JoVE Logo
Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • النتائج
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

تقدم هذه الدراسة بروتوكولات لنهجين شبه آليين لتحليل النشاط الحركي في C. elegans complex I disease gas-1(fc21) worms ، وهما ZebraLab (وهو مقايسة متوسطة الإنتاجية) وWormScan (وهو مقايسة عالية الإنتاجية) وتوفر تحليلا مقارنا بين مجموعة واسعة من طرق البحث لتحديد سلوك النيماتودا والوظيفة العصبية العضلية المتكاملة.

Abstract

ومن المسلم به على نطاق واسع Caenorhabditis elegans لمرفقه المركزي كنموذج حيواني ترجمي لاستجواب بكفاءة آليات وعلاجات الأمراض البشرية المتنوعة. الديدان هي مناسبة بشكل خاص للشاشات الوراثية والأدوية عالية الإنتاجية للحصول على نظرة أعمق في الأهداف والعلاجات العلاجية من خلال استغلال دورة التنمية السريعة ، وحجم الحضنة الكبيرة ، والعمر القصير ، والشفافية المجهرية ، وانخفاض تكاليف الصيانة ، ومجموعة قوية من الأدوات الجينية ، والمستودعات المتحولة ، والمنهجيات التجريبية لاستجواب كل من فيزيولوجيا الجسم الحي والفيفو السابق. يمثل النشاط الحركي للديدان النمط الظاهري ذي الصلة بشكل خاص والذي غالبا ما يضعف في مرض الميتوكوندريا ، وهو غير متجانس للغاية في الأسباب والمظاهر ولكنه يشترك بشكل جماعي في قدرة ضعيفة على إنتاج الطاقة الخلوية. في حين يمكن استخدام مجموعة من المنهجيات المختلفة لاستجواب سلوك الدودة ، فإن هذه تختلف اختلافا كبيرا في التكاليف التجريبية والتعقيد والفائدة للشاشات الجينومية أو الدوائية عالية الإنتاجية. هنا، تمت مقارنة الإنتاجية النسبية، والمزايا، والقيود المفروضة على 16 منهجية مختلفة لتحليل النشاط التي تحدد حركة النيماتودا، والضرب، والضخ البلعومي، و / أو chemotaxis في الديدان المفردة أو مجموعات الديدان من C. elegans في مراحل مختلفة، والأعمار، والمدد التجريبية. وقد تم عرض بروتوكولات مفصلة لطرق شبه آلية لقياس النشاط الحركي النيماتودا التي تمثل تطبيقات جديدة لأدوات البرمجيات المتاحة، وهما ZebraLab (نهج متوسط الإنتاجية) وWormScan (نهج عالي الإنتاجية). أظهرت البيانات من تطبيق هذه الطرق درجات مماثلة من انخفاض النشاط الحيواني وقعت في مرحلة L4 اليرقات، وتقدم في اليوم 1 البالغين، في الميتوكوندريا المعقدة I المرض (الغاز-1(fc21)) الديدان المتحولة بالنسبة إلى البرية من نوع (N2 بريستول) C. elegans. هذه البيانات تؤكد فائدة لهذه التطبيقات الجديدة من استخدام ZebraLab أو WormScan أدوات البرمجيات لقياس النشاط الحركي دودة بكفاءة وموضوعية، مع قدرة متغيرة لدعم فحص المخدرات عالية الإنتاجية على سلوك دودة في نماذج الحيوانات قبل السريرية من مرض الميتوكوندريا.

Introduction

ومن المسلم به على نطاق واسع Caenorhabiditis elegans كنموذج بارز في علم الأعصاب على أساس وجود 302 الخلايا العصبية التي تنسق جميع السلوكيات دودة, بما في ذلك التزاوج, تغذية, وضع البيض, التغوط, السباحة, والحركة على وسائل الإعلام الصلبة1. وتستخدم هذه الديدان الخيطية hermaphroditic أيضا على نطاق واسع لفهم مجموعة واسعة من آليات الأمراض البشرية، التي جعلت من الممكن من قبل الجينوم لها تتميز جيدا والهوولوجيا عالية من الجينات ~ 80٪ بين C. elegans والبشر2،3،4. وقد استخدمت منذ فترة طويلة C. elegans لاستجواب مرض الميتوكوندريا البشري5,6,7,8,9,10, وهو مجموعة غير متجانسة وراثيا للغاية و phenotypically من الاضطرابات الأيضية الموروثة التي تشترك في ضعف القدرة على توليد الطاقة الخلوية وغالبا ما تكون موجودة سريريا مع ضعف كبير في الوظائف العصبية والعضلية, ممارسة التعصب, والتعب11 ،12،13،14. وتحقيقا لهذه الغاية، فإن استخدام نماذج C. elegans يمكن النمذجة قبل السريرية للجوانب الكمية للنشاط الحيواني والوظيفة العصبية العضلية في أنواع فرعية وراثية مختلفة من مرض الميتوكوندريا، فضلا عن استجابتها للعلاجات المرشحة التي قد تحسن وظيفتها العصبية والعضلية والنشاط العام.

النشاط العصبي العضلي في C. elegans قابل للقياس موضوعيا من خلال مجموعة من المنهجيات التجريبية ، بما في ذلك النهج اليدوية وشبه الآلية التي تسمح بإجراء تحليلات وظيفية في الوسائط الصلبة أو السائلة (الجدول 1)1،15. وقد ثبت كمية دقيقة من النشاط C. elegans المهم لتمكين الاكتشافات المتعلقة وظيفة وتطوير الجهاز العضلي والعصبي16،17،18. تلخص هذه الدراسة وتقارن المتطلبات التجريبية والمزايا والقيود المفروضة على 17 مقايسة مختلفة يمكن إجراؤها في مختبرات الأبحاث لتقييم الوظيفة والنشاط العصبي العضلي على أربع نتائج رئيسية في نماذج أمراض C. elegans ، سواء عند خط الأساس في مجموعة من مراحل النمو والأعمار وكذلك استجابة للعلاجات المرشحة (الجدول 1 ). في الواقع ، تقدم الدراسة لمحة عامة مفصلة عن مجموعة من النهج التجريبية المتاحة لتوصيف معدلات سحق C. elegans (الانحناءات الجسم في الدقيقة الواحدة) ، والنشاط الحركي ، والضخ البلعومي ، وchemtaxis في كل حالة تحديد المنهجية التجريبية والتحليلية المستخدمة ، ومزايا وقيود كل طريقة ، والمعدات والبرمجيات اللازمة لأداء وتحليل كل المقايسة ، وقدرة الإنتاجية لكل طريقة لدعم استخدامها لأغراض فحص وراثية أو أدوية عالية الإنتاجية. توصف قدرة الإنتاجية لكل مقايسة بأنها منخفضة أو متوسطة أو عالية استنادا إلى تعقيد البروتوكول التجريبي ، بما في ذلك صيانة الدودة ، ووقت المعالجة ، واستخدام لوحات أحادية أو متعددة الآبار ، و / أو وقت المجرب اللازم لإكمال الإعداد التجريبي وتحليل البيانات.

التحليلات اليدوية لسحق19، النشاط الحركي20، ضخ البلعوم17،21، وchemocis22،23 هي منهجيات راسخة لتقييم نشاط الدودة التي تتطلب منظار مجسم24. في حين أن قياس نشاط سحق الديدان يتطلب تحليلا في الوسائط السائلة لتحديد وتيرة الانحناءات الجسم في الدقيقة الواحدة، يمكن قياس النشاط الحركي دودة إما على وسائل الإعلام الصلبة أو في وسائل الإعلام السائلة. ومع ذلك، فإن التحليلات اليدوية لنشاط الدودة الفردية تستغرق بطبيعتها وقتا طويلا وتنطوي على تحيز لا يمكن تجنبه من قبل المستخدم. أتمتة تحليلات نشاط الفيروس المتنقل يقلل من التحيز الذي يولده المستخدم ويمكن أن يزيد بشكل كبير من الإنتاجية التجريبية25. يمكن تحليل تسجيلات الفيديو لنشاط سحق دودة في وسائل الإعلام السائلة باستخدام wrMTrck ، وهو البرنامج المساعد ImageJ26. ومع ذلك ، فإن الإعدادات التجريبية الأصلية التي تم تطويرها لwrMTrck حدت من فائدتها ، لأن الكثير من الديدان في قطرة سائلة واحدة أدت إلى تداخل الديدان التي جعلت التتبع الدقيق صعبا. في حين تم حل هذا القيد التجريبي27، فإن طريقة wrMTrck غير قادرة على دعم الفحص عالي الإنتاجية.

توجد مجموعة من الطرق لقياس النشاط الحركي للديدان عند خط الأساس واستجابة للعلاجات المرشحة في نماذج مرض الميتوكوندريا C. elegans. وتشمل هذه ZebraLab (ViewPoint علوم الحياة), تيربسي تعقب28, واسعة مجال الرؤية منصة تتبع النيماتودا (WF-NTP)29, WormMotel, WormWatcher30, WormLab31, إنفينيتي تشيب32, وWMicrotracker واحد33 (الجدول 1). وتتيح هذه الأساليب التحليل المتزامن للحركة في سلالات أو حالات دودة متعددة، عادة على لوحات متعددة الآبار، مما يدعم تطبيقات فحص الأدوية ذات الإنتاجية العالية. وبعض هذه الأساليب لها اعتبارات فريدة قد تحد من فائدتها العامة أو تعززها، مثل الحاجة إلى معدات باهظة الثمن مقابل برمجيات الوصول المفتوح، وسهولة متفاوتة في تنفيذ البروتوكولات التجريبية. وعموما، لا يوجد نظام تجريبي واحد أو بروتوكول مناسب بشكل مثالي لجميع تجارب النشاط الحركي C. elegans. بل من المهم أن تختار بعناية الطريقة الأنسب للأهداف والمتطلبات التجريبية للمحقق المحدد.

يمثل ضخ البلعوم نتيجة هامة أخرى لتقييم النشاط العصبي العضلي في C. elegans. يتكون البلعوم C. elegans من 20 خلايا العضلات, 20 الخلايا العصبية, و 20 الخلايا الأخرى التي تمكن ابتلاع الإشريكية القولونية (E. coli) في الطرف الأمامي من الجهاز الهضمي للدودة34,35,36. وقد تم إنشاء عدة طرق يدوية لتحديد معدلات ضخ البلعوم17،21،37،38. وتستند معظم الأساليب على استخدام مجسم وكاميرا لتصور وتسجيل تردد ضخ البلعوم مع العد المباشر من قبل المراقب التجريبي21. تحليل معدل الضخ البلعومي الآلي ممكن من خلال إجراء تسجيل خارج الخلية يطلق عليه مخطط كهربية (EPG) ، والذي يوفر معلومات إضافية عن مدة كل مضخة39. تحليل معدل الضخ البلعومي ممكن أيضا في نظام microfluidic ، WormSpa ، حيث يتم احتجاز الديدان الفردية في الغرف40،41. وهناك طريقة تجارية متاحة لتسهيل تحليل معدل مضخة البلعوم هو نظام ScreenChip (InVivo Biosystems) ، الذي يقيس ويتصور ويحلل الجوانب العصبية والعضلية لسلوك التغذية في دودة واحدة معطلة في رقاقة مخصصة. ويمكن استخدام هذا النهج الكمية ضخ البلعوم لتقييم كل من الاستجابات العصبية والفسيولوجية للأدوية, الشيخوخة, وغيرها من العوامل42,43,44,45.

يصف Chemotaxis حركة C. elegans استجابة لرائحة وضعت بعيدا عن الديدان في منطقة محددة من وسائل الإعلام نمو النيماتودا (NGM) لوحة. تقييم الاستجابة chemotaxis يوفر مقياسا متكاملا للنشاط العصبي العصبي العصبي العصبي العضلي الدودة التي يمكن قياسها من خلال مراقبة وقياس المسافة المادية التي قطعتها الديدان نحو الرائحة في فترة زمنية محددة46. تعقب الديدان المتعددة هو طريقة تلقائية يمكن استخدامها لتحسين الكفاءة التجريبية لتحديد المسافة التي قطعتها الديدان نحو الجذاب أو منطارد 47.

هنا، يتم وصف البروتوكول التفصيلي ل طريقتين جديدتين شبه آليتين تم إنشاؤهما لقياس نشاط الدودة كميا. النهج الأول يستخدم ZebraLab البرمجيات التجارية التي وضعت أصلا لدراسة نشاط السباحة من دانيو rerio (حمار وحشي), لتطبيق رواية متوسطة الإنتاجية لتحديد النشاط الحركي العام في وسائل الإعلام السائلة من C. elegans على أساس التغيرات بكسل أثناء الحركة (الجدول 1, الشكل 1). يتم الحصول على إخراج البيانات بسرعة من عدد كبير من الشروط والعينات المتزامنة التي تم تحليلها على شريحة زجاجية ، على الرغم من أن هذه الطريقة ليست مناسبة لتنسيق لوحة متعددة الآبار. النهج الثاني هو التكيف رواية منهجية WormScan48،49 ( الشكل2) ، والذي يستخدم ماسح ضوئي مسطح لخلق صورة تفاضلية من اثنين من عمليات المسح المتتالية التي يمكن استخدامها بشكل متنوع مع البرمجيات مفتوحة المصدر لتمكين التحليل الكمي شبه الآلي للنتائج الفسيولوجية المتكاملة مثل البراز والبقاء على قيد الحياة. هنا ، تم تطوير تكييف جديد عالي الإنتاجية لمنهجية WormScan لتحديد النشاط الحركي للديدان في الوسائط السائلة في مجموعات من خمسة عشر دودة من المرحلة الرابعة (L4) من اليرقات لكل بئر من لوحة مسطحة القاع ذات 96 بئرا. يمكن تكييف هذه المنهجية WormScan شبه الآلية والمنخفضة التكلفة بسهولة مع شاشات الأدوية عالية الإنتاجية ، وكذلك لتحليل المراحل الحيوانية المختلفةوالأعمار 48،49.

هنا، بروتوكول وفعالية تحليل النشاط الحركي C. elegans باستخدام كل من ZebraLab وWormScan أساليب شبه الآلي هو موضح في نموذج C. elegans راسخة لمرض الميتوكوندريا المعقدة I، الغاز-1(fc21). gas-1 (K09A9.5 جين) هو تقويم العظام من NDUFS2 الإنسان (NADH: ubiquinone oxidoreductase الأساسية (بروتين الحديد والكبريت) وحدة فرعية 2) (الشكل 3). C. elegans gas-1(fc21) سلالة متحولة يحمل طفرة missense p.R290K homozygous في تقويم العظام البشري من NDUFS250, مما تسبب في انخفاض كبير في البراز والعمر, ضعف الفوسفور التأكسدي سلسلة الجهاز التنفسي (OXPHOS) قدرة51, فضلا عن انخفاض كتلة الميتوكوندريا وإمكانات الغشاء معزيادةالإجهاد التأكسدي 5,8 . على الرغم من استخدامه الراسخ على مدى العقدين الماضيين لدراسة مرض الميتوكوندريا ، لم يتم الإبلاغ عن النشاط الحركي للغاز -1(fc21)المسوخ من قبل. هنا، تم تطبيق ZebraLab وWormScan أساليب لتحديد النشاط الحركي بشكل مستقل من الغاز-1(fc21)بالمقارنة مع البرية نوع (WT، N2 بريستول) الديدان، سواء كوسيلة للتحقق من صحة الأساليب وكذلك لإثبات فائدتها المقارنة وكفاءة البروتوكولات التجريبية وتحليلات المعلوماتية. سمح برنامج ZebraLab بكمية سريعة للعديد من الحالات المتزامنة للنشاط الحركي للديدان في نماذج مرض الميتوكوندريا C. elegans ، مع إمكانية التطبيق لفحص الأدوية المستهدفة أو دراسات التحقق من الصحة. تحليل WormScan ، على وجه الخصوص ، مناسب تماما لتمكين شاشات الأدوية عالية الإنتاجية للمكتبات المركبة وتحديد أولويات الخيوط التي تحسن وظيفة الأعصاب العضلية الحيوانية والنشاط الحركي في نماذج C. elegans قبل السريرية لمرض الميتوكوندريا الأولي.

Protocol

1. دودة تحليل النشاط الحركي في وسائل الإعلام السائلة على الشرائح الزجاجية باستخدام برنامج ZebraLab

  1. نمو النيماتودا والتعامل معها
    1. تنمو C. elegans على لوحات بيتري التي تحتوي على وسائل الإعلام نمو النيماتودا (NGM) وانتشرت مع Escherichia القولونية OP50 كمصدر للغذاء. الحفاظ على ثقافة الدودة عند 20 درجة مئوية، كما هو موضح سابقا8.
    2. مزامنة الديدان أداء بيضة توقيت وضع52 ودراسة الديدان في المرحلة المطلوبة. في هذا البروتوكول، تم تحليل الديدان المرحلة L4.
    3. زيادة السيطرة وسلالات دودة متحولة على لوحات NGM مع وبدون علاجات المخدرات ليتم اختبارها أو السيطرة العازلة. لتقييم آثار العلاج من المخدرات، وإعداد تركيز مخزون المخدرات المطلوب في محلول القاعدية S. نشر حجم معين محسوب على لوحات NGM والسماح لها لتجف. نقل الديدان في مرحلة محددة من اليرقات أو الكبار والحفاظ على لوحة العلاج من المخدرات لمدة المطلوب قبل التحليل.
  2. الإعداد التجريبي للديدان لتسجيل فيديو النشاط الحركي وتحليل ZebraLab
    1. اختر 5 ديدان L4 متزامنة لكل سلالة وحالة باستخدام معول دودة. ماصة قطرة واحدة 20 ميكرولتر من S. الحل القاعدي على شريحة زجاجية تقع تحت مجسم متصل بكاميرا ونقل 5 الديدان في ذلك (الشكل 1A, B). نقل الديدان 5 من طبق بيتري التي تحتوي على NGM وE. coli OP50 إلى انخفاض السائل فقط في اللحظة التي تسبق التسجيل.
      ملاحظة: استمر في الحفاظ على الديدان الأخرى على طبق بيتري حتى يتم تسجيل الفيديو السابق. وهذا سوف تجنب الضرر الناجم عن الديدان الأخرى بسبب جفاف قطرات 20 ميكرولتر أثناء الإجراء (وقت الجفاف ~ 15-20 دقيقة).
    2. ماصة قطرات متعددة على شريحة واحدة للحصول على تكرارات تقنية متعددة (الشكل 1A). حدد الديدان من لوحات NGM مختلفة (تكرار البيولوجية). لا تستخدم قسيمة الغطاء.
    3. ضبط مسافة عمل المجهر لتصور المنطقة الكاملة من قطرة واحدة. تعيين والحفاظ على دقة الفيديو منخفضة (<1024 × 768) لتحميل الملفات في البرنامج.
    4. السماح للديدان بالتأقلم على الشريحة في درجة حرارة الغرفة لمدة دقيقة واحدة قبل التسجيل.
    5. سجل نشاط السباحة الدودة في 1 قطرة لمدة 1 دقيقة في 15 لقطة في الثانية (FPS). كرر التصوير لكل قطرة إضافية على اللوحة.
  3. C. elegans تحليل تسجيل النشاط الحركي في برنامج ZebraLab
    1. استخدم خيار ZEBRALAB AVI لتحميل مقاطع الفيديو إلى البرنامج. انقر على الخيار التكميم مع ملفات AVI (الشكل 1C).
    2. لإنشاء بروتوكول جديد، حدد ملف > إنشاء بروتوكول،ثم أضف عدد المناطق المحددة للتحليل. اختر عدد المواقع: 1.
    3. افتح معلمات البروتوكول وحدد دقيقة واحدة في إطار مدة التجربة. حدد مدة تجريبية مختلفة لفترات تجريبية مختلفة. حدد أو قم بإلغاء تحديد الإطار بلا سلة زمنية واختر فترة التكامل،اعتمادا على إخراج البيانات المطلوب. في هذه الدراسة لم يتم اختيار بن الوقت (الشكل 1D).
      ملاحظة: سلة الوقت هو الوقت الذي سيتم متوسط النشاط.
    4. إذا تم إنشاء بروتوكول بالفعل، حدد فتح البروتوكول وحدد البروتوكول المحفوظ (بتنسيق .vte).
    5. حدد ملفا وافتح فيلما لتحميل كل ملف فيديو فردي تم تسجيله مسبقا.
    6. حدد رمز المنطقة المشار إليه في الشكل 1E (السهم الأسود) لبناء منطقة واحدة للكشف وإنشاء منطقة حول قطرة السائل بأكملها حيث توجد الديدان. انقر على حدد، ثم رمز الدائرة الخضراء (السهم الرمادي) تحت المناطق > بناء علامات مسح >.
      ملاحظة: سيتم الكشف عن نشاط كافة worms في إسقاط المعرفة في المنطقة المحددة (الشكل 1E, F).
    7. انتقل إلى المعايرة > Draw scale(الشكل 1E)وارسم خطا أفقيا من اليسار إلى يمين منطقة الفيديو. الإشارة إلى المسافة الحقيقية للمعايرة. ثم حدد تطبيق على المجموعة.
    8. إلغاء تحديد الرمز المحدد لإنشاء المنطقة (السهم في الشكل 1E)وتحديد أو إلغاء تحديد شفاف.
      ملاحظة: في هذه الدراسة، تم اختيار شفافة وأعطى نتائج أفضل.
    9. ضبط حساسية الكشف و عتبة النشاط للسماح للكشف عن جميع سلالات دودة C. elegans المختلفة التي تم تحليلها.
      ملاحظة: في هذه التجربة، تم تعيين حساسية الكشف في 8 مع قيم الاندفاع والتجميد من 15 و 2، على التوالي(الشكل 1F).
    10. تعيين مقياس العرض في 70 لتصور المسار الذي أدلى به الحيوان في حين يجري تحليل النشاط. ثم حدد تطبيق على المجموعة ( الشكل1F).
    11. انقر على التجربة > تنفيذ > حفظ ك، ثم على ابدأ. يتم فتح نافذة. اختر هل تريد معالجة وسائط الفيديو بأقصى سرعة كمبيوتر؟ لتحليل الفيديو بسرعة (على سبيل المثال، يتم تحليل تسجيل فيديو لمدة دقيقة واحدة من قبل برنامج ZebraLab في 5 s).
    12. نافذة أخرى يفتح: تشغيل التجربة; انقر على ابدأ للشروع في التجربة.
    13. بعد اكتمال تسجيل الفيديو، يتوقف التحليل. انقر على التجربة > إيقاف. وهذا يحفظ النشاط الذي تم تحليله من قطرة واحدة في جدول بيانات.
    14. كرر التحليل لكل فيديو من قطرة الفردية. كل قطرة هي نسخة تقنية متماثلة واحدة.
  4. إخراج وتحليل بيانات ZebraLab
    ملاحظة: بعد التجربة، يتم حفظ البيانات من كل فيديو بشكل فردي كجداول بيانات منفصلة في المجلد المختار. في ملف إخراج البيانات، يتم تسجيل مستوى النشاط المتكامل لكافة الديدان المتحركة في قطرة فردية كتغييرات بكسل تحت actinteg.
    1. افتح كل جدول بيانات تم الحصول عليه من تحليل كل فيديو. ترجمة لهم يدويا في ملف واحد.
      تطبيع البيانات متحولة والبرية من نوع إلى نسبة مئوية من السيطرة. وفي هذا الأثناء، أجريت تحليلات إحصائية لمقارنة متوسط مستويات النشاط بين المجموعات.

2. دودة تحليل النشاط الحركي في وسائل الإعلام السائلة في شكل لوحة 96 جيدا من قبل تحليل البرمجيات WormScan

  1. نمو النيماتودا والتعامل معها
    1. تنمو C. elegans كما هو موضح في القسم 1.1.1.
    2. مزامنة الديدان كما هو موضح في المقطع 1.1.2.
    3. تنمو الديدان على وسائل الإعلام محددة كما هو موضح في القسم 1.1.3 حتى المرحلة L4 أو اليوم 1 الكبار.
  2. الإعداد التجريبي للديدان في لوحة 96 جيدا لتحليل نشاط WormScan
    1. إضافة 50 ميكرولتر من وزن 2٪ لكل حجم من E. coli OP50 في تعليق السائل في المتوسط القاعدي S. إلى كل بئر من 96 جيدا، واضحة، مسطحة القاع، microplate، كما هو موضح سابقا49،53.
    2. تحت منظار مجسم، اختر يدويا 15 دودة متزامنة في مرحلة L4 أو اليوم الأول للبالغين من لوحات NGM الخاصة بهم إلى وسائط سائلة داخل كل بئر تجريبي من اللوحة الدقيقة ذات ال 96 بئرا. السماح للديدان بالتأقلم مع الوسائط السائلة لمدة 20 دقيقة قبل المسح الضوئي.
      ملاحظة: يمكن استبدال مراحل وأعمار الحيوانات الأخرى بسهولة للدراسة.
  3. تحليل نشاط WormScan في لوحة 96 جيدا وتصدير البيانات إلى جدول البيانات.
    1. مسح كل 96 جيدا، واضحة، مسطحة القاع، microplate مرتين بالتتابع باستخدام الماسح الضوئي المسطح القياسية، مع أقل من 10 ثانية بين الاشعة.
      ملاحظة: هنا، تم استخدام الماسح الضوئي للصور بدقة 1200 نقطة/بوصة وتدرج رمادي 16 بت لإنتاج صور JPEG. الوقت اللازم لمسح أربع لوحات 96 بئر باستخدام الماسح الضوئي للصورة أقل من 10 دقيقة.
    2. محاذاة مسحين متتالية (الشكل 2A) باستخدام البرمجيات مفتوحة المصدر49.
      ملاحظة: البرنامج بإنشاء صورة اختلاف لتقييم التغييرات بكسل بين الصورتين متسلسلة لمنطقة الفائدة (الشكل 2B) و نقاط WormScanنسبي . هذه النتيجة WormScan يعادل التغيرات في الاستجابة الحركية على أساس كثافة الضوء التي تنتجها الماسح الضوئي عند تعيينها إلى عتبة بكسل من 5 (الشكل 2C).
    3. تصدير البيانات من WormScan ك جدول بيانات. حفظ جدول البيانات الذي يحتوي على البيانات إلى الكمبيوتر المحلي. تطبيع البيانات كنسبة مئوية من السيطرة (POC) ومقارنة عبر التجارب البيولوجية تكرار لظروف متحولة متنوعة أو العلاج. إجراء تحليل إحصائي لمقارنة متحولة والتحكم يعني استخدام الطالب ر-اختبار.

النتائج

تحليل النشاط الحركي C. elegans في وسائل الإعلام السائلة يمكن بسهولة التقاط النمط الظاهري المتكامل لنماذج دودة مرض الميتوكوندريا التي قد لا تكون قابلة للقياس الكمي بسهولة على وسائل الإعلام الصلبة. تم استخدام ZebraLab لقياس النشاط الحركي لمجمع الميتوكوندريا الراسخ I مرض الغاز-1(fc21)سل...

Discussion

هنا، لخصت الدراسة معلومات مفصلة والأساس المنطقي لدراسة النشاط العصبي العضلي C. elegans على مستوى النتائج المتنوعة، بما في ذلك سحق الديدان، والحركة، وضخ البلعوم، وchemocis. أجريت مقارنة 16 منهجية مختلفة لتحليل النشاط من حيث الإنتاجية النسبية والمزايا والقيود المفروضة على أنشطة النيماتودا ال...

Disclosures

م.ل.، ن.د.M، ن.س.، و إي.إن.أو. ليس لديهم إفصاحات مالية ذات صلة. M.J.F. هو المؤسس المشارك لشركة MitoCUREia، وعضو المجلس الاستشاري العلمي مع حصة الأسهم في RiboNova، وشركة، وعضو المجلس العلمي كمستشار مدفوع الأجر مع Khondrion، واريمار العلاجية. وقد سبق أن M.J.F. أو تشارك حاليا مع العديد من الشركات العاملة في مرض الميتوكوندريا العلاجية قبل السريرية و / أو تطوير المرحلة السريرية كمستشار مدفوع الأجر (أستيلاس [سابقا ميتوبريدج] فارما شركة, Cyclerion العلاجية، Epirium الحيوي، ايميل العلاجية، Minovia العلاجية، NeuroVive، رينيو العلاجية، الشبح BioTherapeutics، Zogenix، وشركة) و / أو متعاون البحوث برعاية (AADI العلاجية، كارديرو العلاجية، Cyclerion العلاجية، ايميل العلاجية، شركة مينوفيا العلاجية، بعثة العلاجية، NeuroVive، رابتور العلاجية، REATA شركة، RiboNova شركة، Standigm العلاجية، والشبح BioTherapeutics).

Acknowledgements

ونحن ممتنون لأنتوني روزنر، دكتوراه، بدعمه التنظيمي للتحضير المبكر لهذا المشروع، وإيرين هاوس للمساهمة في تحليل البروتوكول. تم تمويل هذا العمل من قبل صندوق جولييت لأبحاث أمراض الميتوكوندريا علاج FBXL4، وصندوق أبحاث جاكسون فلينت C12ORF65، والمعاهد الوطنية للصحة (R01-GM120762، R01-GM120762-08S1، R35-GM134863، و T32-NS007413). المحتوى هو مسؤولية المؤلفين فقط ولا يمثل بالضرورة وجهات النظر الرسمية للممولين أو المعاهد الوطنية للصحة.

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
C. elegans wild isolate Caenorhabditis Genetics Center (CGC)N2 Bristol
CameraOlympusDP73
gas-1(fc-21)CGCCW152
Microscope slidesThermoFisher4951PLUS
Nematode Growth Medium (NGM)Research Products International Corp.N81800-1000.0
OP50 Escherichia coliCGCUracil auxotroph E. coli strain
Petri dishes (60 mm) VWR international25373-085
S. BasalVWR 5.85 g NaCl, 1 g K2 HPO4, 6 g KH2PO4, and 5 mg cholesterol, in 1 l H2OVWR 101175-162, 103467-156, EM1.09828.1000, 97061-660
ScannerEPSONV800
StereomicroscopeOlympusMVX10 microscope
96-well flat bottom VWR international29442-056
WormScan softwareMathew et al. 45S1 Standalone Java platformSoftware for automation of difference image of scanned plates
ZebraLab softwareViewPointSoftware for automated quantization and tracking of zebrafish behavior, designed by ViewPoint (http://www.viewpoint.fr/en/p/software/zebralab-zebrafish-behavior-screening) and here applied to C. elegans. This system is applicable for high-throughput behavioral analysis

References

  1. Husson, S. J., Costa, W. S., Schmitt, C., Gottschalk, A. Keeping track of worm trackers. WormBook. , 1-17 (2013).
  2. Shaye, D. D., Greenwald, I. OrthoList: a compendium of C. elegans genes with human orthologs. PLoS One. 6 (5), 20085 (2011).
  3. van Ham, T. J., et al. C. elegans model identifies genetic modifiers of alpha-synuclein inclusion formation during aging. PLoS Genetics. 4 (3), 1000027 (2008).
  4. Kim, W., Underwood, R. S., Greenwald, I., Shaye, D. D. OrthoList 2: A new comparative genomic analysis of human and Caenorhabditis elegans genes. Genetics. 210 (2), 445-461 (2018).
  5. Dingley, S., et al. Mitochondrial respiratory chain dysfunction variably increases oxidant stress in Caenorhabditis elegans. Mitochondrion. 10 (2), 125-136 (2010).
  6. Polyak, E., Zhang, Z., Falk, M. J. Molecular profiling of mitochondrial dysfunction in Caenorhabditis elegans. Methods in Molecular Biology. 837, 241-255 (2012).
  7. McCormick, E., Place, E., Falk, M. J. Molecular genetic testing for mitochondrial disease: from one generation to the next. Neurotherapeutics. 10 (2), 251-261 (2013).
  8. McCormack, S., et al. Pharmacologic targeting of sirtuin and PPAR signaling improves longevity and mitochondrial physiology in respiratory chain complex I mutant Caenorhabditis elegans. Mitochondrion. 22, 45-59 (2015).
  9. Polyak, E., et al. N-acetylcysteine and vitamin E rescue animal longevity and cellular oxidative stress in pre-clinical models of mitochondrial complex I disease. Molecular Genetics and Metabolism. 123 (4), 449-462 (2018).
  10. Guha, S., et al. Pre-clinical evaluation of cysteamine bitartrate as a therapeutic agent for mitochondrial respiratory chain disease. Human Molecular Genetics. 28 (11), 1837-1852 (2019).
  11. Gorman, G. S., et al. Prevalence of nuclear and mitochondrial DNA mutations related to adult mitochondrial disease. Annals of Neurology. 77 (5), 753-759 (2015).
  12. Mancuso, M., Orsucci, D., Filosto, M., Simoncini, C., Siciliano, G. Drugs and mitochondrial diseases: 40 queries and answers. Expert Opinion on Pharmacotherapy. 13 (4), 527-543 (2012).
  13. Gai, X., et al. Mutations in FBXL4, encoding a mitochondrial protein, cause early-onset mitochondrial encephalomyopathy. American Journal of Human Genetics. 93 (3), 482-495 (2013).
  14. Dillin, A., et al. Rates of behavior and aging specified by mitochondrial function during development. Science. 298 (5602), 2398-2401 (2002).
  15. Yemini, E., Jucikas, T., Grundy, L. J., Brown, A. E., Schafer, W. R. A database of Caenorhabditis elegans behavioral phenotypes. Nature Methods. 10 (9), 877-879 (2013).
  16. Bargmann, C. I., Avery, L. Laser killing of cells in Caenorhabditis elegans. Methods in Cell Biology. 48, 225-250 (1995).
  17. Avery, L., Horvitz, H. R. Effects of starvation and neuroactive drugs on feeding in Caenorhabditis elegans. Journal of Experimental Zoology. 253 (3), 263-270 (1990).
  18. Chalfie, M., et al. The neural circuit for touch sensitivity in Caenorhabditis elegans. Journal of Neuroscience. 5 (4), 956-964 (1985).
  19. Ghosh, R., Emmons, S. W. Episodic swimming behavior in the nematode C. elegans. Journal of Experimental Biology. 211 (23), 3703-3711 (2008).
  20. Rankin, C. H., Beck, C. D., Chiba, C. M. Caenorhabditis elegans: a new model system for the study of learning and memory. Behavioural Brain Research. 37 (1), 89-92 (1990).
  21. Avery, L. Motor neuron M3 controls pharyngeal muscle relaxation timing in Caenorhabditis elegans. Journal of Experimental Zoology. 175, 283-297 (1993).
  22. Ward, S. Chemotaxis by the nematode Caenorhabditis elegans: identification of attractants and analysis of the response by use of mutants. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 70 (3), 817-821 (1973).
  23. Bargmann, C. I., Thomas, J. H., Horvitz, H. R. Chemosensory cell function in the behavior and development of Caenorhabditis elegans. Cold Spring Harbor Symposia on Quantitative Biology. 55, 529-538 (1990).
  24. Anne, C. H. Behavior. WormBook: The Online Review of C. elegans Biology. 2005-2018, (2006).
  25. Biston, M. C., et al. An objective method to measure cell survival by computer-assisted image processing of numeric images of Petri dishes. Physics in Medicine & Biology. 48 (11), 1551-1563 (2003).
  26. Nussbaum-Krammer, C. I., Neto, M. F., Brielmann, R. M., Pedersen, J. S., Morimoto, R. I. Investigating the spreading and toxicity of prion-like proteins using the metazoan model organism C. elegans. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (95), e52321 (2015).
  27. Shi, W., Qin, J., Ye, N., Lin, B. Droplet-based microfluidic system for individual Caenorhabditis elegans assay. Lab on a Chip. 8 (9), 1432-1435 (2008).
  28. Javer, A., et al. An open-source platform for analyzing and sharing worm-behavior data. Nature Methods. 15 (9), 645-646 (2018).
  29. Koopman, M., et al. Assessing motor-related phenotypes of Caenorhabditis elegans with the wide field-of-view nematode tracking platform. Nature Protocols. 15 (6), 2071-2106 (2020).
  30. Churgin, M. A., et al. Longitudinal imaging of Caenorhabditis elegans in a microfabricated device reveals variation in behavioral decline during aging. eLife. 6, 26652 (2017).
  31. Angstman, N. B., Kiessling, M. C., Frank, H. G., Schmitz, C. High interindividual variability in dose-dependent reduction in speed of movement after exposing C. elegans to shock waves. Frontiers in Behavioral Neuroscience. 9, 12 (2015).
  32. Rahman, M., et al. NemaLife chip: a micropillar-based microfluidic culture device optimized for aging studies in crawling C. elegans. Scientific Reports. 10 (1), 16190 (2020).
  33. Bianchi, J. I., Stockert, J. C., Buzzi, L. I., Blazquez-Castro, A., Simonetta, S. H. Reliable screening of dye phototoxicity by using a Caenorhabditis elegans fast bioassay. PLoS One. 10 (6), 0128898 (2015).
  34. Albertson, D. G., Thomson, J. N. The pharynx of Caenorhabditis elegans. Philososophical Transactions of the Royal Society of London. Series B, Biological Sciences. 275 (938), 299-325 (1976).
  35. Raizen, D. M., Avery, L. Electrical activity and behavior in the pharynx of Caenorhabditis elegans. Neuron. 12 (3), 483-495 (1994).
  36. Avery, L., You, Y. J. C. elegans feeding. WormBook. , 1-23 (2012).
  37. Morck, C., Rauthan, M., Wagberg, F., Pilon, M. pha-2 encodes the C. elegans ortholog of the homeodomain protein HEX and is required for the formation of the pharyngeal isthmus. Developmental Biology. 272 (2), 403-418 (2004).
  38. Song, B. M., Avery, L. Serotonin activates overall feeding by activating two separate neural pathways in Caenorhabditis elegans. TheJournal of Neuroscience. 32 (6), 1920-1931 (2012).
  39. Avery, L., Raizen, D., Lockery, S. Electrophysiological methods. Methods in Cell Biology. 48, 251-269 (1995).
  40. Kopito, R. B., Levine, E. Durable spatiotemporal surveillance of Caenorhabditis elegans response to environmental cues. Lab in a Chip. 14 (4), 764-770 (2014).
  41. Lee, K. S., et al. Serotonin-dependent kinetics of feeding bursts underlie a graded response to food availability in C. elegans. Nature Communications. 8, 14221 (2017).
  42. Brinkmann, V., Ale-Agha, N., Haendeler, J., Ventura, N. The Aryl Hydrocarbon Receptor (AhR) in the aging process: Another puzzling role for this highly conserved transcription factor. Frontiers in Physiology. 10, 1561 (2019).
  43. Huang, C., et al. Intrinsically aggregation-prone proteins form amyloid-like aggregates and contribute to tissue aging in Caenorhabditis elegans. eLife. 8, 43059 (2019).
  44. Zhu, B., et al. Functional analysis of epilepsy-associated variants in STXBP1/Munc18-1 using humanized Caenorhabditis elegans. Epilepsia. 61 (4), 810-821 (2020).
  45. Weeks, J. C., Robinson, K. J., Lockery, S. R., Roberts, W. M. Anthelmintic drug actions in resistant and susceptible C. elegans revealed by electrophysiological recordings in a multichannel microfluidic device. International Journal of Parasitology. Drugs and Drug Resistance. 8 (3), 607-628 (2018).
  46. Haroon, S., et al. Multiple molecular mechanisms rescue mtDNA disease in C. elegans. Cell Reports. 22 (12), 3115-3125 (2018).
  47. Swierczek, N. A., Giles, A. C., Rankin, C. H., Kerr, R. A. High-throughput behavioral analysis in C. elegans. Nature Methods. 8 (7), 592-598 (2011).
  48. Mathew, M. D., Mathew, N. D., Ebert, P. R. WormScan: a technique for high-throughput phenotypic analysis of Caenorhabditis elegans. PLoS One. 7 (3), 33483 (2012).
  49. Mathew, M. D., et al. Using C. elegans forward and reverse genetics to identify new compounds with anthelmintic activity. PLoS Neglected Tropical Diseases. 10 (10), 0005058 (2016).
  50. Kayser, E. B., Morgan, P. G., Hoppel, C. L., Sedensky, M. M. Mitochondrial expression and function of GAS-1 in Caenorhabditis elegans. Journal Biological Chemistry. 276 (23), 20551-20558 (2001).
  51. Falk, M. J., Kayser, E. B., Morgan, P. G., Sedensky, M. M. Mitochondrial complex I function modulates volatile anesthetic sensitivity in C. elegans. Current Biology. 16 (16), 1641-1645 (2006).
  52. Kwon, Y. J., Guha, S., Tuluc, F., Falk, M. J. High-throughput BioSorter quantification of relative mitochondrial content and membrane potential in living Caenorhabditis elegans. Mitochondrion. 40, 42-50 (2018).
  53. Hirsh, D., Oppenheim, D., Klass, M. Development of the reproductive system of Caenorhabditis elegans. Developmental Biology. 49 (1), 200-219 (1976).
  54. Steele, W. B., Mole, R. A., Brooks, B. W. Experimental protocol for examining behavioral response profiles in larval fish: Application to the Neuro-stimulant caffeine. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (137), e57938 (2018).
  55. Carlsson, G., Blomberg, M., Pohl, J., Orn, S. Swimming activity in zebrafish larvae exposed to veterinary antiparasitic pharmaceuticals. Environmental Toxicology and Pharmacology. 63, 74-77 (2018).
  56. Yang, X., et al. High-throughput screening in larval zebrafish identifies novel potent sedative-hypnotics. Anesthesiology. 129 (3), 459-476 (2018).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

170 C elegans chemotaxis ZebraLab WormScan 1 fc21

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved