JoVE Logo
Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • תוצאות
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

מחקר זה מציג פרוטוקולים עבור שתי גישות ניתוח פעילות לוקומוטור חצי אוטומטי ב C. elegans קומפלקס I מחלות גז-1(fc21) תולעים, כלומר, ZebraLab (בדיקת תפוקה בינונית) ו- WormScan (בדיקה בעלת תפוקה גבוהה) ומספקים ניתוח השוואתי בין מגוון רחב של שיטות מחקר לכימות התנהגות נמטודה ותפקוד עצבי שרירי משולב.

Abstract

Caenorhabditis elegans מוכר באופן נרחב עבור התועלת המרכזית שלה כמודל בעלי חיים תרגום לחקור ביעילות מנגנונים טיפולים של מחלות אנושיות מגוונות. תולעים מתאימות במיוחד למסכי תפוקה גבוהה של תפוקה גנטית ותרופות כדי לקבל תובנה עמוקה יותר על מטרות וטיפולים טיפוליים על ידי ניצול מחזור הפיתוח המהיר שלהם, גודל הגוזלים גדול, תוחלת חיים קצרה, שקיפות מיקרוסקופית, עלויות תחזוקה נמוכות, חבילה חזקה של כלים גנומיים, מאגרי מוטציות ומתודולוגיות ניסיוניות לחקור הן בפיזיולוגיה של vivo והן בפיזיולוגיה של ex vivo. פעילות לוקומוטור תולעת מייצגת פנוטיפ רלוונטי במיוחד כי הוא נפגע לעתים קרובות במחלה מיטוכונדריאלית, אשר הוא הטרוגניים מאוד בגורמים וביטויים אבל באופן קולקטיבי חולק יכולת לקויה לייצר אנרגיה תאית. בעוד שחבילת מתודולוגיות שונות עשויה לשמש לחקר התנהגות התולעת, אלה משתנות מאוד בעלויות ניסיוניות, מורכבות ושירות עבור מסכי תפוקה גנומיים או סמים. כאן הושוו התפוקה היחסית, היתרונות והמגבלות של 16 מתודולוגיות ניתוח פעילות שונות המכמתות קטר נמטודה, חבטות, שאיבת הלוע ו/או הכימוטקסיה באוכלוסיות תולעים בודדות או תולעים של C. elegans בשלבים, גילאים ומשכי ניסוי שונים. פרוטוקולים מפורטים הודגמו עבור שתי שיטות חצי אוטומטיות כדי לכמת פעילות locomotor נמטודה המייצגים יישומים חדשניים של כלי תוכנה זמינים, כלומר, ZebraLab (גישה תפוקה בינונית) ו- WormScan (גישה תפוקה גבוהה). נתונים מיישום שיטות אלה הדגימו דרגות דומות של פעילות בעלי חיים מופחתת התרחשו בשלב L4 זחל, והתקדמו ביום 1 מבוגרים, במחלה I קומפלקס מיטוכונדריאלי (גז-1(fc21)) תולעים מוטנטיות ביחס לסוג בר (N2 בריסטול) C. elegans. נתונים אלה מאמתים את השירות עבור יישומים חדשניים אלה של שימוש בכלי התוכנה ZebraLab או WormScan כדי לכמת פעילות לוקומוטור תולעת ביעילות ובאובייקטיביות, עם יכולת משתנה לתמוך בהקרנת תרופות בתפוקה גבוהה על התנהגות תולעים במודלים חייתיים פרה-חוליניים של מחלות מיטוכונדריאליות.

Introduction

Caenorhabiditis elegans מוכר באופן נרחב כמודל יוצא מן הכלל במדעי המוח המבוססים על כך שיש לו 302 נוירונים המתאמים את כל התנהגויות התולעת, כולל הזדווגות, האכלה, הטלת ביצים, צואה, שחייה וקטר על מדיה מוצקה1. נמטודות הרמפרודיטיות אלה משמשות גם הן להבנת מגוון רחב של מנגנוני מחלות אנושיות, המתאפשרות על ידי הגנום המאופיין היטב שלה והומולוגיה גבוהה של ~ 80% גנים בין C. elegans ובני אדם2,3,4. C. elegans שימשו זמן רב לחקור מחלה מיטוכונדריאלית אנושית5,6,7,8,9,10, שהיא קבוצה הטרוגנית גנטית ופנוטיפית מאוד של הפרעות מטבוליות תורשתיות החולקות יכולת לקויה לייצראנרגיהתאית ולעתים קרובות נוכחת קלינית עם תפקוד עצבי שרירי לקוי באופן משמעותי, חוסר סובלנות לפעילות גופנית ועייפות11 ,12,13,14. לכך, השימוש במודלים C. elegans מאפשר מידול פרה-אקליני של היבטים כמותיים של פעילות בעלי חיים ותפקוד עצבי-שרירי בתת-סוגים גנטיים שונים של מחלה מיטוכונדריאלית, כמו גם את תגובתם לטיפולים מועמדים שעשויים לשפר את תפקודם הנוירו-שרירי ואת הפעילות הכוללת שלהם.

פעילות עצבית-שרירית ב- C. elegans ניתנת למדידה אובייקטיבית על ידי מגוון מתודולוגיות ניסיוניות, כולל גישות ידניות והן גישות אוטומטיות למחצה המאפשרות ניתוחים פונקציונליים במדיה מוצקה או נוזלית (טבלה 1)1,15. כמות מדויקת של פעילות C. elegans הוכיחה חשיבות כדי לאפשר תגליות הקשורות לתפקוד ופיתוח של מערכת השרירים והעצבים16,17,18. מחקר זה מסכם ומשווה דרישות ניסיוניות, יתרונות ומגבלות של 17 בדיקות שונות שניתן לבצע במעבדות מחקר להערכת תפקוד ופעילות נוירו-שרירית בארבע תוצאות מרכזיות במודלים של מחלות C. elegans, הן בבסיס במגוון שלבים וגילאים התפתחותיים והן בתגובה על ניתוחי המועמדים (טבלה 1 ). ואכן, המחקר מספק סקירה מפורטת של מגוון הגישות הניסיוניות הזמינות לאפיון שיעורי החבטות של C. elegans (כיפופי גוף לדקה), פעילות לוקומוטור, שאיבת הלוע, וכימיה - בכל מקרה המציין את המתודולוגיה הניסיונית והאנליטית שבה נעשה שימוש, את היתרונות והמגבלות של כל שיטה, את הציוד והתוכנה הדרושים לביצוע ולנתח כל בדיקת ערך, ויכולת התפוקה של כל שיטה לתמיכה בשימוש בה למטרות הקרנה גנטית או סמים בעלת תפוקה גבוהה. קיבולת התפוקה של כל בדיקת אסאי מתוארת כנמוכה, בינונית או גבוהה בהתבסס על מורכבות הפרוטוקול הניסיוני, כולל תחזוקת תולעים, זמן עיבוד, שימוש בלוחות יחידים או רב-באריים ו/או זמן ההתנסות הדרוש להשלמת ההגדרה הניסיונית וניתוחי הנתונים.

ניתוחים ידניים שלחבטות 19, פעילות לוקומוטור20, שאיבת הלוע17,21, ו chemotaxis22,23 הם מתודולוגיות מבוססות היטב להערכת פעילות תולעת הדורשות סטריאומיקוסקופ24. בעוד מדידת פעילות חבטות של תולעים דורש ניתוח במדיה נוזלית כדי לקבוע את תדירות כיפופי הגוף לדקה, פעילות locomotor תולעת ניתן למדוד או על מדיה מוצקה או במדיה נוזלית. עם זאת, ניתוחים ידניים של פעילות תולעת בודדת גוזלים זמן מהדורת ומערבים הטיה בלתי נמנעת שנוצרה על ידי המשתמש. אוטומציה של ניתוחי פעילות תולעים ממזערת הטיה שנוצרה על ידי המשתמש ויכולה להגדיל מאוד את התפוקה הניסיונית25. הקלטות וידאו של פעילות חבטות תולעת במדיה נוזלית ניתן לנתח באמצעות wrMTrck, תוסף ImageJ26. עם זאת, ההגדרות הניסיוניות המקוריות שפותחו עבור wrMTrck הגבילו את השירות שלה, שכן תולעים רבות מדי בטיפת נוזל אחת הובילו לחפיפה של תולעים שהקשו על מעקב מדויק. בעוד מגבלה ניסיונית זו נפתרה27, שיטת wrMTrck אינה מסוגלת לתמוך הקרנה בתפוקה גבוהה.

קיימות מגוון שיטות לכימות פעילות לוקומוטור תולעת בבסיס ובתגובה טיפולים מועמדים במודלים של מחלות מיטוכונדריאליות C. elegans. אלה כוללים ZebraLab (ViewPoint מדעי החיים), מעקב Tierpsy28, פלטפורמת מעקב נמטודה רחבה של שדה הראייה (WF-NTP)29, WormMotel, WormWatcher30, WormLab31, צ'יפ אינפיניטי32, ו- WMicrotracker One33 (טבלה 1). שיטות אלה מאפשרות ניתוח בו-זמני של קטר בזני תולעים מרובים או בתנאים מרובים, בדרך כלל על לוחות מרובי בארות, ובכך תומכים ביישומי הקרנת סמים בעלי תפוקה גבוהה יותר. לחלק משיטות אלה יש שיקולים ייחודיים שעשויים להגביל או לשפר את השירות הכללי שלהן, כגון הצורך בציוד יקר לעומת תוכנה לגישה פתוחה, וקלות משתנה של ביצוע פרוטוקולים ניסיוניים. בסך הכל, אין מערכת ניסיונית אחת או פרוטוקול מתאים באופן אידיאלי לכל ניסויי פעילות locomotor C. elegans. במקום זאת, חשוב לבחור בקפידה איזו שיטה מתאימה ביותר למטרות ולדרישות הניסיוניות של החוקר הספציפי.

שאיבת הלוע מייצגת תוצאה חשובה נוספת להערכת הפעילות הנוירו-שרירית ב- C. elegans. הלוע C. elegans מורכב מ -20 תאי שריר, 20 נוירונים, ו -20 תאים אחרים המאפשרים בליעה של Escherichia coli (E. coli) בקצה האחורי של דרכי העלייה של התולעת34,35,36. מספר שיטות ידניות הוקמו כדי לקבוע את שיעורי שאיבת הלוע17,21,37,38. רוב השיטות מבוססות על שימוש סטריאומיקוסקופ ומצלמה לדמיין ולהקליט תדירות שאיבת הלוע עם ספירה ישירה על ידי הצופה הניסיוני21. ניתוח אוטומטי של קצב שאיבת הלוע אפשרי על ידי ביצוע הקלטה חוץ-תאית המכונה electropharyngeogram (EPG), המספקת מידע נוסף על משך כל משאבה39. ניתוח קצב שאיבת הלוע אפשרי גם במערכת מיקרופלואידית, WormSpa, שבה תולעים בודדות מוגבלות בתאים40,41. שיטה מסחרית הזמינה כדי להקל על ניתוח קצב משאבת הלוע היא מערכת ScreenChip (InVivo Biosystems), המודדת, מדמה ומנתחת את ההיבטים הנוירו-שריריים של התנהגות האכלה בתולעת אחת משותקת בשבב מותאם אישית. גישה זו של כמות שאיבה הלוע יכולה לשמש להערכת תגובות עצביות ופיזיולוגיות לתרופות, הזדקנות וגורמים אחרים42,43,44,45.

Chemotaxis מתאר את התנועה של C. elegans בתגובה ריח שהונח הרחק התולעים באזור מוגדר של צלחת מדיה צמיחה נמטודה (NGM). הערכת תגובת הכימוטקסיס מספקת מדד משולב של פעילות עצבית ונוירו-שרירית תולעת הניתנת לכימות על ידי התבוננות ומדידת המרחק הפיזי שעברו תולעים לכיוון הריח בפרק זמן מוגדר46. מעקב תולעים מרובות היא שיטה אוטומטית שניתן להשתמש בה כדי לשפר את היעילות הניסיונית של כימות המרחק שעברו תולעים לכיוון מושך או מדוחה47.

כאן, הפרוטוקול המפורט עבור שתי שיטות חדשניות, חצי אוטומטיות שנקבעו לכימות פעילות תולעת מתואר. הגישה הראשונה משתמשת ב-ZebraLab תוכנה מסחרית שפותחה במקור כדי לחקור את פעילות השחייה של דניו ריו (דג זברה), עבור יישום חדשני בעל תפוקה בינונית כדי לכמת את פעילות הלוקומוטור הכוללת במדיה נוזלית של C. elegans בהתבסס על שינויי פיקסלים במהלך התנועה(טבלה 1, איור 1). פלט נתונים מתקבל במהירות ממספר רב של תנאים ודגימות בו-זמנית המנותחים בשקופית זכוכית, אם כי שיטה זו אינה מתאימה לתבנית צלחת מרובת בארות. הגישה השנייה היא עיבוד חדשני למתודולוגיית WormScan48,49 (איור 2),המשתמש בסורק שטוח כדי ליצור תמונה דיפרנציאלית של שתי סריקות רציפות שניתן להשתמש בהן באופן שונה עם תוכנת קוד פתוח כדי לאפשר ניתוח כמותי אוטומטי למחצה של תוצאות פיזיולוגיות משולבות כגון פוריות והישרדות. כאן, עיבוד חדשני בעל תפוקה גבוהה למתודולוגיית WormScan כדי לכמת את פעילות לוקומוטור התולעת במדיה נוזלית באוכלוסיות של 15 תולעים בשלב זחל 4 (L4) לכל באר של צלחת שטוחה 96 היטב פותחה. מתודולוגיה זו של WormScan חצי אוטומטית ובעלות נמוכה זו יכולה להיות מותאמת בקלות למסכי סמים בעלי תפוקה גבוהה, כמו גם לנתחים של שלבים שונים של בעלי חיים וגילאי48,49.

כאן, הפרוטוקול והיעילות של ניתוח פעילות לוקומוטור C. elegans באמצעות זברהלאב ו- WormScan שיטות חצי אוטומטיות מודגמת במודל C. elegans מבוסס היטב עבור קומפלקס מיטוכונדריאלי I, גז-1(fc21). גז-1 (באנגלית: gas-1) הוא גן אורתולוגיה של NDUFS2 אנושי (NADH: ליבת אוקסידורדוקטאז אוביקינון) (חלבון ברזל-גופרית) 2)(איור 3). זן מוטציה C. elegans gas-1(fc21)נושא מוטציה של homozygous p.R290K באורתולוגיה האנושית של NDUFS250, מה שגורם לירידה משמעותית בפרוות ובתוחלת החיים, שרשרת זרחן חמצונית לקויה (OXPHOS)קיבולת 51, כמו גם ירידה במסה המיטוכונדריאלית ובפוטנציאל הממברנה עם לחץ חמצוני מוגבר5,8 . למרות השימוש המבוסס שלה בשני העשורים האחרונים כדי לחקור מחלות מיטוכונדריאליות, פעילות לוקומוטור של מוטציות גז-1(fc21)לא דווחה בעבר. כאן, זברהלאב ושיטות WormScan הוחלו כדי לכמת באופן עצמאי את פעילות locomotor של גז-1(fc21) בהשוואה תולעים מסוג פראי (WT, N2 בריסטול), הן כדרך לאמת את השיטות, כמו גם כדי להפגין את התועלת ההשוואתית שלהם ואת היעילות של פרוטוקולים ניסיוניים וניתוחים אינפורמטיקה. תוכנת ZebraLab אפשרה כמות מהירה של מספר תנאים בו-זמנית של פעילות לוקומוטור תולעת במודלים של מחלות מיטוכונדריאליות C. elegans, עם יישום פוטנציאלי לבדיקת תרופות ממוקדות או מחקרי אימות. ניתוח WormScan, בפרט, מתאים היטב כדי לאפשר בקלות מסכי סמים בעלי תפוקה גבוהה של ספריות מורכבות ולתעדף לידים המשפרים את התפקוד הנוירו-שרירי של בעלי החיים ואת פעילות הלוקומוטור במודלים פרה-קליניים C. elegans של מחלה מיטוכונדריאלית ראשונית.

Protocol

1. ניתוח פעילות לוקומוטור תולעת במדיה נוזלית על שקופיות זכוכית באמצעות תוכנת ZebraLab

  1. צמיחה וטיפול בנמטודה
    1. לגדל C. elegans על לוחות פטרי המכילים מדיה צמיחה נמטודה (NGM) ולהפיץ עם Escherichia coli OP50 כמקור מזון. שמור על תרבות התולעת ב 20 °C (50 °F), כפי שתואר בעבר8.
    2. סנכרן תולעים המבצעות ביצה מתוזמנת52 ולומד תולעים בשלב הרצוי. בפרוטוקול זה נותחו תולעי שלב L4.
    3. הגדל שליטה ותולעת מוטנטית זנים על לוחות NGM עם ובלי טיפולים תרופתיים להיבדק או בקרת חיץ. כדי להעריך את ההשפעות הטיפול התרוממתי, להכין את ריכוז מלאי התרופה הרצוי בפתרון S. basal; פזר את אמצעי האחסון הספציפי המחושב על לוחות ה-NGM ואפשר לו להתייבש. מעבירים את התולעים בשלב מסוים של זחל או מבוגר ושומרים על צלחת הטיפול התרופתי למשך הזמן הרצוי לפני הניתוח.
  2. מערך ניסיוני של תולעים להקלטת וידאו פעילות לוקומוטור וניתוח ZebraLab
    1. בחר 5 תולעי L4 מסונכרנות לכל מאמץ ומצב באמצעות בחירת תולעת. Pipette טיפה בודדת של 20 μL של פתרון בזאלי על מגלשת זכוכית הממוקמת מתחת סטרימוקוסקופ מחובר למצלמה ולהעביר 5 תולעים לתוכו(איור 1A,B). העבר את 5 התולעים מצלחת פטרי המכילה NGM ו- E. coli OP50 לירידה הנוזלית רק ברגע שקדם להקלטה.
      הערה: המשך לתחזק את התולעים האחרות על צלחת פטרי עד שהסרטון הקודם יוקלט. זה ימנע את הנזק שנגרם על התולעים האחרות עקב התייבשות של 20 טיפות μl במהלך ההליך (זמן יבש ~ 15-20 דקות).
    2. Pipette טיפות מרובות בשקופית אחת כדי להשיג שכפולים טכניים מרובים(איור 1A). בחר תולעים מלוחות גז טבעי נוזלי שונים (שכפול ביולוגי). אין להשתמש בתלוש כיסוי.
    3. התאם את מרחק העבודה של המיקרוסקופ כדי להציג באופן חזותי את האזור המלא של טיפה אחת. הגדר וחזק רזולוציית וידאו נמוכה (<1024 x 768) כדי להעלות את הקבצים בתוכנה.
    4. אפשר לתולעים להתאקלם בשקופית בטמפרטורת החדר למשך דקה אחת לפני ההקלטה.
    5. תיעד את פעילות השחייה של התולעת בטיפה אחת למשך דקה אחת ב-15 פריימים לשנייה (fps). חזור על ההדמיה עבור כל טיפה נוספת על הצלחת.
  3. ג. elegans locomotor פעילות הקלטה ניתוח בתוכנת ZebraLab
    1. השתמש באפשרות ZEBRALAB AVI כדי להעלות קטעי וידאו לתוכנה. לחץ על האפשרות כימות עם קבצי AVI (איור 1C).
    2. כדי ליצור פרוטוקול חדש, בחר קובץ > צור פרוטוקולולאחר מכן הוסף את מספר האזורים שנבחרו עבור הניתוח. בחר ספירת מיקומים: 1.
    3. פתחו את פרמטרי הפרוטוקול ובחרו דקה אחת בחלון משך ניסוי. בחר משך ניסיוני שונה עבור משכי זמן ניסיוניים שונים. בחרו או בטלו את הבחירה בחלון ללא סל זמן ובחרו 'תקופת שילוב', בהתאם לפלט הנתונים הרצוי. במחקר זה לא נבחר סל זמן ( איור1D).
      הערה: סל הזמן הוא הזמן שבו הפעילות תהיה ממוצעת.
    4. אם כבר נוצר פרוטוקול, בחר פתח פרוטוקול ובחר את הפרוטוקול שנשמר (בתבנית .vte).
    5. בחר קובץ ופתח סרט כדי להעלות כל קובץ וידאו בודד שהוקלט בעבר.
    6. בחר בסמל אזור המצוין באיור 1E (חץ שחור) כדי לבנות אזור זיהוי יחיד וליצור אזור סביב טיפת הנוזל כולה שבה ממוקמות תולעים. לחץ על בחרולאחר מכן על סמל העיגול הירוק (חץ אפור) תחת אזורים > בנה > סימוני נקה.
      הערה: הפעילות של כל התולעים בטיפה המוגדרת תזוהה באזור שנבחר(איור 1E,F).
    7. עבור אל קנה מידה של ציור > צייר ( איור1E) וצייר קו אופקי משמאל לימין אזור הווידאו. ציין את המרחק האמיתי לכיול. לאחר מכן בחר החל על קבוצה.
    8. בטלו את הבחירה בסמל שנבחר לבניית האזור (חץ באיור 1E) ובחרו או בטלו את הבחירה באפשרות 'שקוף'.
      הערה: במחקר זה, שקוף נבחר ונתן תוצאות טובות יותר.
    9. התאם רגישות לזיהוי וסף פעילות כדי לאפשר זיהוי של כל זני תולעת C. elegans השונים שנותחו.
      הערה: בניסוי זה, רגישות הזיהוי נקבעה על 8 עם ערכי פרץ והקפאה של 15 ו- 2, בהתאמה (איור 1F).
    10. הגדר את קנה מידה תצוגה ב- 70 כדי לדמיין את המסלול שנעשה על-ידי החיה בזמן ניתוח הפעילות מתבצע. לאחר מכן בחר החל על קבוצה ( איור1F).
    11. לחץ על > התנסות > שמור בשםולאחר מכן התחל. נפתח חלון. בחר האם ברצונך לעבד את מדיית הווידאו במהירות מחשב מקסימלית? כדי לנתח את הווידאו במהירות (למשל, הקלטת וידאו של דקה אחת מנותחת על ידי תוכנת ZebraLab ב- 5 שניות).
    12. נפתח חלון נוסף: ניסוי ריצה; לחץ על התחל כדי להמשיך בניסוי.
    13. לאחר השלמת הקלטת הווידאו, הניתוח נפסק. לחץ על ניסוי > עצור. פעולה זו שומרת את הפעילות המנותחת מטיפה בודדת בגיליון אלקטרוני.
    14. חזור על הניתוח עבור כל סרטון של טיפה בודדת. כל טיפה היא שכפול טכני אחד.
  4. פלט וניתוח של נתוני ZebraLab
    הערה: לאחר הניסוי, נתונים מכל סרטון נשמרים בנפרד כגליונות אלקטרוניים נפרדים בתיקיה שנבחרה. בקובץ פלט הנתונים, רמת הפעילות המשולבת של כל התולעים הנעות בטיפה בודדת נרשמת כאשר פיקסל משתנה תחת actinteg.
    1. פתח כל גיליון אלקטרוני המתקבל מהניתוח של כל סרטון. בצע הידור ידני לקובץ יחיד.
      לנרמל את מוטציה ונתונים מסוג פראי לאחוז של שליטה. כאן בוצעו ניתוחים סטטיסטיים כדי להשוות בין קבוצות רמות פעילות ממוצעות.

2. ניתוח פעילות לוקומוטור תולעת במדיה נוזלית בפורמט צלחת 96-well על ידי ניתוח תוכנה WormScan

  1. צמיחה וטיפול בנמטודה
    1. לגדל C. elegans כמתואר בסעיף 1.1.1.
    2. סנכרן תולעים כמתואר בסעיף 1.1.2.
    3. לגדל תולעים על מדיה ספציפית כמתואר בסעיף 1.1.3 עד שלב L4 או יום 1 מבוגר.
  2. מערך ניסיוני של תולעים בצלחת 96-באר לניתוח פעילות WormScan
    1. הוסף 50 μL של 2% משקל לכל נפח של E. coli OP50 במתלים נוזליים ב S. basal בינוני לכל באר של 96-טוב, ברור, שטוח התחתון, microplate, כפי שתואר בעבר49,53.
    2. תחת סטריאומיקוסקופ, בחר באופן ידני 15 תולעים מסונכרנות בשלב L4 או יום אחד מבוגר אחד מלוחות הגז הטבעי הטבעי שלהם למדיה נוזלית בתוך כל באר ניסיונית של המיקרו-לוח 96-well. אפשר לתולעים להתאקלם למדיה הנוזלית למשך 20 דקות לפני הסריקה.
      הערה: ניתן להחליף בקלות את השלבים והגילאים של בעלי החיים במחקר.
  3. ניתוח פעילות סריקת תולעת בצלחת 96-באר וייצוא נתונים לגיליון אלקטרוני.
    1. סרוק כל 96 טוב, ברור, שטוח תחתון, microplate פעמיים ברצף באמצעות סורק שטוח סטנדרטי, עם פחות מ -10 s בין סריקות.
      הערה: כאן, סורק התמונות ברזולוציה של 1,200 נקודות/in וגווני אפור של 16 סיביות שימש להפקת תמונות jpeg. הזמן הנדרש לסריקת ארבע צלחות 96 בארות באמצעות סורק התמונות הוא פחות מ -10 דקות.
    2. ישר את שתי הסריקות הרציף (איור 2A) באמצעות תוכנת קוד פתוח49.
      הערה: התוכנה יוצרת תמונת הבדל כדי להעריך את שינויי הפיקסלים בין שתי התמונות הרצופות עבור אזור מעניין (איור 2B) לבין ציון WormScanיחסי. ציון WormScan זה שקול לשינויים בתגובת הלוקומוטור בהתבסס על עוצמת האור המיוצרת על-ידי הסורק כאשר הוא מוגדר לסף פיקסלים של 5 (איור 2C).
    3. יצא את הנתונים מ- WormScan כגליונות אלקטרוניים. שמור את הגיליון האלקטרוני המכיל את הנתונים במחשב המקומי. לנרמל את הנתונים כאחוז שליטה (POC) ולהשוות על פני ניסויים שכפול ביולוגי עבור מוטציה מגוונת או תנאי טיפול. בצע ניתוח סטטיסטי כדי להשוות מוטציה ושליטה פירושו באמצעות סטודנט t-test.

תוצאות

ניתוח של פעילות locomotor C. elegans בתקשורת הנוזלית יכול בקלות ללכוד פנוטיפ משולב של מודלים תולעת מחלה מיטוכונדריאלית כי לא ניתן לכמת בקלות על מדיה מוצקה. ZebraLab שימשה לכימות פעילות לוקומוטור של קומפלקס המיטוכונדריאלי מבוסס I disease gas-1(fc21) ביחס לתולעי WT במדיה נוזלית בשלב הזחל L4. הפעילות...

Discussion

כאן, המחקר סיכם מידע מפורט ורציונלים לחקר הפעילות הנוירו-שרירית C. elegans ברמה של תוצאות מגוונות, כולל חבטות תולעים, קטר, שאיבת הלוע וכימוטקסיס. ההשוואה בין 16 מתודולוגיות שונות לניתוח פעילות בוצעה במונחים של התפוקה היחסית, היתרונות והמגבלות של כימות פעילויות נמטודה באוכלוסיות תולעת או ת...

Disclosures

מ.ל., נ.ד.M, נ.ס. וא.נ.ו. אין גילויים פיננסיים רלוונטיים. M.J.F. הוא מייסד שותף של MitoCUREia, Inc., חבר הוועדה המדעית המייעצת עם עניין ההון העצמי RiboNova, Inc. וחבר דירקטוריון מדעי כיועץ בתשלום עם Khondrion, ו Larimar Therapeutics. M.J.F. היה או עוסק כיום עם מספר חברות המעורבות במחלות מיטוכונדריאליות פיתוח פרה-קליני ו/או קליני כיועץ בתשלום (Astellas [לשעבר Mitobridge] פארמה בע"מ, רכיבה על אופניים טיפוליים, אפיריום ביו, Imel Therapeutics, מינוביה תרפיוטיקס, NeuroVive, Reneo Therapeutics, BioTherapeutics התגנבות, Zogenix, Inc. ) ו / או משתף פעולה מחקר ממומן (AADI Therapeutics, קרדרו טיפולית, Cyclerion Therapeutics, Imel Therapeutics, מינוביה תרפיוטיקס בע"מ, טיפולי משימה, NeuroVive, Raptor Therapeutics, REATA Inc., RiboNova Inc., Standigm Therapeutics, וביותרפוטיקה התגנבות).

Acknowledgements

אנו מודים לאנתוני רוזנר, PhD, על תמיכתו הארגונית בהכנה המוקדמת של פרויקט זה, ולארין האוס על תרומתה לניתוח פרוטוקולים. עבודה זו מומנה על ידי הקרן לחקר מחלות מיטוכונדריאליות של ג'וליה FBXL4, קרן המחקר ג'אקסון פלינט C12ORF65, ומכוני הבריאות הלאומיים (R01-GM120762, R01-GM120762-08S1, R35-GM134863 ו- T32-NS007413). התוכן הוא באחריות המחברים בלבד ואינו מייצג בהכרח את הדעות הרשמיות של המממנים או המכונים הלאומיים לבריאות.

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
C. elegans wild isolate Caenorhabditis Genetics Center (CGC)N2 Bristol
CameraOlympusDP73
gas-1(fc-21)CGCCW152
Microscope slidesThermoFisher4951PLUS
Nematode Growth Medium (NGM)Research Products International Corp.N81800-1000.0
OP50 Escherichia coliCGCUracil auxotroph E. coli strain
Petri dishes (60 mm) VWR international25373-085
S. BasalVWR 5.85 g NaCl, 1 g K2 HPO4, 6 g KH2PO4, and 5 mg cholesterol, in 1 l H2OVWR 101175-162, 103467-156, EM1.09828.1000, 97061-660
ScannerEPSONV800
StereomicroscopeOlympusMVX10 microscope
96-well flat bottom VWR international29442-056
WormScan softwareMathew et al. 45S1 Standalone Java platformSoftware for automation of difference image of scanned plates
ZebraLab softwareViewPointSoftware for automated quantization and tracking of zebrafish behavior, designed by ViewPoint (http://www.viewpoint.fr/en/p/software/zebralab-zebrafish-behavior-screening) and here applied to C. elegans. This system is applicable for high-throughput behavioral analysis

References

  1. Husson, S. J., Costa, W. S., Schmitt, C., Gottschalk, A. Keeping track of worm trackers. WormBook. , 1-17 (2013).
  2. Shaye, D. D., Greenwald, I. OrthoList: a compendium of C. elegans genes with human orthologs. PLoS One. 6 (5), 20085 (2011).
  3. van Ham, T. J., et al. C. elegans model identifies genetic modifiers of alpha-synuclein inclusion formation during aging. PLoS Genetics. 4 (3), 1000027 (2008).
  4. Kim, W., Underwood, R. S., Greenwald, I., Shaye, D. D. OrthoList 2: A new comparative genomic analysis of human and Caenorhabditis elegans genes. Genetics. 210 (2), 445-461 (2018).
  5. Dingley, S., et al. Mitochondrial respiratory chain dysfunction variably increases oxidant stress in Caenorhabditis elegans. Mitochondrion. 10 (2), 125-136 (2010).
  6. Polyak, E., Zhang, Z., Falk, M. J. Molecular profiling of mitochondrial dysfunction in Caenorhabditis elegans. Methods in Molecular Biology. 837, 241-255 (2012).
  7. McCormick, E., Place, E., Falk, M. J. Molecular genetic testing for mitochondrial disease: from one generation to the next. Neurotherapeutics. 10 (2), 251-261 (2013).
  8. McCormack, S., et al. Pharmacologic targeting of sirtuin and PPAR signaling improves longevity and mitochondrial physiology in respiratory chain complex I mutant Caenorhabditis elegans. Mitochondrion. 22, 45-59 (2015).
  9. Polyak, E., et al. N-acetylcysteine and vitamin E rescue animal longevity and cellular oxidative stress in pre-clinical models of mitochondrial complex I disease. Molecular Genetics and Metabolism. 123 (4), 449-462 (2018).
  10. Guha, S., et al. Pre-clinical evaluation of cysteamine bitartrate as a therapeutic agent for mitochondrial respiratory chain disease. Human Molecular Genetics. 28 (11), 1837-1852 (2019).
  11. Gorman, G. S., et al. Prevalence of nuclear and mitochondrial DNA mutations related to adult mitochondrial disease. Annals of Neurology. 77 (5), 753-759 (2015).
  12. Mancuso, M., Orsucci, D., Filosto, M., Simoncini, C., Siciliano, G. Drugs and mitochondrial diseases: 40 queries and answers. Expert Opinion on Pharmacotherapy. 13 (4), 527-543 (2012).
  13. Gai, X., et al. Mutations in FBXL4, encoding a mitochondrial protein, cause early-onset mitochondrial encephalomyopathy. American Journal of Human Genetics. 93 (3), 482-495 (2013).
  14. Dillin, A., et al. Rates of behavior and aging specified by mitochondrial function during development. Science. 298 (5602), 2398-2401 (2002).
  15. Yemini, E., Jucikas, T., Grundy, L. J., Brown, A. E., Schafer, W. R. A database of Caenorhabditis elegans behavioral phenotypes. Nature Methods. 10 (9), 877-879 (2013).
  16. Bargmann, C. I., Avery, L. Laser killing of cells in Caenorhabditis elegans. Methods in Cell Biology. 48, 225-250 (1995).
  17. Avery, L., Horvitz, H. R. Effects of starvation and neuroactive drugs on feeding in Caenorhabditis elegans. Journal of Experimental Zoology. 253 (3), 263-270 (1990).
  18. Chalfie, M., et al. The neural circuit for touch sensitivity in Caenorhabditis elegans. Journal of Neuroscience. 5 (4), 956-964 (1985).
  19. Ghosh, R., Emmons, S. W. Episodic swimming behavior in the nematode C. elegans. Journal of Experimental Biology. 211 (23), 3703-3711 (2008).
  20. Rankin, C. H., Beck, C. D., Chiba, C. M. Caenorhabditis elegans: a new model system for the study of learning and memory. Behavioural Brain Research. 37 (1), 89-92 (1990).
  21. Avery, L. Motor neuron M3 controls pharyngeal muscle relaxation timing in Caenorhabditis elegans. Journal of Experimental Zoology. 175, 283-297 (1993).
  22. Ward, S. Chemotaxis by the nematode Caenorhabditis elegans: identification of attractants and analysis of the response by use of mutants. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 70 (3), 817-821 (1973).
  23. Bargmann, C. I., Thomas, J. H., Horvitz, H. R. Chemosensory cell function in the behavior and development of Caenorhabditis elegans. Cold Spring Harbor Symposia on Quantitative Biology. 55, 529-538 (1990).
  24. Anne, C. H. Behavior. WormBook: The Online Review of C. elegans Biology. 2005-2018, (2006).
  25. Biston, M. C., et al. An objective method to measure cell survival by computer-assisted image processing of numeric images of Petri dishes. Physics in Medicine & Biology. 48 (11), 1551-1563 (2003).
  26. Nussbaum-Krammer, C. I., Neto, M. F., Brielmann, R. M., Pedersen, J. S., Morimoto, R. I. Investigating the spreading and toxicity of prion-like proteins using the metazoan model organism C. elegans. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (95), e52321 (2015).
  27. Shi, W., Qin, J., Ye, N., Lin, B. Droplet-based microfluidic system for individual Caenorhabditis elegans assay. Lab on a Chip. 8 (9), 1432-1435 (2008).
  28. Javer, A., et al. An open-source platform for analyzing and sharing worm-behavior data. Nature Methods. 15 (9), 645-646 (2018).
  29. Koopman, M., et al. Assessing motor-related phenotypes of Caenorhabditis elegans with the wide field-of-view nematode tracking platform. Nature Protocols. 15 (6), 2071-2106 (2020).
  30. Churgin, M. A., et al. Longitudinal imaging of Caenorhabditis elegans in a microfabricated device reveals variation in behavioral decline during aging. eLife. 6, 26652 (2017).
  31. Angstman, N. B., Kiessling, M. C., Frank, H. G., Schmitz, C. High interindividual variability in dose-dependent reduction in speed of movement after exposing C. elegans to shock waves. Frontiers in Behavioral Neuroscience. 9, 12 (2015).
  32. Rahman, M., et al. NemaLife chip: a micropillar-based microfluidic culture device optimized for aging studies in crawling C. elegans. Scientific Reports. 10 (1), 16190 (2020).
  33. Bianchi, J. I., Stockert, J. C., Buzzi, L. I., Blazquez-Castro, A., Simonetta, S. H. Reliable screening of dye phototoxicity by using a Caenorhabditis elegans fast bioassay. PLoS One. 10 (6), 0128898 (2015).
  34. Albertson, D. G., Thomson, J. N. The pharynx of Caenorhabditis elegans. Philososophical Transactions of the Royal Society of London. Series B, Biological Sciences. 275 (938), 299-325 (1976).
  35. Raizen, D. M., Avery, L. Electrical activity and behavior in the pharynx of Caenorhabditis elegans. Neuron. 12 (3), 483-495 (1994).
  36. Avery, L., You, Y. J. C. elegans feeding. WormBook. , 1-23 (2012).
  37. Morck, C., Rauthan, M., Wagberg, F., Pilon, M. pha-2 encodes the C. elegans ortholog of the homeodomain protein HEX and is required for the formation of the pharyngeal isthmus. Developmental Biology. 272 (2), 403-418 (2004).
  38. Song, B. M., Avery, L. Serotonin activates overall feeding by activating two separate neural pathways in Caenorhabditis elegans. TheJournal of Neuroscience. 32 (6), 1920-1931 (2012).
  39. Avery, L., Raizen, D., Lockery, S. Electrophysiological methods. Methods in Cell Biology. 48, 251-269 (1995).
  40. Kopito, R. B., Levine, E. Durable spatiotemporal surveillance of Caenorhabditis elegans response to environmental cues. Lab in a Chip. 14 (4), 764-770 (2014).
  41. Lee, K. S., et al. Serotonin-dependent kinetics of feeding bursts underlie a graded response to food availability in C. elegans. Nature Communications. 8, 14221 (2017).
  42. Brinkmann, V., Ale-Agha, N., Haendeler, J., Ventura, N. The Aryl Hydrocarbon Receptor (AhR) in the aging process: Another puzzling role for this highly conserved transcription factor. Frontiers in Physiology. 10, 1561 (2019).
  43. Huang, C., et al. Intrinsically aggregation-prone proteins form amyloid-like aggregates and contribute to tissue aging in Caenorhabditis elegans. eLife. 8, 43059 (2019).
  44. Zhu, B., et al. Functional analysis of epilepsy-associated variants in STXBP1/Munc18-1 using humanized Caenorhabditis elegans. Epilepsia. 61 (4), 810-821 (2020).
  45. Weeks, J. C., Robinson, K. J., Lockery, S. R., Roberts, W. M. Anthelmintic drug actions in resistant and susceptible C. elegans revealed by electrophysiological recordings in a multichannel microfluidic device. International Journal of Parasitology. Drugs and Drug Resistance. 8 (3), 607-628 (2018).
  46. Haroon, S., et al. Multiple molecular mechanisms rescue mtDNA disease in C. elegans. Cell Reports. 22 (12), 3115-3125 (2018).
  47. Swierczek, N. A., Giles, A. C., Rankin, C. H., Kerr, R. A. High-throughput behavioral analysis in C. elegans. Nature Methods. 8 (7), 592-598 (2011).
  48. Mathew, M. D., Mathew, N. D., Ebert, P. R. WormScan: a technique for high-throughput phenotypic analysis of Caenorhabditis elegans. PLoS One. 7 (3), 33483 (2012).
  49. Mathew, M. D., et al. Using C. elegans forward and reverse genetics to identify new compounds with anthelmintic activity. PLoS Neglected Tropical Diseases. 10 (10), 0005058 (2016).
  50. Kayser, E. B., Morgan, P. G., Hoppel, C. L., Sedensky, M. M. Mitochondrial expression and function of GAS-1 in Caenorhabditis elegans. Journal Biological Chemistry. 276 (23), 20551-20558 (2001).
  51. Falk, M. J., Kayser, E. B., Morgan, P. G., Sedensky, M. M. Mitochondrial complex I function modulates volatile anesthetic sensitivity in C. elegans. Current Biology. 16 (16), 1641-1645 (2006).
  52. Kwon, Y. J., Guha, S., Tuluc, F., Falk, M. J. High-throughput BioSorter quantification of relative mitochondrial content and membrane potential in living Caenorhabditis elegans. Mitochondrion. 40, 42-50 (2018).
  53. Hirsh, D., Oppenheim, D., Klass, M. Development of the reproductive system of Caenorhabditis elegans. Developmental Biology. 49 (1), 200-219 (1976).
  54. Steele, W. B., Mole, R. A., Brooks, B. W. Experimental protocol for examining behavioral response profiles in larval fish: Application to the Neuro-stimulant caffeine. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (137), e57938 (2018).
  55. Carlsson, G., Blomberg, M., Pohl, J., Orn, S. Swimming activity in zebrafish larvae exposed to veterinary antiparasitic pharmaceuticals. Environmental Toxicology and Pharmacology. 63, 74-77 (2018).
  56. Yang, X., et al. High-throughput screening in larval zebrafish identifies novel potent sedative-hypnotics. Anesthesiology. 129 (3), 459-476 (2018).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

170C elegansZebraLabWormScangas 1 fc21

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved