחר הלידה לפרוטוקול זה.

1. ערפו את ראשי כל הגורים במספריים כירורגיים. כדי למזער את הזיהום, שטפו את כל הראשים באתנול 75% והכניסו במהירות את ה-PBS 1x הקר כקרח. בינתיים, מחממים את מאגר העיכול ואת מדיום התרבות המשותפת באמבט מים של 37 מעלות צלזיוס.
   הערה: ערפו את ראשו ובודדו רקמת מוח מגור אחד בכל פעם כדי לשמור על שלמות מבנית. כדי למנוע זיהום, יש למקם את כל הכלים הכירורגיים ב-75% אתנול בין עריפת הראש.
2. השתמש במספריים מנתחים עדינים כדי לחתוך את הגולגולת יחד עם המדולה אובלונגטה. הניחו מיקרו-כף נירוסטה מתחת לרקמת המוח ממקום החיתוך כדי לסחוט את המוח מחלל הראש. מעבירים אותו לצלחת חדשה עם 6 בארות המצוננת המכילה 2 מ"ל של 1x PBS קר מראש לבאר.
3. חותכים וזורקים את נורות המוח הקטן והריח. העבירו בעדינות את רקמת המוח הנותרת לצלחת צוננת של 6 בארות המכילה 2 מ"ל של PBS 1x קר מראש.
   הערה: יש להניח 4-5 רקמות מוח בבאר אחת.
4. חזור על אותו הליך עבור הראשים הנותרים עד לאיסוף כל הרקמות.

3. זרע את התאים הראשוניים המעורבים

1. שאפו 1.5 מ"ל של 1x PBS בצלחת 6 הבארות, וטחנו את רקמת המוח במלואה לחתיכות קטנות (כ -1 מ"מ²) בעזרת מספריים קפיציים.
   הערה: כדי להפחית את כמות הפסולת העדינה, אין לטחון את הרקמה יתר על המידה.
2. הוסף את הכמות הרצויה של מאגר העיכול לבאר (0.5 מ"ל של מאגר עיכול למוח), ולאחר מכן הנח את הצלחת בחממה לחה של 5% CO₂, 37 °C למשך 20 דקות. מערבבים את הצלחת כל 10 דקות.
   הערה: במהלך זמן הדגירה, הרטיבו מסננת תאים של 70 מיקרומטר עם מדיום תרבית (10% FBS ב-DMEM), ולאחר מכן הניחו את מסננת התאים על צינור איסוף טרי של 50 מ"ל.
3. הוציאו את הצלחת מהחממה וסיימו את עיכול הפפאין על ידי הוספת 3 מ"ל מדיום תרבית לכל באר. פיפטה עדינה את התאים למעלה ולמטה 10 פעמים באמצעות פיפטה של 1 מ"ל. מעבירים את התערובת לצינור של 15 מ"ל, ונותנים לה להתייצב למשך דקה. ניתן לראות כדור תא עכור בתחתית. כדי להסיר גושים גדולים ופסולת תאים, העבירו בזהירות את תרחיף התא דרך מסננת תאים של 70 מיקרומטר ואספו את הזרימה בצינור האיסוף של 50 מ"ל.
4. הוסף 3 מ"ל של מדיום תרבית מחומם (10% FBS ב-DMEM) לכדור התא הלא מנותק בצינור של 15 מ"ל. יש לשלש פי 10 כמו בשלבים 3.3 כדי להמשיך את הדיסוציאציה. הניחו לרקמה להתייצב למשך דקה אחת ולאחר מכן העבירו את תרחיף התאים דרך המסננת לצינור האיסוף של 50 מ"ל. חזור על שלב זה והשליך את שאריות פסולת התא.
5. העבירו את תרחיף התאים מצינור האיסוף של 50 מ"ל לצינורות של 15 מ"ל וצנטריפוגה של התאים ב-200 x גרם למשך 10 דקות בטמפרטורת החדר.
6. שאפו את הסופרנטנט, והשעו מחדש את התאים ב-5 מ"ל של מדיום תרבית. זרע את התאים הראשוניים בבקבוק T25 או T75 בצפיפות תאים של כ -5 x 10⁶ ותרבית בחממה הלחה (5% CO₂, 37 °C). זהו היום ה-0 בלוח הזמנים התרבותי הזה.
   הערה: אם תאים נזרעים בבקבוק T25, מספיק נפח סופי של 5 מ"ל בינוני לכל בקבוק. הוסף 5 מ"ל נוספים של מדיום תרבית לכל בקבוק כאשר הוא נזרע בבקבוק T75.

4. אוסף מיקרוגליה ראשונית

1. הערך את המפגש של התאים המעורבים למחרת (יום 1). מאחר שהתאים המעורבים נזרעו בצפיפות גבוהה למדי, לוקח לאסטרוציטים 3-4 ימים להגיע למפגש, מה שמאפשר לאסוף את המיקרוגליה 1-2 ימים לאחר מכן.
   הערה: היזהר אם תאים אינם מחוברים לתחתית הבקבוק למחרת; זה יכול להיות בגלל זיהום תאים או מוות תאים הנגרם על ידי עיכול יתר או טיפול קשה.
2. ביום השני, שטפו את הצלוחיות עם 3 מ"ל PBS חם 1x פעמיים והחליפו את המדיום על ידי הוספת 3-5 מ"ל של מדיום תרבית טרי לכל בקבוק T25 (7-10 מ"ל לבקבוק T75). מדיום התרבות המושלך מכיל פסולת תאים וסוגים שונים של תאים, כולל נוירונים, אוליגודנדרוציטים ומיקרוגליה.
3. ביום הרביעי, ודאו שהאסטרוציטים המחוברים לתחתית הבקבוק נמצאים במפגש של 100%. בינתיים, תת-אוכלוסייה של מיקרוגליה מחוברת באופן רופף לשכבת פני השטח של התא המעורב שיכולה להתנתק בקלות מפני השטח ולצוף במדיום התרבית על ידי לחיצת יד. העבירו את מדיום התרבות לצלחת טרייה של 6 בארות, ומיקרוגליה ראשונית מועשרת במדיום נאספת במהלך תהליך זה. לאחר מכן, ספק לתאים בצלחת המקורית של 6 בארות מדיום תרבית טרי להמשך איסוף תאים.
   הערה: הקשה על הצלוחיות על השולחן או ניעור הצלוחיות על שייקר מעבדה ב-180 סל"ד למשך 30 דקות לפני העברה בינונית מתאימה כדי להניב יותר תאים.
4. הנח בזהירות את 6 הבארות לחממה כדי לאפשר חיבור תאים. כשעתיים לאחר הדגירה, כל התאים יחוברו לצלחת. כאשר התאים מחוברים, שטפו אותם בעדינות עם PBS חם 1x פעמיים כדי להסיר אגרגטים של תאים ופסולת תאים; לאחר מכן, ספק לתאים 3 מ"ל של מדיום תרבית מיקרוגליה טרי. ניתן לשמור על תאי המיקרוגליה המבודדים במשך יותר מחודש במבחנה על ידי רענון מדיום תרבית המיקרוגליה כל יומיים.
   הערה: גורם מגרה מושבה 1 (CSF1) הוא גורם גדילה חשוב לתמיכה בהישרדות מיקרוגליה במבחנה. מחקרים קודמים מדווחים כי ניתן להפריש CSF1 מקו התאים LADMAC, שהוא קו תאים שעבר טרנספורמציה שמקורו בתאי מח עצם של עכבר. ניתן לאסוף את המדיום המותנה LADMAC על ידי צנטריפוגה של תרבית LADMAC ב-200 x גרם למשך 10 דקות; לאחר מכן, העבירו את הסופרנטנט דרך מסננת תאים של 0.22 מיקרומטר. מדיום תרבית מיקרוגליה הוכן על ידי הוספת 20% מדיום מותנה LADMAC למדיום התרבית (10% FBS, DMEM).
5. כל 2-3 ימים, המשיכו לאסוף את המיקרוגליה ממדיום תרבית התאים המעורב כמו בשלב 4.4. תרבית את התאים המעורבים הנותרים בבקבוק והשתמש בהם לקצירת מיקרוגליה באופן עקבי כל 2-3 ימים למשך עד חודש.
   הערה: ניתן לקצור בהצלחה מיקרוגליה על ידי איסוף תאי תרבית מעורבים בצורת המדיום למשך עד 50 יום. בכל פעם, מדיום התרבית המשותפת שנאסף יניב כ~1-3 x 10⁵ תאי מיקרוגליה לכל בקבוק T75. שלב תאי מיקרוגליה, במידת הצורך.
6. השתמש בתאי מיקרוגליה ראשוניים לבדיקה התפקודית הרצויה.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

תוצאות

מיקרוגליה ראשונית שנאספה מ-CX3CR1^+/GFP ביום 7 וביום 35 לאחר זריעת התאים הודגמה באיור 1. כפי שמוצג בצביעה האימונופלואורסצנטית של סמן תאי מיקרוגליה/מקרופאגים IBA1, כל התאים החיוביים ל-IBA1 חיוביים לאותות ה-GFP, ושליליים ל-S100β (סמן אסטרוציטים) ו-CC1 (סמן אוליגודנדרוצ...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

פרוטוקול זה מבוסס על השיטות שתוארו קודם לכן עם כמה שינויים¹¹. טיפים לשיפור הכדאיות והטוהר של מיקרוגליה מבודדת מפורטים כדלקמן. ראשית, הקפד להימנע מזיהום בעת הכנת מאגרים המשמשים לבידוד רקמות ולתרבית תאים. ודא שכלי הניתוח, המיכלים והציוד הפלסטי סטריליים. בדרך כ...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Cell strainers, 40 µm	ThermoFisher Scientific	22-363-547
DNase I	Sigma	11284932001
Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM)	Gibco by Life Technologies	C11995500BT
Dulbecco's Phosphate Buffered Saline (DPBS)	Gibco by Life Technologies	14190-144
Fetal Bovine Serum (FBS)	Gibco by Life Technologies	10099141
Papain, Suspension	Sangon Biotech	Papain, Suspension
Penicillin-Streptomycin 100X solution	Hyclone	SV30010
Poly-D-Lysine	ThermoFisher Scientific	A3890401