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In diesem Artikel

  • Zusammenfassung
  • Zusammenfassung
  • Einleitung
  • Protokoll
  • Ergebnisse
  • Diskussion
  • Offenlegungen
  • Danksagungen
  • Materialien
  • Referenzen
  • Nachdrucke und Genehmigungen

Zusammenfassung

Diese Studie präsentiert Protokolle für zwei halbautomatische Ansätze zur Analyse der Bewegungsaktivität in C. elegans Komplex I Krankheit Gas-1(fc21) Würmer, nämlich ZebraLab (ein Mitteldurchsatz-Assay) und WormScan (ein Hochdurchsatz-Assay) und bieten vergleichende Analysen unter einer Vielzahl von Forschungsmethoden zur Quantifizierung des Nematodenverhaltens und der integrierten neuromuskulären Funktion.

Zusammenfassung

Caenorhabditis elegans ist weithin bekannt für seinen zentralen Nutzen als translationales Tiermodell zur effizienten Befragung von Mechanismen und Therapien verschiedener menschlicher Krankheiten. Würmer eignen sich besonders gut für genetische und Arzneimittel-Screens mit hohem Durchsatz, um tiefere Einblicke in therapeutische Ziele und Therapien zu erhalten, indem sie ihren schnellen Entwicklungszyklus, ihre große Brutgröße, ihre kurze Lebensdauer, ihre mikroskopische Transparenz, niedrige Wartungskosten, eine robuste Suite genomischer Werkzeuge, Mutantenlager und experimentelle Methoden zur Abfrage der In-vivo- und Ex-vivo-Physiologie nutzen. Die Aktivität des Wurmlokomotors stellt einen besonders relevanten Phänotyp dar, der häufig bei mitochondrialen Erkrankungen beeinträchtigt ist, die in Ursachen und Manifestationen sehr heterogen sind, aber gemeinsam eine beeinträchtigte Fähigkeit zur Produktion von Zellenergie aufweisen. Während eine Reihe verschiedener Methoden verwendet werden kann, um das Verhalten von Würmern zu untersuchen, unterscheiden sich diese stark in experimentellen Kosten, Komplexität und Nutzen für genomische oder medikamentöse Hochdurchsatz-Screens. Hier wurden der relative Durchsatz, die Vorteile und Einschränkungen von 16 verschiedenen Aktivitätsanalysemethoden verglichen, die die Fortbewegung von Nematoden, das Thrashing, das Pharynxpumpen und / oder die Chemotaxis in einzelnen Würmern oder Wurmpopulationen von C. elegans in verschiedenen Stadien, Altersgruppen und experimentellen Dauern quantifizieren. Detaillierte Protokolle wurden für zwei halbautomatische Methoden zur Quantifizierung der Nematoden-Bewegungsaktivität demonstriert, die neuartige Anwendungen verfügbarer Software-Tools darstellen, nämlich ZebraLab (ein Mitteldurchsatzansatz) und WormScan (ein Hochdurchsatzansatz). Daten aus der Anwendung dieser Methoden zeigten ähnliche Grade reduzierter Tieraktivität im L4-Larvenstadium und fortgeschritten bei Erwachsenen des Tag 1, bei mitochondrialenKomplex-I-Krankheit ( Gas-1(fc21)) mutierten Würmern relativ zu Wildtyp (N2 Bristol) C. elegans. Diese Daten bestätigen den Nutzen für diese neuartigen Anwendungen der Verwendung der Softwaretools ZebraLab oder WormScan zur effizienten und objektiven Quantifizierung der Wurmlokomotoraktivität mit variabler Kapazität zur Unterstützung eines Hochdurchsatz-Arzneimittelscreenings auf Wurmverhalten in präklinischen Tiermodellen für mitochondriale Erkrankungen.

Einleitung

Caenorhabiditis elegans ist weithin als herausragendes Modell in den Neurowissenschaften anerkannt, basierend auf 302 Neuronen, die alle Wurmverhaltensweisen koordinieren, einschließlich Paarung, Fütterung, Eiablage, Defäkation, Schwimmen und Fortbewegung auf festen Medien1. Diese hermaphroditischen Nematoden werden auch häufig verwendet, um eine breite Palette von menschlichen Krankheitsmechanismen zu verstehen, die durch ihr gut charakterisiertes Genom und ihre hohe Homologie von ~ 80% Genen zwischen C. elegans und Menschen ermöglicht werden2,3,4. C. elegans wird seit langem verwendet, um die menschliche mitochondriale Krankheit5,6, 7,8,9,10zuuntersuchen, die eine hochgradig genetisch und phänotypisch heterogene Gruppe von erblichen Stoffwechselstörungen ist, die eine beeinträchtigte Fähigkeit zur Erzeugung von Zellenergie teilen und oft klinisch mit erheblich beeinträchtigter neuromuskulärer Funktion, Belastungsintoleranz und Müdigkeit vorliegen11 ,12,13,14. Zu diesem Zweck ermöglicht die Verwendung von C. elegans-Modellen die präklinische Modellierung quantitativer Aspekte der tierischen Aktivität und der neuromuskulären Funktion in verschiedenen genetischen Subtypen mitochondrialer Erkrankungen sowie deren Reaktion auf Therapiekandidaten, die ihre neuromuskuläre Funktion und Gesamtaktivität verbessern können.

Die neuromuskuläre Aktivität bei C. elegans ist objektiv messbar durch eine Reihe experimenteller Methoden, einschließlich manueller und halbautomatischer Ansätze, die funktionelle Analysen in festen oder flüssigen Medien ermöglichen (Tabelle 1)1,15. Die genaue Quantifizierung der Aktivität von C. elegans hat sich als wichtig erwiesen, um Entdeckungen im Zusammenhang mit der Funktion und Entwicklung des Muskel- und Nervensystems zu ermöglichen16,17,18. Diese Studie fasst die experimentellen Anforderungen, Vorteile und Einschränkungen von 17 verschiedenen Assays zusammen und vergleicht sie, die in Forschungslabors durchgeführt werden können, um die neuromuskuläre Funktion und Aktivität an vier Schlüsselergebnissen in C. elegans-Krankheitsmodellen zu bewerten, sowohl zu Studienbeginn in einer Reihe von Entwicklungsstadien und Im alter als auch als Reaktion auf Kandidatentherapien (Tabelle 1 ). In der Tat bietet die Studie einen detaillierten Überblick über die Palette der verfügbaren experimentellen Ansätze zur Charakterisierung der Raten von C. elegans Thrashing (Körperbiegungen pro Minute), Bewegungsaktivität, Pharynxpumpen und Chemotaxis - jeweils unter Angabe der verwendeten experimentellen und analytischen Methodik, der Vorteile und Grenzen jeder Methode, der Ausrüstung und Software, die für die Durchführung und Analyse jedes Assays erforderlich sind. und die Durchsatzkapazität jeder Methode, um ihre Verwendung für genetische Hochdurchsatz- oder Arzneimittelscreening-Zwecke zu unterstützen. Die Durchsatzkapazität jedes Assays wird basierend auf der Komplexität des experimentellen Protokolls als niedrig, mittel oder hoch beschrieben, einschließlich der Wurmwartung, der Verarbeitungszeit, der Verwendung von Einzel- oder Mehrplatzplatten und/oder der Experimentatorzeit, die für die Fertigstellung der experimentellen Einstellung und der Datenanalysen erforderlich ist.

Manuelle Analysen von Thrashing19, Bewegungsaktivität20, Pharynxpumpen17,21und Chemotaxis22,23 sind etablierte Methoden zur Bewertung der Wurmaktivität, die ein Stereomikroskop erfordern24. Während die Messung der Schlagaktivität von Würmern eine Analyse in flüssigen Medien erfordert, um die Häufigkeit von Körperbiegungen pro Minute zu bestimmen, kann die Wurmlokomotoraktivität entweder auf festen Medien oder in flüssigen Medien gemessen werden. Manuelle Analysen der individuellen Wurmaktivität sind jedoch von Natur aus zeitaufwendig und beinhalten unvermeidliche benutzergenerierte Verzerrungen. Die Automatisierung von Wurmaktivitätsanalysen minimiert benutzergenerierte Verzerrungen und kann den experimentellen Durchsatz erheblich erhöhen25. Videoaufnahmen von Wurm-Thrashing-Aktivitäten in flüssigen Medien können mit wrMTrck, einem ImageJ-Plugin26,analysiert werden. Die ursprünglichen experimentellen Einstellungen, die für wrMTrck entwickelt wurden, schränkten jedoch seinen Nutzen ein, da zu viele Würmer in einem einzigen Flüssigkeitstropfen zu überlappenden Würmern führten, die eine genaue Verfolgung erschwerten. Während diese experimentelle Einschränkung aufgelöst wurde27,ist die wrMTrck-Methode nicht in der Lage, hochdurchsatziges Screening zu unterstützen.

Es gibt eine Reihe von Methoden zur Quantifizierung der Aktivität des Wurmlokomotors zu Studienbeginn und als Reaktion auf Mögliche Therapien in modellen der mitochondrialen Erkrankungen von C. elegans. Dazu gehören ZebraLab (ViewPoint Life Sciences), Tierpsy Tracker28, Wide Field-of-View Nematode Tracking Platform (WF-NTP)29, WormMotel, WormWatcher30, WormLab31, Infinity Chip32und WMicrotracker One33 (Tabelle 1). Diese Methoden ermöglichen die gleichzeitige Analyse der Fortbewegung in mehreren Wurmstämmen oder -bedingungen, typischerweise auf Multi-Well-Platten, wodurch Arzneimittel-Screening-Anwendungen mit höherem Durchsatz unterstützt werden. Einige dieser Methoden haben einzigartige Überlegungen, die ihren allgemeinen Nutzen einschränken oder verbessern können, z. B. die Notwendigkeit teurer Geräte im Vergleich zu Open-Access-Software und die unterschiedliche Leichtigkeit der Durchführung experimenteller Protokolle. Insgesamt ist kein einzelnes experimentelles System oder Protokoll ideal für alle C. elegans Bewegungsaktivitätsexperimente geeignet. Vielmehr ist es wichtig, sorgfältig auszuwählen, welche Methode für die experimentellen Ziele und Anforderungen des jeweiligen Prüfers am besten geeignet ist.

Das Pharynxpumpen stellt ein weiteres wichtiges Ergebnis zur Beurteilung der neuromuskulären Aktivität bei C. elegansdar. Der C. elegans pharynx besteht aus 20 Muskelzellen, 20 Neuronen und 20 weiteren Zellen, die die Einnahme von Escherichia coli (E. coli) am vorderen Ende des Verdauungstraktes des Wurms ermöglichen34,35,36. Es wurden mehrere manuelle Methoden zur Bestimmung der Pharynxpumpraten17,21,37,38etabliert. Die meisten Methoden basieren auf der Verwendung eines Stereomikroskops und einer Kamera zur Visualisierung und Aufzeichnung der pharyngealen Pumpfrequenz mit direkter Zählung durch den experimentellen Beobachter21. Eine automatisierte Pharynxpumpenratenanalyse ist durch die Durchführung einer extrazellulären Aufzeichnung des so bezeichneten Elektropharyngeogramms (EPG) möglich, die zusätzliche Informationen über die Dauer jederPumpe liefert 39. Die Analyse der Pharynxpumprate ist auch in einem mikrofluidischen System, WormSpa, möglich, bei dem einzelne Würmer in den Kammern40,41eingeschlossen sind. Eine kommerzielle Methode, um die Analyse der Pharynxpumpenrate zu erleichtern, ist das ScreenChip System (InVivo Biosystems), das die neuromuskulären Aspekte des Fütterungsverhaltens in einem einzelnen Wurm misst, visualisiert und analysiert, der in einem benutzerdefinierten Chip immobilisiert wird. Dieser Pharynxpumpen-Quantifizierungsansatz kann verwendet werden, um sowohl neuronale als auch physiologische Reaktionen auf Medikamente, Alterung und andere Faktoren zu bewerten42,43,44,45.

Chemotaxis beschreibt die Bewegung von C. elegans als Reaktion auf ein Geruchsmittel, das von den Würmern in einem definierten Bereich der Nematodenwachstumsmedienplatte (NGM) entfernt ist. Die Beurteilung der Chemotaxis-Reaktion liefert ein integriertes Maß für die neuronale und neuromuskuläre Aktivität von Würmern, das quantifizierbar ist, indem die physische Entfernung, die Würmer in einem definierten Zeitraum zum Geruchsstoff zurücklegen, beobachtet und gemessen wird46. Der Multi-Worm Tracker ist eine automatische Methode, mit der die experimentelle Effizienz der Quantifizierung der von Würmern zurückgelegten Entfernung zu einem Lockstoff oder von einem Abwehrmittel verbessert werden kann47.

Hier wird das detaillierte Protokoll für zwei neuartige, halbautomatische Methoden zur Quantifizierung der Wurmaktivität beschrieben. Der erste Ansatz verwendet ZebraLab, eine kommerzielle Software, die ursprünglich entwickelt wurde, um die Schwimmaktivität von Danio rerio (Zebrafisch) für eine neuartige Anwendung mit mittlerem Durchsatz zu untersuchen, um die Gesamtaktivität des Bewegungsapparates in flüssigen Medien von C. elegans basierend auf Pixeländerungen während der Bewegung zu quantifizieren (Tabelle 1, Abbildung 1). Die Datenausgabe wird schnell aus einer großen Anzahl von gleichzeitigen Bedingungen und Proben gewonnen, die auf einem Glasobjektträger analysiert werden, obwohl diese Methode nicht für ein Multi-Well-Plattenformat geeignet ist. Der zweite Ansatz ist eine neuartige Adaption der WormScan-Methodik48,49 ( Abbildung2), die einen Flachbettscanner verwendet, um ein differenzielles Bild von zwei sequenziellen Scans zu erstellen, die variabel mit Open-Source-Software verwendet werden können, um eine halbautomatische quantitative Analyse integrierter physiologischer Ergebnisse wie Fruchtbarkeit und Überleben zu ermöglichen. Hier wurde eine neuartige Hochdurchsatzadaption der WormScan-Methodik zur Quantifizierung der Wurmlokomotoraktivität in flüssigen Medien in Populationen von fünfzehn Larven-Würmern im Stadium 4 (L4) pro Vertiefung einer 96-Well-Flachbodenplatte entwickelt. Diese halbautomatische und kostengünstige WormScan-Methodik kann leicht an Hochdurchsatz-Arzneimittel-Screens sowie an Analysen verschiedener Tierstadien und im Alter von48,49Jahren angepasst werden.

Hier wird das Protokoll und die Wirksamkeit der Analyse der Bewegungsaktivität von C. elegans mit halbautomatischen Methoden zebraLab und WormScan in einem gut etablierten C. elegans-Modell für die mitochondriale Komplex-I-Krankheit, Gas-1(fc21) demonstriert. Gas-1 (K09A9.5-Gen) ist ein Ortholog des humanen NDUFS2 (NADH: Ubichinonoxidoreduktase-Kern (Eisen-Schwefel-Protein) Untereinheit 2) (Abbildung 3). Der mutierte C. elegans Gas-1(fc21) -Mutantenstamm trägt eine homozygote p.R290K-Missense-Mutation im menschlichen Ortholog von NDUFS250, was zu einer signifikant verminderten Fruchtbarkeit und Lebensdauer, einer beeinträchtigten oxidativen Phosphorylierungskapazität der Atmungskette (OXPHOS)51sowie einer verminderten mitochondrialen Masse und Membranpotenzial mit erhöhtem oxidativem Stress führt5,8 . Trotz seiner in den letzten zwei Jahrzehnten gut etablierten Verwendung zur Untersuchung mitochondrialer Erkrankungen wurde die motorische Aktivität von Gas-1 (fc21) -Mutanten bisher nicht berichtet. Hier wurden ZebraLab- und WormScan-Methoden eingesetzt, um die Bewegungsaktivität von Gas-1(fc21) im Vergleich zu Wildtyp-Würmern (WT, N2 Bristol) unabhängig zu quantifizieren, sowohl um die Methoden zu validieren als auch um ihren vergleichenden Nutzen und ihre Effizienz der experimentellen Protokolle und Informatikanalysen zu demonstrieren. Die ZebraLab-Software ermöglichte die schnelle Quantifizierung mehrerer gleichzeitiger Zustände der Wurmlokomotoraktivität in modellen der mitochondrialen Erkrankung von C. elegans mit potenzieller Anwendung für gezielte Arzneimittelscreening- oder Validierungsstudien. Insbesondere die WormScan-Analyse ist gut geeignet, um Schnelldurchsatz-Wirkstoff-Screens von Wirkstoffbibliotheken zu ermöglichen und Leads zu priorisieren, die die neuromuskuläre Funktion des Tieres und die Bewegungsaktivität in präklinischen C. elegans-Modellen primärer mitochondrialer Erkrankungen verbessern.

Protokoll

1. Analyse der Wurmlokomotoraktivität in flüssigen Medien auf Glasobjektträgern mit der ZebraLab-Software

  1. Nematodenwachstum und -handhabung
    1. Züchte C. elegans auf Petriplatten, die Nematodenwachstumsmedien (NGM) enthalten, und verteilen Sie sie mit Escherichia coli OP50 als Nahrungsquelle. Halten Sie die Wurmkultur bei 20 °C, wie zuvor beschrieben8.
    2. Synchronisieren Sie Würmer, die eine zeitisierte Eilage52 durchführen, und untersuchen Sie Würmer im gewünschten Stadium. In diesem Protokoll wurden L4-Würmer analysiert.
    3. Grow Control und mutierte Wurmstämme auf NGM-Platten mit und ohne zu testende medikamentöse Behandlungen oder Pufferkontrolle. Um die Wirkungen der medikamentösen Behandlung zu bewerten, bereiten Sie die gewünschte Arzneimittelbestandskonzentration in S. basaler Lösung vor; Verteilen Sie das berechnete spezifische Volumen auf die NGM-Platten und lassen Sie es trocknen. Übertragen Sie die Würmer in einem bestimmten Larven- oder Erwachsenenstadium und halten Sie sie vor der Analyse für die gewünschte Dauer auf der Medikamentbehandlungsplatte.
  2. Versuchsaufbau von Würmern zur Videoaufzeichnung der Bewegungsaktivität und ZebraLab-Analyse
    1. Wählen Sie 5 synchronisierte L4-Würmer pro Stamm und Zustand mit einem Wurmpick. Pipetten Sie einen einzelnen 20 μL-Tropfen S. basaler Lösung auf einen Glasträger, der sich unter einem Stereomikroskop befindet, das an eine Kamera angeschlossen ist, und übertragen Sie 5 Würmer hinein (Abbildung 1A, B). Die 5 Würmer aus der Petrischale, die NGM und E. coli OP50 enthält, werden erst im Moment vor der Aufnahme in den Flüssigkeitstropfen überführen.
      HINWEIS: Halten Sie die anderen Würmer auf der Petrischale aufrecht, bis das vorherige Video aufgezeichnet ist. Dadurch werden Schäden vermieden, die an den anderen Würmern durch das Austrocknen der 20 μl-Tropfen während des Eingriffs verursacht werden (Trockenzeit ~ 15-20 min).
    2. Pipette mehrere Tropfen auf einem Objektträger, um mehrere technische Replikate zu erhalten (Abbildung 1A). Wählen Sie Würmer aus verschiedenen NGM-Platten (biologische Replikation). Verwenden Sie keinen Deckelschein.
    3. Stellen Sie den Arbeitsabstand des Mikroskops ein, um die gesamte Fläche eines einzelnen Tropfens zu visualisieren. Stellen Sie eine niedrige Videoauflösung (<1024 x 768) ein und pflegen Sie sie, um die Dateien in die Software hochzuladen.
    4. Lassen Sie die Würmer vor der Aufnahme 1 Minute lang bei Raumtemperatur auf dem Objektträger akklimatisieren.
    5. Zeichnen Sie die Wurmschwimmaktivität in 1 Tropfen für 1 Minute bei 15 Bildern pro Sekunde (fps) auf. Wiederholen Sie die Bildgebung für jeden weiteren Tropfen auf der Platte.
  3. C. elegans Analyse der Bewegungsaktivität in der ZebraLab-Software
    1. Verwenden Sie die Option ZEBRALAB AVI, um Videos in die Software hochzuladen. Klicken Sie auf die Option Quantisierung mit AVI-Dateien (Abbildung 1C).
    2. Um ein neues Protokoll zu erstellen, wählen Sie Datei > Protokoll generierenaus, und fügen Sie dann die Anzahl der für die Analyse ausgewählten Bereiche hinzu. Wählen Sie Standortanzahl: 1.
    3. Öffnen Sie Protokollparameter und wählen Sie 1 Minute im Fenster Testdauer aus. Wählen Sie eine andere Versuchsdauer für unterschiedliche Versuchsdauern. Aktivieren oder deaktivieren Sie das Fenster Kein Zeitplatz und wählen Sie Integrationszeitraum, abhängig von der gewünschten Datenausgabe. In dieser Studie wurde No Time Bin ausgewählt ( Abbildung1D).
      HINWEIS: Time bin ist die Zeit, über die die Aktivität gemittelt wird.
    4. Wenn bereits ein Protokoll erstellt wurde, wählen Sie Protokoll öffnen und dann das gespeicherte Protokoll (im VTE-Format) aus.
    5. Wählen Sie Datei und Film öffnen, um jede einzelne Videodatei hochzuladen, die zuvor aufgezeichnet wurde.
    6. Wählen Sie das in Abbildung 1E angezeigte Symbol "Bereich" (schwarzer Pfeil) aus, um einen einzelnen Erkennungsbereich zu erstellen und einen Bereich um den gesamten Flüssigkeitstropfen zu erstellen, in dem sich Würmer befinden. Klicken Sie auf Auswählen, dann auf das grüne Kreissymbol (grauer Pfeil) unter Bereiche > Erstellen > Markierungen löschen.
      HINWEIS: Die Aktivität aller Würmer im definierten Tropfen wird im ausgewählten Bereich erkannt (Abbildung 1E, F).
    7. Wechseln Sie zu Kalibrierung > Zeichenskala (Abbildung 1E) und zeichnen Sie eine horizontale Linie von links nach rechts vom Videobereich. Geben Sie den tatsächlichen Abstand an, der kalibriert werden soll. Wählen Sie dann Auf Gruppe anwendenaus.
    8. Heben Sie die Auswahl des zum Erstellen des Bereichs ausgewählten Symbols auf (Pfeil in Abbildung 1E),und aktivieren oder deaktivieren Sie Transparent.
      HINWEIS: In dieser Studie wurde Transparent ausgewählt und lieferte bessere Ergebnisse.
    9. Passen Sie die Erkennungsempfindlichkeit und den Aktivitätsschwellenwert an, um die Erkennung aller verschiedenen analysierten C. elegans-Wurmstämme zu ermöglichen.
      HINWEIS: In diesem Experiment wurde die Erkennungsempfindlichkeit auf 8 mit Burst- und Freezing-Werten von 15 bzw. 2 eingestellt (Abbildung 1F).
    10. Stellen Sie die Anzeigeskala auf 70 ein, um die vom Tier während der Aktivitätsanalyse erstellte Spur zu visualisieren. Wählen Sie dann Auf Gruppe anwenden aus ( Abbildung1F).
    11. Klicken Sie auf Experiment > Ausführen > Speichern unterund dann auf Start. Ein Fenster wird geöffnet. Wählen Sie Möchten Sie die Videomedien mit maximaler Computergeschwindigkeit verarbeiten?, um das Video schnell zu analysieren (z. B. wird eine 1-minütige Videoaufzeichnung von der ZebraLab-Software in 5 s analysiert).
    12. Ein weiteres Fenster öffnet sich: Experiment ausführen; Klicken Sie auf Start, um mit dem Experiment fortzufahren.
    13. Nachdem die Videoaufzeichnung abgeschlossen ist, wird die Analyse angehalten. Klicken Sie auf Experiment > Stop. Dadurch wird die analysierte Aktivität aus einem einzigen Tropfen in einer Tabelle gespeichert.
    14. Wiederholen Sie die Analyse für jedes Video eines einzelnen Tropfens. Jeder Tropfen ist eine technische Replikation.
  4. Ausgabe und Analyse von ZebraLab-Daten
    HINWEIS: Nach dem Experiment werden die Daten aus jedem Video einzeln als separate Tabellen im ausgewählten Ordner gespeichert. In der Datenausgabedatei wird der integrierte Aktivitätsgrad aller Würmer, die sich in einem einzelnen Tropfen bewegen, als Pixeländerungen unter actinteg aufgezeichnet.
    1. Öffnen Sie jede Tabelle, die sie aus der Analyse jedes Videos erhalten hat. Kompilieren Sie sie manuell in eine einzige Datei.
      Normalisieren Sie die Mutanten- und Wildtypdaten auf einen Prozentsatz der Kontrolle. Hier wurden statistische Analysen durchgeführt, um das mittlere Aktivitätsniveau zwischen den Gruppen zu vergleichen.

2. Analyse der Wurmlokomotoraktivität in flüssigen Medien im 96-Well-Plattenformat durch WormScan-Softwareanalyse

  1. Nematodenwachstum und -handhabung
    1. Züchten Sie C. elegans wie in Abschnitt 1.1.1 beschrieben.
    2. Synchronisieren Sie Würmer wie in Abschnitt 1.1.2 beschrieben.
    3. Züchten Sie Würmer auf bestimmten Medien, wie in Abschnitt 1.1.3 beschrieben, bis zum L4-Stadium oder Tag 1 Erwachsenen.
  2. Versuchsaufbau von Würmern in 96-Well-Platte zur WormScan-Aktivitätsanalyse
    1. 50 μL mit 2 % Gewicht pro Volumen E. coli OP50 in flüssiger Suspension in S. basal medium zu jeder Vertiefung einer 96-Wellen-Mikroplatte mit klarem, flachem Boden, wie zuvor beschrieben49,53.
    2. Wählen Sie unter einem Stereomikroskop manuell 15 synchronisierte Würmer im L4-Stadium oder Tag 1 Erwachsenen von ihren NGM-Platten in flüssige Medien in jeder experimentellen Vertiefung der 96-Well-Mikroplatte. Lassen Sie die Würmer vor dem Scannen 20 Minuten lang an das flüssige Medium gewöhnen.
      HINWEIS: Andere Tierstadien und -alter können leicht für studienweise ersetzt werden.
  3. WormScan-Aktivitätsanalyse in 96-Well-Platte und Datenexport in Tabellenkalkulation.
    1. Scannen Sie jede 96-Well,klare, flache Boden-Mikroplatte zweimal nacheinander mit einem Standard-Flachbettscanner, mit weniger als 10 s zwischen den Scans.
      HINWEIS: Hier wurde der Fotoscanner mit einer Auflösung von 1.200 Punkten/In und 16-Bit-Graustufen verwendet, um JPEG-Bilder zu erzeugen. Der Zeitaufwand für das Scannen von vier 96-Well-Platten mit dem Fotoscanner beträgt weniger als 10 Minuten.
    2. Richten Sie die beiden sequenziellen Scans (Abbildung 2A) mit Open-Source-Software49 aus.
      HINWEIS: Die Software generiert ein Differenzbild, um Pixeländerungen zwischen den beiden aufeinanderfolgenden Bildern für einen interessenbereich(Abbildung 2B)und einen relativen WormScan-Scoreauszuwerten. Dieser WormScan-Score entspricht Änderungen der Reaktion des Bewegungsmotors basierend auf der vom Scanner erzeugten Lichtintensität, wenn er auf einen Pixelschwellenwert von 5 eingestellt ist (Abbildung 2C).
    3. Exportieren Sie die Daten aus WormScan als Tabelle. Speichern Sie die Tabelle mit den Daten auf dem lokalen Computer. Normalisieren Sie die Daten als Prozentsatz der Kontrolle (POC) und vergleichen Sie biologische Replikationsexperimente für verschiedene Mutanten- oder Behandlungsbedingungen. Führen Sie statistische Analysen durch, um Mutanten- und Kontrollmittel mit dem Schüler-t-Testzu vergleichen.

Ergebnisse

Die Analyse der Bewegungsaktivität von C. elegans in den flüssigen Medien könnte leicht einen integrierten Phänotyp von mitochondrialen Krankheitswurmmodellen erfassen, die auf festen Medien möglicherweise nicht leicht quantifizierbar sind. ZebraLab wurde verwendet, um die motorische Aktivität des gut etablierten mitochondrialen Komplexes I Krankheit Gas-1(fc21) Stamm relativ zu WT-Würmern in flüssigen Medien im L4-Larvenstadium zu quantifizieren. Die Aktivität von 5 Würmern in einem ...

Diskussion

Hier fasste die Studie detaillierte Informationen und Begründungen für die Untersuchung der neuromuskulären Aktivität von C. elegans auf der Ebene verschiedener Endpunkte zusammen, einschließlich Wurmschlagen, Fortbewegung, Pharynxpumpen und Chemotaxis. Der Vergleich von 16 verschiedenen Aktivitätsanalysemethoden wurde in Bezug auf den relativen Durchsatz, die Vorteile und die Grenzen der Quantifizierung von Nematodenaktivitäten in einer einzelnen Wurm- oder Wurmpopulation in unterschiedlichem Alter und e...

Offenlegungen

M.L., N.D.M., N.S. und E.N.-O. keine relevanten finanziellen Angaben machen. M.J.F. ist Mitbegründer von MitoCUREia, Inc., Mitglied des wissenschaftlichen Beirats mit Beteiligung an RiboNova, Inc. und wissenschaftliches Vorstandsmitglied als bezahlter Berater bei Khondrion und Larimar Therapeutics. M.J.F. war oder ist derzeit mit mehreren Unternehmen verbunden, die an der therapeutischen präklinischen und/oder klinischen Entwicklung von mitochondrialen Erkrankungen als bezahlter Berater beteiligt sind (Astellas [ehemals Mitobridge] Pharma Inc., Cyclerion Therapeutics, Epirium Bio, Imel Therapeutics, Minovia Therapeutics, NeuroVive, Reneo Therapeutics, Stealth BioTherapeutics, Zogenix, Inc.) und/oder ein gesponserter Forschungsmitarbeiter (AADI Therapeutics, Cardero Therapeutics, Cyclerion Therapeutics, Imel Therapeutics, Minovia Therapeutics Inc., Mission Therapeutics, NeuroVive, Raptor Therapeutics, REATA Inc., RiboNova Inc., Standigm Therapeutics und Stealth BioTherapeutics).

Danksagungen

Wir danken Anthony Rosner, PhD., mit seiner organisatorischen Unterstützung für die frühe Vorbereitung dieses Projekts und Erin Haus für ihren Beitrag zur Protokollanalyse. Diese Arbeit wurde vom Juliet's Cure FBXL4 Mitochondrial Disease Research Fund, dem Jaxson Flynt C12ORF65 Research Fund und den National Institutes of Health (R01-GM120762, R01-GM120762-08S1, R35-GM134863 und T32-NS007413) finanziert. Der Inhalt liegt allein in der Verantwortung der Autoren und stellt nicht unbedingt die offiziellen Ansichten der Geldgeber oder der National Institutes of Health dar.

Materialien

NameCompanyCatalog NumberComments
C. elegans wild isolate Caenorhabditis Genetics Center (CGC)N2 Bristol
CameraOlympusDP73
gas-1(fc-21)CGCCW152
Microscope slidesThermoFisher4951PLUS
Nematode Growth Medium (NGM)Research Products International Corp.N81800-1000.0
OP50 Escherichia coliCGCUracil auxotroph E. coli strain
Petri dishes (60 mm) VWR international25373-085
S. BasalVWR 5.85 g NaCl, 1 g K2 HPO4, 6 g KH2PO4, and 5 mg cholesterol, in 1 l H2OVWR 101175-162, 103467-156, EM1.09828.1000, 97061-660
ScannerEPSONV800
StereomicroscopeOlympusMVX10 microscope
96-well flat bottom VWR international29442-056
WormScan softwareMathew et al. 45S1 Standalone Java platformSoftware for automation of difference image of scanned plates
ZebraLab softwareViewPointSoftware for automated quantization and tracking of zebrafish behavior, designed by ViewPoint (http://www.viewpoint.fr/en/p/software/zebralab-zebrafish-behavior-screening) and here applied to C. elegans. This system is applicable for high-throughput behavioral analysis

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