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In questo articolo

  • Riepilogo
  • Abstract
  • Introduzione
  • Protocollo
  • Risultati
  • Discussione
  • Divulgazioni
  • Riconoscimenti
  • Materiali
  • Riferimenti
  • Ristampe e Autorizzazioni

Riepilogo

Questo studio presenta protocolli per due approcci di analisi dell'attività locomotoria semi-automatizzati nei vermi del gas-1della malattia di C. elegans complesso I(fc21),vale a dire ZebraLab (un saggio a medio rendimento) e WormScan (un saggio ad alto rendimento) e fornisce analisi comparative tra una vasta gamma di metodi di ricerca per quantificare il comportamento dei nematodi e la funzione neuromuscolare integrata.

Abstract

Caenorhabditis elegans è ampiamente riconosciuta per la sua utilità centrale come modello animale traslazionale per interrogare in modo efficiente meccanismi e terapie di diverse malattie umane. I vermi sono particolarmente adatti per gli screening genetici e farmacologici ad alto rendimento per ottenere una visione più approfondita degli obiettivi terapeutici e delle terapie sfruttando il loro ciclo di sviluppo rapido, le grandi dimensioni della covata, la breve durata della vita, la trasparenza microscopica, i bassi costi di manutenzione, la robusta suite di strumenti genomici, i repository mutanti e le metodologie sperimentali per interrogare la fisiologia sia in vivo che ex vivo. L'attività locomotoria del verme rappresenta un fenotipo particolarmente rilevante che è frequentemente compromesso nella malattia mitocondriale, che è altamente eterogenea nelle cause e nelle manifestazioni, ma condivide collettivamente una ridotta capacità di produrre energia cellulare. Mentre una suite di metodologie diverse può essere utilizzata per interrogare il comportamento dei worm, queste variano notevolmente in termini di costi sperimentali, complessità e utilità per schermi genomici o ad alto rendimento dei farmaci. Qui, sono stati confrontati il throughput relativo, i vantaggi e i limiti di 16 diverse metodologie di analisi dell'attività che quantificano la locomozione dei nematodi, il thrashing, il pompaggio faringeo e / o la chemiotassi in singoli vermi o popolazioni di vermi di C. elegans in diversi stadi, età e durate sperimentali. Sono stati dimostrati protocolli dettagliati per due metodi semi-automatizzati per quantificare l'attività locomotoria dei nematodi che rappresentano nuove applicazioni degli strumenti software disponibili, vale a dire ZebraLab (un approccio a medio rendimento) e WormScan (un approccio ad alto rendimento). I dati derivanti dall'applicazione di questi metodi hanno dimostrato gradi simili di ridotta attività animale verificatisi allo stadio larvale L4 e progrediti negli adulti del giorno 1, nella malattia mitocondriale del complesso I (gas-1(fc21)) rispetto ai vermi mutanti wild-type (N2 Bristol) C. elegans. Questi dati convalidano l'utilità per queste nuove applicazioni di utilizzare gli strumenti software ZebraLab o WormScan per quantificare l'attività locomotoria dei vermi in modo efficiente e oggettivo, con capacità variabile di supportare lo screening farmacologico ad alto rendimento sul comportamento dei vermi in modelli animali preclinici di malattia mitocondriale.

Introduzione

Caenorhabiditis elegans è ampiamente riconosciuto come un modello eccezionale nelle neuroscienze basato sul fatto che ha 302 neuroni che coordinano tutti i comportamenti dei vermi, tra cui accoppiamento, alimentazione, deposizione delle uova, defecazione, nuoto e locomozione su mezzi solidi1. Questi nematodi ermafroditi sono anche ampiamente utilizzati per comprendere una vasta gamma di meccanismi di malattia umana, resi possibili dal suo genoma ben caratterizzato e dall'elevata omologia di ~ 80% di geni tra C. elegans e gli esseri umani2,3,4. C. elegans è stato a lungo usato per interrogare la malattia mitocondriale umana5,6,7,8,9,10, che è un gruppo altamente geneticamente e fenotipicamente eterogeneo di disturbi metabolici ereditari che condividono la ridotta capacità di generare energia cellulare e spesso clinicamente presenti con funzionalità neuromuscolare sostanzialmente compromessa, intolleranza all'esercizio fisico e affaticamento11 ,12,13,14. A tal fine, l'uso di modelli di C. elegans consente la modellazione preclinica degli aspetti quantitativi dell'attività animale e della funzione neuromuscolare in diversi sottotipi genetici di malattia mitocondriale, nonché la loro risposta a terapie candidate che possono migliorare la loro funzione neuromuscolare e l'attività complessiva.

L'attività neuromuscolare in C. elegans è oggettivamente misurabile da una serie di metodologie sperimentali, tra cui approcci sia manuali che semi-automatizzati che consentono analisi funzionali in mezzi solidi o liquidi(Tabella 1)1,15. L'accurata quantificazione dell'attività di C. elegans si è rivelata importante per consentire scoperte relative alla funzione e allo sviluppo del sistema muscolare e nervoso16,17,18. Questo studio riassume e confronta i requisiti sperimentali, i vantaggi e le limitazioni di 17 diversi saggi che possono essere eseguiti nei laboratori di ricerca per valutare la funzione e l'attività neuromuscolare su quattro risultati chiave nei modelli di malattie di C. elegans, sia al basale in una serie di stadi di sviluppo ed età, sia in risposta alle terapie candidate (Tabella 1 ). In effetti, lo studio fornisce una panoramica dettagliata della gamma di approcci sperimentali disponibili per caratterizzare i tassi di C. elegans thrashing (curve corporee al minuto), l'attività locomotoria, il pompaggio faringeo e la chemiotassi, specificando in ogni caso la metodologia sperimentale e analitica utilizzata, i vantaggi e i limiti di ciascun metodo, le attrezzature e il software necessari per eseguire e analizzare ciascun test, e la capacità di produzione di ciascun metodo di sostenerne l'uso a fini di screening genetico o farmacologico ad alto rendimento. La capacità di throughput di ciascun test è descritta come bassa, media o alta in base alla complessità del protocollo sperimentale, compresa la manutenzione del worm, il tempo di elaborazione, l'uso di piastre a singolo o multi-pozzo e / o il tempo dello sperimentatore necessario per completare l'impostazione sperimentale e le analisi dei dati.

Le analisi manuali di thrashing19,attività locomotoria20,pompaggio faringeo17,21,e chemiotassi22,23 sono metodologie consolidate per valutare l'attività dei vermi che richiedono uno stereomicroscopio24. Mentre la misurazione dell'attività di thrashing dei vermi richiede l'analisi in mezzi liquidi per determinare la frequenza delle curve corporee al minuto, l'attività locomotoria dei vermi può essere misurata su mezzi solidi o in mezzi liquidi. Tuttavia, le analisi manuali dell'attività dei singoli worm richiedono intrinsecamente molto tempo e comportano inevitabili pregiudizi generati dall'utente. L'automazione delle analisi dell'attività dei worm riduce al minimo i pregiudizi generati dall'utente e può aumentare notevolmente il throughput sperimentale25. Le registrazioni video dell'attività di worm thrashing in media liquidi possono essere analizzate utilizzando wrMTrck, un plugin ImageJ26. Tuttavia, le impostazioni sperimentali originali sviluppate per wrMTrck ne limitavano l'utilità, poiché troppi worm in una singola goccia di liquido portavano alla sovrapposizione di vermi che rendevano difficile il tracciamento accurato. Sebbene questa limitazione sperimentale sia stata risolta27, il metodo wrMTrck non è in grado di supportare lo screening ad alta produttività.

Esiste una serie di metodi per quantificare l'attività locomotoria del verme al basale e in risposta alle terapie candidate in modelli di malattia mitocondriale di C. elegans. Questi includono ZebraLab (ViewPoint Life Sciences), Tierpsy Tracker28, wide field-of-view nematode tracking platform (WF-NTP)29, WormMotel, WormWatcher30, WormLab31, Infinity Chip32e WMicrotracker One33 (Tabella 1). Questi metodi consentono l'analisi simultanea della locomozione in più ceppi o condizioni di vermi, in genere su piastre multi-pozzo, supportando così applicazioni di screening farmacologico a più alto rendimento. Alcuni di questi metodi hanno considerazioni uniche che possono limitare o migliorare la loro utilità generale, come la necessità di apparecchiature costose rispetto al software ad accesso aperto e la diversa facilità di esecuzione dei protocolli sperimentali. Nel complesso, nessun singolo sistema o protocollo sperimentale è ideale per tutti gli esperimenti di attività locomotoria di C. elegans. Piuttosto, è importante scegliere attentamente quale metodo è più adatto agli obiettivi e ai requisiti sperimentali dello specifico investigatore.

Il pompaggio faringeo rappresenta un altro importante risultato per valutare l'attività neuromuscolare in C. elegans. La faringe di C. elegans è composta da 20 cellule muscolari, 20 neuroni e altre 20 cellule che consentono l'ingestione di Escherichia coli (E. coli) all'estremità anteriore del tratto alimentare del verme34,35,36. Sono stati stabiliti diversi metodi manuali per determinare le velocità di pompaggio faringeo17,21,37,38. La maggior parte dei metodi si basa sull'uso di uno stereomicroscopio e di una telecamera per visualizzare e registrare la frequenza di pompaggio faringeo con conteggio diretto da parte dell'osservatore sperimentale21. L'analisi automatizzata della velocità di pompaggio faringeo è possibile eseguendo una registrazione extracellulare denominata elettrofaringeogramma (EPG), che fornisce ulteriori informazioni sulla durata di ciascuna pompa39. L'analisi della velocità di pompaggio faringea è possibile anche in un sistema microfluidico, WormSpa, dove i singoli vermi sono confinati nelle camere40,41. Un metodo commerciale disponibile per facilitare l'analisi della velocità della pompa faringea è il sistema ScreenChip (InVivo Biosystems), che misura, visualizza e analizza gli aspetti neuromuscolari del comportamento alimentare in un singolo verme immobilizzato in un chip personalizzato. Questo approccio di quantificazione del pompaggio faringeo può essere utilizzato per valutare le risposte sia neuronali che fisiologiche ai farmaci, all'invecchiamento e ad altri fattori42,43,44,45.

La chemiotassi descrive il movimento di C. elegans in risposta a un odorante posto lontano dai vermi in un'area definita della piastra del mezzo di crescita dei nematodi (NGM). La valutazione della risposta alla chemiotassi fornisce una misura integrata dell'attività neuronale e neuromuscolare del verme che è quantificabile osservando e misurando la distanza fisica percorsa dai vermi verso l'odorante in un periodo di tempo definito46. Il Multi-Worm Tracker è un metodo automatico che può essere utilizzato per migliorare l'efficienza sperimentale di quantificazione della distanza percorsa dai vermi verso un attrattivo o da un repellente47.

Qui viene descritto il protocollo dettagliato per due nuovi metodi semi-automatizzati stabiliti per quantificare l'attività dei worm. Il primo approccio utilizza ZebraLab, un software commerciale originariamente sviluppato per studiare l'attività di nuoto di Danio rerio (zebrafish), per una nuova applicazione a medio rendimento per quantificare l'attività locomotoria complessiva nei mezzi liquidi di C. elegans in base ai cambiamenti dei pixel durante il movimento (Tabella 1, Figura 1). L'output dei dati viene ottenuto rapidamente da un gran numero di condizioni e campioni simultanei analizzati su un vetrino, sebbene questo metodo non sia adatto a un formato di piastra multi-pozzo. Il secondo approccio è un nuovo adattamento della metodologia WormScan48,49 ( Figura2), che utilizza uno scanner piano per creare un'immagine differenziale di due scansioni sequenziali che possono essere utilizzate in modo variabile con software open source per consentire l'analisi quantitativa semi-automatizzata di risultati fisiologici integrati come la fecondità e la sopravvivenza. Qui è stato sviluppato un nuovo adattamento ad alto rendimento della metodologia WormScan per quantificare l'attività locomotoria dei vermi in mezzi liquidi in popolazioni di quindici vermi allo stadio larvale 4 (L4) per pozzetti di una piastra a fondo piatto a 96 pozzetti. Questa metodologia WormScan semi-automatizzata e a basso costo può essere facilmente adattata a schermi di farmaci ad alto rendimento, nonché ad analisi di vari stadi animali e di etàcompresa tra 48e49 anni.

Qui, il protocollo e l'efficacia dell'analisi dell'attività locomotoria di C. elegans utilizzando sia i metodi semi-automatizzati ZebraLab che WormScan sono dimostrati in un modello ben consolidato di C. elegans per la malattia del complesso mitocondriale I, gas-1(fc21). gas-1 (gene K09A9.5) è un ortologo di NDUFS2 umano (NADH: nucleo di ubichinone ossidoreduttasi (proteina ferro-zolfo) subunità 2) (Figura 3). Il ceppo mutante C. elegans gas-1(fc21) porta una mutazione omozigote p.R290K missenso nell'ortologo umano di NDUFS250, causando una significativa diminuzione della fecondità e della durata della vita, compromissione della capacità di fosforilazione ossidativa della catena respiratoria (OXPHOS)51, nonché diminuzione della massa mitocondriale e del potenziale di membrana con aumento dello stress ossidativo5,8 . Nonostante il suo uso consolidato negli ultimi due decenni per studiare la malattia mitocondriale, l'attività locomotoria dei mutanti gassosi 1(fc21)non è stata precedentemente segnalata. Qui, i metodi ZebraLab e WormScan sono stati applicati per quantificare in modo indipendente l'attività locomotoria del gas-1(fc21)rispetto ai vermi wild-type (WT, N2 Bristol), sia come un modo per convalidare i metodi, sia per dimostrare la loro utilità comparativa ed efficienza dei protocolli sperimentali e delle analisi informatiche. Il software ZebraLab ha permesso una rapida quantificazione di diverse condizioni simultanee di attività locomotoria del verme in modelli di malattia mitocondriale di C. elegans, con potenziale applicazione per lo screening mirato dei farmaci o studi di convalida. L'analisi wormScan, in particolare, è adatta per abilitare prontamente screening farmacologici ad alto rendimento di librerie di composti e dare priorità ai lead che migliorano la funzione neuromuscolare animale e l'attività locomotoria nei modelli preclinici di C. elegans della malattia mitocondriale primaria.

Protocollo

1. Analisi dell'attività locomotoria worm in mezzi liquidi su vetrini utilizzando il software ZebraLab

  1. Crescita e manipolazione dei nematodi
    1. Coltivare C. elegans su piastre di Petri contenenti mezzi di crescita di nematodi (NGM) e diffondersi con Escherichia coli OP50 come fonte di cibo. Mantenere la coltura di vermi a 20 °C, come descritto in precedenza8.
    2. Sincronizza i vermi eseguendo un uovo a tempodea 52 e studia i vermi nella fase desiderata. In questo protocollo, sono stati analizzati i worm dello stadio L4.
    3. Crescere il controllo e i ceppi di vermi mutanti su piastre NGM con e senza trattamenti farmacologici da testare o controllo tampone. Per valutare gli effetti del trattamento farmacologico, preparare la concentrazione desiderata di stock di farmaco in soluzione basale di S.; distribuire il volume specifico calcolato sulle piastre NGM e lasciarlo asciugare. Trasferire i vermi in uno specifico stadio larvale o adulto e mantenere sulla piastra di trattamento farmacologico per la durata desiderata prima dell'analisi.
  2. Set-up sperimentale di vermi per la registrazione video dell'attività locomotoria e l'analisi ZebraLab
    1. Scegliete 5 worm L4 sincronizzati per ceppo e condizione utilizzando un worm pick. Pipettare una singola goccia da 20 μL di soluzione basale di S. su un vetrino situato sotto uno stereomicroscopio collegato a una telecamera e trasferire 5 vermi in esso (Figura 1A,B). Trasferire i 5 vermi dalla capsula di Petri contenente NGM ed E. coli OP50 alla goccia liquida solo nel momento precedente la registrazione.
      NOTA: Continuare a mantenere gli altri vermi sulla capsula di Petri fino a quando non viene registrato il video precedente. Ciò eviterà i danni causati sugli altri vermi a causa dell'essiccazione delle gocce da 20 μl durante la procedura (tempo di asciugatura ~ 15-20 min).
    2. Pipettare più gocce su una diapositiva per ottenere più repliche tecniche (Figura 1A). Selezionare i vermi da diverse piastre NGM (replica biologica). Non utilizzare il coperchio slip.
    3. Regolare la distanza di lavoro del microscopio per visualizzare l'area completa di una singola goccia. Impostare e mantenere una bassa risoluzione video (<1024 x 768) per caricare i file nel software.
    4. Lasciare che i vermi si acclimatino sul vetrino a temperatura ambiente per 1 minuto prima della registrazione.
    5. Registra l'attività di nuoto del verme in 1 goccia per 1 minuto a 15 fotogrammi al secondo (fps). Ripetere l'imaging per ogni goccia aggiuntiva sulla piastra.
  3. Analisi di registrazione dell'attività locomotoria di C. elegans nel software ZebraLab
    1. Utilizzate l'opzione ZEBRALAB AVI per caricare video sul software. Fare clic sull'opzione Quantizzazione con file AVI (Figura 1C).
    2. Per creare un nuovo protocollo, selezionare File > Genera protocolloe quindi aggiungere il numero di aree selezionate per l'analisi. Scegli Conteggio posizione: 1.
    3. Apri Parametri protocollo e seleziona 1 minuto nella finestra Durata esperimento. Selezionare una durata sperimentale diversa per durate sperimentali diverse. Selezionare o deselezionare la finestra No Time Bin e scegliere Periodo di integrazione, a seconda dell'output di dati desiderato. In questo studio è stato selezionato No Time Bin ( Figura1D).
      NOTA: il cestino temporale è il tempo in cui verrà mediata l'attività.
    4. Se un protocollo è già stato creato, selezionare Open Protocol e selezionare il protocollo salvato (in formato .vte).
    5. Seleziona File e Apri un filmato per caricare ogni singolo file video registrato in precedenza.
    6. Selezionare l'icona Area indicata nella Figura 1E (freccia nera) per creare una singola area di rilevamento e creare un'area attorno all'intera goccia di liquido in cui si trovano i vermi. Clicca su Seleziona, quindi sull'icona del cerchio verde (freccia grigia) sotto Aree > Costruisci > Cancella segni.
      NOTA: l'attività di tutti i worm nella goccia definita verrà rilevata nell'area selezionata (Figura 1E, F).
    7. Vai a Calibrazione > Scala di disegno (Figura 1E) e disegna una linea orizzontale da sinistra a destra dell'area video. Indicare la distanza reale da calibrare. Quindi selezionare Applica al gruppo.
    8. Deselezionate l'icona selezionata per costruire l'area (freccia nella Figura 1E)e selezionate o deselezionate Trasparente.
      NOTA: In questo studio, Transparent è stato selezionato e ha dato risultati migliori.
    9. Regolare la sensibilità di rilevamento e la soglia di attività per consentire il rilevamento di tutti i diversi ceppi di worm C. elegans analizzati.
      NOTA: In questo esperimento, la sensibilità di rilevamento è stata impostata su 8 con valori di burst e congelamento rispettivamente di 15 e 2 (Figura 1F).
    10. Impostare La scala di visualizzazione su 70 per visualizzare la traccia effettuata dall'animale mentre è in corso l'analisi dell'attività. Quindi selezionare Applica al gruppo ( Figura1F).
    11. Fare clic su Esperimento > Esegui > Salva connome , quindi su Avvia. Si apre una finestra. Scegliete Desiderate elaborare il supporto video alla massima velocità del computer? per analizzare rapidamente il video (ad esempio, una registrazione video di 1 minuto viene analizzata dal software In ZebraLab in 5 s).
    12. Si apre un'altra finestra: Esecuzione di esperimenti; clicca su Start per procedere con l'esperimento.
    13. Al termine della registrazione video, l'analisi si interrompe. Fai clic su Prova > Interrompi. In questo modo l'attività analizzata viene salvata da un singolo drop in un foglio di calcolo.
    14. Ripeti l'analisi per ogni video di singola goccia. Ogni goccia è una replica tecnica.
  4. Output e analisi dei dati ZebraLab
    NOTA: dopo l'esperimento, i dati di ciascun video vengono salvati singolarmente come fogli di calcolo separati nella cartella scelta. Nel file di output dei dati, il livello di attività integrato di tutti i worm che si muovono in una singola goccia viene registrato quando i pixel cambiano sotto actinteg.
    1. Apri ogni foglio di calcolo ottenuto dall'analisi di ogni video. Compilali manualmente in un unico file.
      Normalizza i dati mutanti e wild-type a una percentuale di controllo. Qui, sono state eseguite analisi statistiche per confrontare i livelli medi di attività tra i gruppi.

2. Analisi dell'attività locomotoria del verme in mezzi liquidi in formato piastra a 96 pozzi mediante analisi del software WormScan

  1. Crescita e manipolazione dei nematodi
    1. Coltivare C. elegans come descritto al paragrafo 1.1.1.
    2. Sincronizzare i worm come descritto nella sezione 1.1.2.
    3. Coltivare vermi su supporti specifici come descritto al paragrafo 1.1.3 fino allo stadio L4 o al giorno 1 adulto.
  2. Configurazione sperimentale di worm in piastra a 96 pozzi per l'analisi dell'attività WormScan
    1. Aggiungere 50 μL del 2% di peso per volume di E. coli OP50 in sospensione liquida in S. mezzo basale a ciascun pozzetta di una micropiastra a fondo piatto a 96 pozzezze, trasparente, come precedentemente descritto49,53.
    2. Sotto uno stereomicroscopio, selezionare manualmente 15 vermi sincronizzati allo stadio L4 o al giorno 1 adulto dalle loro piastre NGM in mezzi liquidi all'interno di ciascun pozzo sperimentale della micropiastra a 96 pozzetti. Lasciare che i vermi si acclimatino al mezzo liquido per 20 minuti prima della scansione.
      NOTA: Altre fasi ed età degli animali possono essere prontamente sostituite per lo studio.
  3. Analisi dell'attività WormScan in piastra a 96 pozzi ed esportazione dei dati in foglio di calcolo.
    1. Scansiona ogni micropiastra a 96 pozzette, trasparente, a fondo piatto, due volte in sequenza utilizzando uno scanner piano standard, con meno di 10 s tra le scansioni.
      NOTA: Qui, lo scanner fotografico con risoluzione di 1.200 punti / in e scala di grigi a 16 bit è stato utilizzato per produrre immagini jpeg. Il tempo necessario per scansionare quattro lastre da 96 pozzi utilizzando lo scanner fotografico è inferiore a 10 minuti.
    2. Allineare le due scansioni sequenziali (Figura 2A) utilizzando il software open source49.
      NOTA: il software genera un'immagine di differenza per valutare le variazioni di pixel tra le due immagini sequenziali per una regione di interesse (Figura 2B) e un punteggio WormScan relativo. Questo punteggio WormScan equivale a cambiamenti nella risposta locomotoria in base all'intensità luminosa prodotta dallo scanner quando impostato su una soglia di pixel di 5 (Figura 2C).
    3. Esportare i dati da WormScan come foglio di calcolo. Salvare il foglio di calcolo contenente i dati nel computer locale. Normalizzare i dati come percentuale di controllo (POC) e confrontare tra esperimenti di replica biologica per diverse condizioni mutanti o di trattamento. Eseguire analisi statistiche per confrontare i mezzi mutanti e di controllo utilizzando il t-testdello studente.

Risultati

L'analisi dell'attività locomotoria di C. elegans nel mezzo liquido potrebbe facilmente catturare un fenotipo integrato di modelli di vermi della malattia mitocondriale che potrebbero non essere facilmente quantificabili su mezzi solidi. ZebraLab è stato utilizzato per quantificare l'attività locomotoria del ceppo ben consolidato di gas-1della malattia mitocondriale I(fc21)rispetto ai WTworms in mezzi liquidi allo stadio larvale L4. L'attività di 5 vermi in una singola goccia liquida è sta...

Discussione

Qui, lo studio ha riassunto informazioni dettagliate e razionali per studiare l'attività neuromuscolare di C. elegans a livello di risultati diversi, tra cui il worm thrashing, la locomozione, il pompaggio faringeo e la chemiotassi. Il confronto di 16 diverse metodologie di analisi dell'attività è stato eseguito in termini di throughput relativo, vantaggi e limiti di quantificare le attività dei nematodi in una singola popolazione di vermi o vermi a diverse età e durate sperimentali. Tra questi, sono stati ...

Divulgazioni

M.L., N.D.M., N.S., e E.N.-O. non hanno informazioni finanziarie pertinenti. M.J.F. è co-fondatore di MitoCUREia, Inc., membro del comitato consultivo scientifico con partecipazioni azionarie in RiboNova, Inc., e membro del consiglio scientifico come consulente retribuito con Khondrion e Larimar Therapeutics. M.J.F. è stato o è attualmente impegnato con diverse aziende coinvolte nello sviluppo preclinico e/o clinico terapeutico della malattia mitocondriale come consulente retribuito (Astellas [ex Mitobridge] Pharma Inc., Cyclerion Therapeutics, Epirium Bio, Imel Therapeutics, Minovia Therapeutics, NeuroVive, Reneo Therapeutics, Stealth BioTherapeutics, Zogenix, Inc.) e/o collaboratore di ricerca sponsorizzato (AADI Therapeutics, Cardero Therapeutics, Cyclerion Therapeutics, Imel Therapeutics, Minovia Therapeutics Inc., Mission Therapeutics, NeuroVive, Raptor Therapeutics, REATA Inc., RiboNova Inc., Standigm Therapeutics e Stealth BioTherapeutics).

Riconoscimenti

Siamo grati ad Anthony Rosner, PhD., con il suo supporto organizzativo per la preparazione precoce di questo progetto, e a Erin Haus per aver contribuito all'analisi del protocollo. Questo lavoro è stato finanziato dal Juliet's Cure FBXL4 Mitochondrial Disease Research Fund, dal Jaxson Flynt C12ORF65 Research Fund e dal National Institutes of Health (R01-GM120762, R01-GM120762-08S1, R35-GM134863 e T32-NS007413). Il contenuto è di esclusiva responsabilità degli autori e non rappresenta necessariamente le opinioni ufficiali dei finanziatori o del National Institutes of Health.

Materiali

NameCompanyCatalog NumberComments
C. elegans wild isolate Caenorhabditis Genetics Center (CGC)N2 Bristol
CameraOlympusDP73
gas-1(fc-21)CGCCW152
Microscope slidesThermoFisher4951PLUS
Nematode Growth Medium (NGM)Research Products International Corp.N81800-1000.0
OP50 Escherichia coliCGCUracil auxotroph E. coli strain
Petri dishes (60 mm) VWR international25373-085
S. BasalVWR 5.85 g NaCl, 1 g K2 HPO4, 6 g KH2PO4, and 5 mg cholesterol, in 1 l H2OVWR 101175-162, 103467-156, EM1.09828.1000, 97061-660
ScannerEPSONV800
StereomicroscopeOlympusMVX10 microscope
96-well flat bottom VWR international29442-056
WormScan softwareMathew et al. 45S1 Standalone Java platformSoftware for automation of difference image of scanned plates
ZebraLab softwareViewPointSoftware for automated quantization and tracking of zebrafish behavior, designed by ViewPoint (http://www.viewpoint.fr/en/p/software/zebralab-zebrafish-behavior-screening) and here applied to C. elegans. This system is applicable for high-throughput behavioral analysis

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