تحديد مجموع الدهون والدهون الطبقات في العينات البحرية

C. C. Parrish; J. S. Wells

doi:10.3791/62315

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

Summary

هذا البروتوكول هو لتحديد الدهون في مياه البحر والعينات البيولوجية. يتم استخراج الدهون في الخيوط مع الكلوروفورم أو خليط من الكلوروفورم والميثانول في حالة المواد الصلبة. يتم قياس فئات الدهون بواسطة الكروماتوغرافيا رقيقة الطبقة قضيب مع الكشف عن تأين اللهب ومجموعها يعطي محتوى الدهون الكلي.

Abstract

تتكون الدهون إلى حد كبير من الكربون والهيدروجين ، وبالتالي ، توفر طاقة محددة أكبر من الجزيئات العضوية الأخرى في البحر. وبما أنها غنية بالكربون والهيدروجين، فإنها أيضا كارهة للماء ويمكن أن تعمل كمذيب وحامل امتصاص للملوثات العضوية، وبالتالي يمكن أن تكون محركات للتراكم البيولوجي الملوث في النظم الإيكولوجية البحرية. وتسهل طبيعتها الكارهة للماء عزلها عن مياه البحر أو العينات البيولوجية: يبدأ تحليل الدهون البحرية بأخذ العينات ثم استخراج المذيبات العضوية غير القطبية، مما يوفر طريقة مريحة لفصلها عن المواد الأخرى في مصفوفة مائية.

وإذا تم أخذ عينات من مياه البحر، فإن الخطوة الأولى تنطوي عادة على الانفصال إلى فصائل "مذابة" و"جسيمات" محددة من الناحية التشغيلية عن طريق الترشيح. يتم جمع العينات وعزل الدهون من مصفوفة العينة عادة مع الكلوروفورم للمادة الذائبة حقا والغرويات، ومع خليط من الكلوروفورم والميثانول لالمواد الصلبة والعينات البيولوجية. وقد تحتوي هذه المستخلصات على عدة فئات من مصادر بيولوجية واصطناعية المنشأ. في هذا الوقت، يمكن تحديد مجموع الدهون ودروس الدهون. يمكن قياس مجموع الدهون من خلال تلخيص فئات الدهون المحددة بشكل فردي والتي تم فصلها عادة كروماتوغرافيا. يستخدم كروماتوغرافيا الطبقة الرقيقة (TLC) مع الكشف عن تأين اللهب (FID) بانتظام للتحليل الكمي للدهون من العينات البحرية. TLC-FID يقدم معلومات فئة الدهون الشاملة، و، من خلال تلخيص الطبقات، وقياس الدهون الكلي.

معلومات فئة الدهون مفيدة بشكل خاص عند دمجها مع قياسات المكونات الفردية مثل الأحماض الدهنية و / أو الستيرولات ، بعد إطلاقها من مقتطفات الدهون. وتعني المجموعة الواسعة من هياكل ووظائف الدهون أنها تستخدم على نطاق واسع في البحوث الإيكولوجية والبيوكيميائية التي تقيم صحة النظم الإيكولوجية ودرجة التأثير الناجم عن الآثار البشرية المنشأ. وقد استخدمت لقياس المواد ذات القيمة الغذائية للحيوانات البحرية (مثل الزوافد المائية و/أو الفريسة)، وكمؤشرات على نوعية المياه (مثل الهيدروكربونات).

Introduction

وتتعلق الأساليب الموصوفة هنا بالمواد التي تعرف من الناحية التشغيلية بأنها دهون بحرية. ويستند هذا التعريف على قابليتها لاستخراج السائل السائل في المذيبات العضوية غير القطبية، ويوفر طريقة مريحة لفصلها عن المواد الأخرى في مصفوفة المائية. وتسهل طبيعتها الكارهة للماء عزلها عن مياه البحر أو العينات البيولوجية، فضلا عن تخصيبها، وإزالة الأملاح والبروتينات.

كان قياس محتوى الدهون وتكوينها في الكائنات البحرية محل اهتمام كبير في إيكولوجيا الشبكة الغذائية، وتغذية الاستزراع المائي، وعلوم الغذاء لعقود. الدهون هي مكونات عالمية في الكائنات الحية ، وتعمل كجزيئات أساسية في أغشية الخلايا ، كمصادر رئيسية للطاقة المتاحة بيولوجيا ، وتوفير العزل الحراري والطفو ، وتعمل كجزيئات إشارة. وعلى الرغم من أن إجراءات تحديد الدهون في المجالات الأخرى قد وصفت وصفا جيدا، فإن استخدامها مع العينات البحرية يستلزم عادة تعديلا للتكيف مع الظروف الميدانية وكذلك للعينة من النوع^1.

بالنسبة لعينات مياه البحر، تتطلب الخطوة الأولى عادة الفصل إلى الكسور "المذابة" و"الجسيمية" المحددة من الناحية التشغيلية، عادة عن طريق الترشيح (الخطوة 1 من البروتوكول). الجسيمات كسر ما يتم الاحتفاظ بها من قبل مرشح، وحجم المسام مهم في تحديد قطع². وفي كثير من الأحيان، عندما نقوم بأخذ عينات من الجسيمات، نود أن نربط تركيزات الدهون بمجموع تركيزات الكتلة، وفي هذه الحالة يجب أخذ عينة منفصلة أصغر حجما (على سبيل المثال، 10 مل) لهذا الغرض (ملاحظة الخطوة 1 من البروتوكول). للحصول على تحديد كتلة دقيقة من المهم إضافة الأمونيوم formate (35 غرام / لتر) في نهاية الترشيح.

وينبغي أن يصل معدل نسبة مياه البحر من العينة الأكبر إلى ما بين 250 مل و1 لتر حسب نوع العينة ويخضع لاستخراج السائل السائل في قمع فاصل (الخطوة 2 من البروتوكول). الطبيعة الكارهة للماء من الدهون يعني أنها يمكن فصلها عن المركبات الأخرى عن طريق استخراج في المذيبات غير القطبية مثل الكلوروفورم. يتم إنشاء نظام من طبقتين حيث تقسم الدهون إلى الطبقة العضوية بينما تبقى المكونات القابلة للذوبان في الماء في الطبقة المائية.

يتم استخراج عينات الجسيمات على مرشح، أو العينات البيولوجية مع تعديل Folch وآخرون استخراج^3،التي تنطوي أيضا على الكلوروفورم (البروتوكول الخطوة 3). مرة أخرى ، يتم إنشاء نظام عضوي / مائي حيث تقسم الدهون إلى المرحلة العضوية ، في حين تبقى الجزيئات القابلة للذوبان في الماء في المرحلة المائية ، ويتم التعجيل بالبروتينات. في الواقع، بالنسبة لالمواد الصلبة، تستخدم معظم المختبرات بعض الاختلاف في إجراء Folch et al. extraction³ الذي يتضمن الكلوروفورم والميثانول. بالنسبة للمرشحات، فإن الخطوة الأولى هي التجانس في 2 مل من الكلوروفورم و1 مل من الميثانول.

أثناء الاستخراج ، يجب توخي الحذر لحماية الدهون من التعديل الكيميائي أو الأنزيمي ، عن طريق الاحتفاظ بالعينات والمذيبات على الجليد للحد من التحلل المائي لسندات الاستر أو أكسدة السندات المزدوجة الكربونية الكربونية. الأنسجة والدهون الخلية محمية بشكل جيد جدا من المواد المضادة للاكسدة الطبيعية والتجزيء⁴; ومع ذلك ، بعد تجانس العينات ، يتم الجمع بين محتويات الخلية مما يجعل الدهون أكثر تخلصا من التغيير ، كيميائيا أو أنزيميا. بعض الدهون، مثل معظم الستيرول، مستقرة جدا، في حين أن البعض الآخر، مثل تلك التي تحتوي على الأحماض الدهنية غير المشبعة، هي أكثر عرضة للأكسدة الكيميائية. البعض الآخر، مثل ستيرول مع السندات المزدوجة المقترنة، عرضة للأكسدة حفزت من قبل ضوء⁵. بعد عمليات الاستخراج ، تكون الدهون أكثر عرضة للأكسدة الكيميائية ، ويجب تخزين العينات تحت غاز خامل مثل النيتروجين. كما سيتم استخدام تيار لطيف من النيتروجين لتركيز المستخلصات.

وبعد التركيز، عادة ما يتم قياس الدهون بكميات كبيرة لأنها عنصر مهم في النظم الإيكولوجية البحرية التي توفر تركيزا عاليا للطاقة، أي أكثر من ضعف كيلوجول/غرام الكربوهيدرات والبروتينات. ودائما ما يتم قياسها كميا كميا كمكونات فردية: التحليل الشامل للدهون ينطوي عموما على الفصل إلى فئات أبسط، وفقا لطبيعتها الكيميائية. وبالتالي، يتضمن التحليل الكامل قياس مجموع الدهون وفئات الدهون والمركبات الفردية.

يمكن تحديد مجموع الدهون عن طريق أخذ مجموع الطبقات الدهون قياسها بشكل فردي مفصولة كروماتوغرافيا⁶. قد يحتوي مستخلص الدهون البحري على أكثر من اثنتي عشرة فئة من المصادر البيولوجية والبشرية المنشأ. مجموعة واسعة من الهياكل الدهنية يعني الكثير من المعلومات يمكن الحصول عليها من خلال تحديد التجمعات الفردية للهياكل. وقد استخدمت فئات الدهون بشكل فردي، أو في مجموعات معينة، للإشارة إلى وجود أنواع معينة من الكائنات الحية، فضلا عن حالتها الفسيولوجية والنشاط². كما استخدمت كمؤشر على أصول المواد العضوية، بما في ذلك المواد العضوية المذابة (DOM) وكذلك الملوثات الكارهة للماء.

Triacylglycerols، فوسفوليبيدات وستيرول هي من بين الطبقات الدهون الحيوية أكثر أهمية. الأولين ترتبط بيوكيميائية لأنها تمتلك العمود الفقري الجلسرين التي يتم استرified اثنين أو ثلاثة من الأحماض الدهنية(الشكل 1). Triacylglycerols، جنبا إلى جنب مع استر الشمع هي مواد تخزين مهمة جدا، في حين أن الطبقات الدهنية الأخرى التي تحتوي على الأحماض الدهنية مثل diacylglycerols، والأحماض الدهنية الحرة، وmonopoacylglycerols هي عموما مكونات طفيفة. الأحماض الدهنية الحرة موجودة بتركيزات أقل في الكائنات الحية، كما يمكن أن تكون تلك غير المشبعة السامة⁷. يتم تضمين الستيرول (سواء في أشكالها الحرة والمهترة) والكحول الدهنية أيضا من بين الدهون الأقل قطبية ، في حين أن الجليكوليبيدات والفوسفوليبيدات هي دهون قطبية. الدهون القطبية لديها مجموعة هيدروفيلية، والذي يسمح لتشكيل ثنائيات الدهون الموجودة في أغشية الخلايا. الستيرولات الحرة هي أيضا مكونات هيكلية غشاء، وعندما تؤخذ في نسبة إلى triacylglycerols أنها توفر حالة أو مؤشر التغذية (TAG : ST) التي تم استخدامها على نطاق واسع⁸. عندما تؤخذ في نسبة إلى فوسفوليبيدات (ST : PL) يمكن استخدامها للإشارة إلى حساسية النبات للملح: القيم العالية الحفاظ على السلامة الهيكلية وتقليل نفاذية الغشاء⁹. وقد درس عكس هذه النسبة (PL : ST) في الأنسجة ثنائية الصمام خلال التكيف مع درجة الحرارة¹⁰.

يمكن فصل الطبقات الدهون البحرية من قبل الكروماتوغرافيا رقيقة الطبقة (TLC) على قضبان هلام السيليكا المغلفة (البروتوكول الخطوة 4) ومن ثم الكشف عن وكميا من قبل الكشف عن تأين اللهب (FID) في الماسح الضوئي FID التلقائي. وقد أصبح TLC/FID يستخدم بشكل روتيني للعينات البحرية لأنه يقدم بسرعة بيانات فئة الدهون الشاملة من عينات صغيرة ، ومن خلال أخذ مجموع جميع الطبقات ، وهي قيمة لإجمالي الدهون. وقد خضع TLC/FID لتقييم ضمان الجودة (QA) ووجد أنه يفي بالمعايير المطلوبة للمعايرة الخارجية المتسقة، والفراغات المنخفضة، والتحليل الدقيق للتكرار^11. معاملات الاختلاف (CV) أو الانحرافات المعيارية النسبية حوالي 10٪، وFID الماسح الضوئي مجموع بيانات الدهون عادة حوالي 90٪ من تلك التي تم الحصول عليها عن طريق gravimetric وغيرها من الطرق². يعطي قياس الجاذبية دهون إجمالية أعلى على الأرجح لأن الماسح الضوئي FID يقيس المركبات غير المتطايرة فقط ، وكذلك نتيجة لاحتمال إدراج مواد غير دهون في القياسات المرقمية.

المعلومات التي يقدمها تحليل فئة الدهون مفيدة بشكل خاص عندما يقترن تحديد الأحماض الدهنية كأفراد، أو ستيرول، أو اثنين في تركيبة. الخطوة الأولى نحو هذه التحليلات ينطوي على إطلاق جميع الأحماض الدهنية المكون جنبا إلى جنب مع ستيرولس في مقتطفات الدهون (البروتوكول الخطوة 5). وتعني المجموعة الواسعة من هياكل ووظائف الدهون أنها شهدت استخداما واسعا في الدراسات الإيكولوجية والبيوكيميائية التي تقيم صحة النظم الإيكولوجية ومدى تأثرها بالمدخلات البشرية والأرضية. وقد استخدمت لقياس التركيب البيولوجي للمواد ذات القيمة الغذائية للحيوانات البحرية وكذلك للإشارة إلى نوعية عينات المياه. ويساعد قياس الدهون في العينات الأساسية للرواسب على إظهار حساسية الرواسب للتغيرات في استخدام الإنسان للأراضي بالقرب من هامش البر والبحر.

كانت الأداة الأساسية لتحديد وقياس مركبات الدهون الفردية تقليديا هي كروماتوغرافيا الغاز (GC) مع FID. قبل التحليل ومع ذلك، يتم إجراء هذه المركبات أكثر تقلبا عن طريق الاشتقاق. يتم إطلاق الأحماض الدهنية في وجود محفز حمضي (H₂SO₄) من فئات الدهون أسيل (الشكل 1). في الكيمياء العضوية، عادة ما تكون مجموعة الأسيل (R-C=O) مشتقة من حمض الكربوكسيليك (R-COOH). ثم يتم إعادة استرجاعها إلى استرات الميثيل الأحماض الدهنية (FAME) الذي يعطي فصل أفضل على أعمدة GC (الخطوة البروتوكول 5).

Protocol

ملاحظة: لتنظيف الأواني الزجاجية والأدوات والمرشحات لتحليل الدهون، اغسلها 3 مرات بالميثانول متبوعة ب 3 يغسل بالكلوروفورم، أو سخنيها إلى 450 درجة مئوية لمدة 8 ساعات على الأقل.

1. إجراء الترشيح لمياه البحر المذابة والدهون الجسيمات

ملاحظة: يتم تعريف جزء معين من الاهتمام من الناحية التشغيلية بواسطة إجراء الترشيح. في هذه الحالة حجم المسام هو 1.2 ميكرومتر.

إعداد متعدد الترشيح دون مرشح وشطف الإعداد مع مياه البحر المصفاة.
باستخدام ملقط نظيفة وضع 47 مم من الألياف الزجاجية (GF / C) مرشح، التي تم غسلها، في نظام الترشيح نظيفة.
خذ العينة ودوامة برفق لإعادة إنفاق أي مواد قد تكون استقرت في الجزء السفلي من حاوية التجميع. قياس بدقة من وحدة تخزين معروفة، في هذه الحالة 1 L، وتصفية هذا من خلال عامل التصفية.
ملاحظة: يعتمد الحجم على كمية المواد الجسيمية في العينة: عادة ما يتراوح بين 250 مل و5 لترات حسب الموسم والموقع.
عندما يتم قياس العينة، قم بتبلل الفلتر بلطف بمياه البحر المصفاة. أضف العينة بأكملها ببطء إلى نظام الترشيح وشطف الأسطوانة المتدرج بمياه البحر المصفاة لضمان إضافة جميع الجسيمات إلى الفلتر. شطف الإعداد مع مياه البحر المصفاة على الجانبين لضمان شطف جميع الجسيمات وصولا الى مرشح.
1. السماح لجميع مياه البحر لتمرير من خلال مرشح ولكن لا تسمح للمرشح لتجف تماما لأنها يمكن أن تعطل الخلايا على مرشح. كسر الشفط كما يختفي آخر من الماء.
باستخدام ملقط نظيف وماصة نظيفة، أضعاف مرشح في النصف، ثم في الثلثين ثم في نصف بالطول للفة مرشح في أنبوب. ضعها في قارورة زجاجية نظيفة تحمل علامة 10 مل.
قم بتغطية الفلتر ب 2 مل من الكلوروفورم. ملء مساحة الرأس مع النيتروجين وختم مع الشريط PTFE. ضعه في رف في ثلاجة -20 درجة مئوية. وستكون العينات مستقرة في هذه الحرارة لمدة تصل إلى عام.
ملاحظة: لربط تركيزات الدهون بتركيزات الكتلة الإجمالية، هناك حاجة أيضا إلى قياس الوزن الجاف. وهذا ينطوي على وضع مرشح 24 ملم قبل وزنها في إعداد الترشيح الوزن الجاف، واثارة العينة وأخذ سوباتيمبل الصغيرة التي يتم تصفيتها على مرشح صغير. عندما يكون الفلتر جافا تقريبا ، تتم إضافة حوالي 10 مل من 3.5٪ من فورمات الأمونيوم إلى الفلتر. يتم طي الفلتر إلى نصفين ، وإعادته إلى طبق بيتري المسمى ووضعه في الثلاجة.

2. استخراج السائل السائل من مياه البحر أو عينات السائل

إعداد العينة
1. قياس حجم معروف من filtrate في الدهون الزجاج النظيف تخرج اسطوانة. ضع هذه العينة في قمع فاصل 1 L نظيف. ثم أضف 20 مل من الكلوروفورم إلى العينة وهز لمدة 2 دقيقة، تنفيس في كثير من الأحيان.
إزالة المستخلص الأول وإضافة الحمض بعد الفصل الأول
1. التفاف قمع في رقائق الألومنيوم وانتظر 5 إلى 10 دقيقة لفصل أن يحدث. قشر مرة أخرى الجزء السفلي من احباط لرؤية الطبقتين. جمع القاع، طبقة عضوية من خلال stopcock في قارورة نظيفة الجولة القاع، مع الحرص على عدم تضمين أي من الطبقة العليا. قم بسقف القارورة المستديرة القاع تحت النيتروجين ووضعها في الثلاجة.
2. إضافة 0.25 مل من تركيز H₂SO₄ لكل لتر من العينة، إلى العينة في قمع فاصلة ويهز القمع بلطف.
3. إضافة 10 مل من الكلوروفورم ويهز بقوة لمدة 2 دقيقة في حين تنفيس في كثير من الأحيان. السماح للانفصال أن يحدث.
الفصلان الثاني والثالث
1. انتظر الفصل وإضافة الطبقة السفلية إلى القارورة المستديرة القاعية.
2. إضافة 10 مل الثالث من الكلوروفورم، ويهز لمدة 2 دقيقة، مرة أخرى تنفيس في كثير من الأحيان. بعد الانفصال، أضف الطبقة السفلية إلى القارورة المستديرة القاعية.
3. نقل المقتطف في قارورة مستديرة القاع إلى المبخر الدوارة، وتتبخر ونقلها إلى قارورة 2 مل.

3. بروتوكول استخراج المواد الصلبة (تعديل فولش وآخرون³ استخراج)

اعداد
ملاحظة: يتطلب إعداد الاستخراج حاوية معزولة مليئة بالثلج. وتشمل المذيبات الميثانول، والمياه المستخرجة الكلوروفورم و2:1 الكلوروفورم: الميثانول. يجب وضع جميع المذيبات على الجليد بحيث تكون باردة بحلول الوقت الذي تبدأ فيه عمليات الاستخراج. العينات تذهب أيضا على الجليد، بحيث يبقى كل شيء باردا.
1. شطف جميع الأنابيب وPTFE اصطف قبعات 3 مرات مع الميثانول ومن ثم 3 مرات مع الكلوروفورم. وهناك حاجة إلى أنبوب واحد للطرد المركزي وقارورة واحدة سعة 15 مل مع غطاء لكل عملية استخراج.
2. ضع العينة في أنبوب طرد مركزي يحتوي على 2 مل من الكلوروفورم. حجم العينة يعتمد على كمية من الدهون الحالية، ما يقرب من 5 إلى 10 ملغ من الدهون المفضلة.
الطحن والاستخراج
1. إضافة ما يقرب من 1 مل من الميثانول الجليد الباردة وطحن العينة في اللب بسرعة مع متجانس نظيفة أو PTFE / قضيب معدنية انتهت.
2. غسل قضيب مرة أخرى في الأنبوب مع ما يقرب من 1 مل من الجليد الباردة 2:1 الكلوروفورم: الميثانول ومن ثم مع 1/2 مل من الماء المستخلص الكلوروفورم الجليد الباردة. إذا لزم الأمر، استخدم مجموعة نظيفة من ملقط لإجبار الجسيمات مرة أخرى في القارورة قبل الغسيل. كاب الأنبوب و sonicate الخليط لمدة 4 دقائق في حمام بالموجات فوق الصوتية (35 - 42 كيلوهرتز).
الأنابيب المزدوجة: الطرد المركزي العينة لمدة 2 دقيقة في 1800 × ز. جمع طبقة كاملة العضوية (الطبقة السفلى) باستخدام تقنية الأنابيب المزدوجة التي 5 3/4 "ماصة مع لمبة على فضفاضة يتم دفع بلطف من خلال طبقتين، في حين الضغط على لمبة، مما تسبب في فقاعات للخروج.
1. عندما يتم الوصول إلى الجزء السفلي من الطبقة الثانية، استخدم الإبهام لإزالة المصباح دون رسم الطبقة العضوية في ماصة. وضع ماصة 9 "داخل 5 3/4" واحد وإزالة الطبقة السفلية من خلال ماصة 5 3/4 " .
2. ضع المستخلص في قارورة نظيفة. استمر في خلع الطبقة السفلية حتى تتم إزالتها جميعا.
غسل ماصة: شطف ماصة 9 "في القارورة التي تحتوي على طبقة عضوية باستخدام 1.5 مل من الكلوروفورم الجليد الباردة لغسل أسفل خارج ماصة و 1.5 مل لغسل أسفل الداخل. بدوره بلطف أن ماصة أثناء الغسيل وتأكد من أن جميع الكلوروفورم يمتد أسفل ماصة في قارورة.
1. شطف 5 3/4 "ماصة في أنبوب يحتوي على طبقة مائي في نفس الطريق.
Sonicate والطرد المركزي عينات وماصة مزدوجة عند فصلها، وذلك باستخدام ماصة جديدة في كل مرة. كرر ما لا يقل عن ثلاث مرات وتجمع جميع الطبقات العضوية. بعد إزالة الطبقة العضوية للمرة الثالثة، اغسل كلا المصبوبات في القارورة التي تحتوي على الطبقة العضوية.
باستخدام تيار لطيف من النيتروجين، والتركيز وصولا الى حجم، ثم ختم مع شريط PTFE وتخزينها في الثلاجة.

4. تطوير أنظمة وخطوات لفصل قضيب TLC من الطبقات الدهون البحرية

إعداد قضبان لTLC
1. مسح قضبان فارغة في الماسح الضوئي FID التلقائي ثلاث مرات
2. اكتشاف عينة:تطبيق العينات والمعايير مع حقنة على قضبان في أو أقل بقليل من الأصل. الاستغناء عن 0.5 ميكرولتر ولمس قطرة إلى قضيب. السماح لتجف قبل وضع قطرة المقبل على نفس المكان. بقعة جميع العينات في خط على قضبان.
3. التركيز في الأسيتون:عينات التركيز مرتين (ثلاث مرات إذا كانت العينات مركزة جدا) في 70 مل من الأسيتون. مشاهدة الجبهة المذيبات كما أنه يتسلق قضيب حتى الجزء السفلي من بقعة يدمج مع الجزء العلوي. إزالة قضبان، وتجفيفها لحوالي 5 ق، ثم كرر الإجراء لإنتاج شريط ضيق من المواد الدهنية بالقرب من الجزء السفلي من قضيب.
4. الجافة وشرط قضبان في غرفة الرطوبة المستمر لمدة 5 دقائق. غرفة الرطوبة المستمرة هي مجفف مع محلول مشبع من كلوريد الكالسيوم تحت اللوحة.
تسلسل يؤدي إلى اللوني الأول (الهيدروكربون إلى كيتون)
1. نظام التطوير الأول: أول نظام تطوير هو hexane:diethyl ether:formic acid, 98.95:1:0.05. استخدام حقنة لإضافة حمض الفورميك ولكن أولا شطف الحقنة 3× مع حمض الفورميك. شطف حمض الفورميك من الحقنة مباشرة بعد ذلك مع الكلوروفورم. استخدام 30 مل من الخليط لتبلل الورق وشطف الخزان. تجاهل محلول الشطف وإضافة 70 مل المتبقية إلى الخزان.
  1. تأخذ رفوف وخفض بلطف لهم في الخزان. شاهد حتى تصل الجبهة المذيبة إلى بقع العينة، ثم ابدأ المؤقت. بعد 25 دقيقة، قم بإزالة القضبان من غرفة التطوير، وجففها في غرفة الرطوبة المستمرة لمدة 5 دقائق، ثم أعد تطويرها في نفس الحل لمدة 20 دقيقة أخرى.
2. قم بتجفيف القضبان لمدة 5 دقائق في الماسح الضوئي FID التلقائي ثم قم بالمسح الضوئي إلى أدنى نقطة خلف قمة الكيتون باستخدام فحص PPS من 25.
تسلسل يؤدي إلى اللوني الثاني (triacylglycerol إلى دياسيلجلسيرول):
1. شرط قضبان لمدة 5 دقائق في غرفة الرطوبة المستمرة.
2. نظام التطوير الثاني: نظام التطوير الثاني هو hexane:diethyl ether:formic acid, 79:20:1. إضافة ~ 30 مل إلى خزان التنمية لتبلل ورقة وشطف الخزان. ثم تجاهل وتطوير قضبان لمدة 40 دقيقة في 70 مل المتبقية. للحصول على أفضل فصل بين قمة TAG (المشبعة) وقمم TAG (متعددة غير المشبعة) استخدم خليطا من 79.9:20:0.1 ، ولكن لفصل قمم ST و DAG استخدم مزيجا من 79:20:1.
3. الجافة والمسح الضوئي إلى أدنى نقطة وراء ذروة diacylglycerol في مسح جزئي الثاني باستخدام فحص PPS 11.
تسلسل يؤدي إلى اللوني الثالث (الأسيتون المحمول الدهون القطبية والفوسفولبيد)
1. شرط قضبان لمدة 5 دقائق في غرفة الرطوبة المستمرة.
2. تطوير قضبان مرتين لمدة 15 دقيقة في 70 مل من الأسيتون. بين التطورات الهواء الجاف قضبان لمدة 30 ثانية.
3. شرط قضبان لمدة 5 دقائق في غرفة الرطوبة المستمرة.
4. نظام التطوير الثالث: نظام التطوير الثالث هو مزيج من الكلوروفورم والميثانول والمياه المستخرجة من الكلوروفورم ، 50:40:10. تطوير قضبان مرتين لمدة 10 دقائق في 70 مل من الخليط. بين التطورات، والهواء الجاف قضبان لحوالي 30 ثانية.
5. الجافة ومسح كامل طول قضبان.

5. اشتقاق الشهرة مع H₂SO₄ في MeOH

جعل كاشف هيلديتش
1. إعداد الميثانول: ضع 100 مل من MeOH في قارورة حجمية نظيفة ثم رشها برفق في NaSO₄ اللامائية حتى يتم تغطية الجزء السفلي من القارورة. مرة واحدة مغطاة، عكس مرتين بحيث يتم امتصاص أي ماء في الميثانول من قبل NaSO₄. بعد عكس والهز، والسماح لها الجلوس لمدة 5 دقائق على الأقل.
2. إضافة حمض: ببطء decant الميثانول في جرة زجاجية (حتى الآن₄ NaSO هو كتلة الثابت في الجزء السفلي من القارورة) ويتم إضافة H₂SO_4. أضف ببطء حمض الكبريتيك 1.5 مل إلى الميثانول باستخدام ماصة. إضافة بضع قطرات في وقت واحد وبمجرد إضافة كل حمض، وقبعة ويحرك بلطف لخلط. الحل جاهز الآن لاستخدامه في المشتقات، ولكن يجب أن يتكون على أساس أسبوعي.
صنع المشتقات
1. نقل ما يقرب من 200 ميكروغرام من الدهون من قارورة استخراج التي كان حجم جلبت ما يصل الى كمية معروفة، إلى قارورة نظيفة، 15 مل وتتبخر تحت النيتروجين إلى الجفاف. سيتم تحديد الكمية التي تمت إزالتها من خلال تركيز العينة من TLC /FID. استخدام ماصة نظيفة لإزالة العينة.
2. عندما جفت العينة، أضف 1.5 مل من ثنائي كلورو الميثان و3 مل من كاشف هيلديتش المصنوع حديثا.
3. دوامة العينة، و sonicate في حمام بالموجات فوق الصوتية لمدة 4 دقائق لإزالة الدهون التي التزمت قارورة الزجاج. ملء القارورة مع النيتروجين، وقبعة، وختم مع الشريط PTFE والحرارة في 100 درجة مئوية لمدة 1 ساعة.
وقف رد الفعل
1. السماح للعينات لتبرد تماما لدرجة حرارة الغرفة لمدة 10 دقائق بعد إزالتها من الفرن، ثم فتح قوارير بعناية.
2. أضف ببطء ما يقرب من 0.5 مل من محلول بيكربونات الصوديوم المشبع (9 غ/100 مل من الماء المستخرج من الكلوروفورم)، ثم 1.5 مل من الهيكسان. هز أو دوامة القارورة، ثم اسمحوا الوقوف بحيث يفصل إلى 2 طبقات.
جمع الشهرة
1. إزالة الطبقة العليا:بمجرد توقف اشتقاق، وهناك فصل واضح، وإزالة العلوي، المرحلة العضوية ومكان في قارورة نظيفة 2 مل الدهون.
2. تبخر المذيب في قارورة 2 مل لتجف وإعادة تعبئتها مع الهيكسان إلى ما يقرب من 0.5 مل.
3. ملء مساحة الرأس من القارورة مع النيتروجين، وغطاء وختم القارورة مع الشريط PTFE، sonicate لمدة 4 دقائق أخرى لإعادة تعليق الأحماض الدهنية، ومن ثم فإنه على استعداد للذهاب إلى GC.
  ملاحظة: إذا كانت تركيزات الأحماض الدهنية مطلوبة، يجب غسل الطبقة المائية ثلاث مرات بالهيكسان وجميع الطبقات العضوية المجمعة في قارورة 2 مل. وهذا ينطوي على إضافة 2 مل من الهيكسان، دوامة العينة، الطرد المركزي، وإزالة الطبقة العضوية، وكلها تتكرر 3 مرات.

النتائج

وكقطاع إنتاج غذائي أسرع نموا، يتطور الاستزراع المائي من حيث الابتكارات التكنولوجية والتكيفات لتلبية المتطلبات المتغيرة. ويتمثل أحد هذه الخطوات في الحد من الاعتماد على دقيق السمك البري المصدر وزيت السمك، اللذين يوفران مكونات الأعلاف للعديد من أنواع الاستزراع المائي. ويجري التحقيق في ال?...

Discussion

والسرعة التي يوفر بها نظام TLC-FID معلومات فئة الدهون الشاملة من عينات صغيرة تجعل من TLC-FID أداة قادرة على فحص العينات البحرية قبل القيام بإجراءات تحليلية أكثر مشاركة. وتتطلب هذه التحليلات عادة إطلاق مركبات مكونة من مستخلصات الدهون واشتقاقها لزيادة التقلب في حالة الكروماتوغرافيا الغازية. TLC-FID...

Disclosures

ولا توجد مصالح مالية متنافسة بين أصحاب البلاغ.

Acknowledgements

تم تمويل هذا البحث من قبل مجلس العلوم الطبيعية والبحوث الهندسية في كندا (NSERC) رقم المنحة 105379 إلى C.C. Parrish. ساعدت شبكة معدات البحوث الأساسية والتدريب على الأجهزة (CREAIT) التابعة لجامعة ميموريال في تمويل هذا المنشور.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
15 ml vials	VWR	66009-560
1-hexadecanol	Sigma	258741-1G
1-Monopalmitoyl-rac-glycerol	Sigma	M1640-1g
2 ml vials	VWR	46610-722
25 mm glass fibre filters	Fisher	09 874 32A
2ml pipet bulbs	VWR	82024-554
47 mm glass fibre filters	Fisher	09 874 32
5 3/4" pipets	Fisher	1367820A
9" pipets	Fisher	1367820C
Acetone	VWR	CAAX0116-1
Agilent GC-FID 6890	Agilent
Calcium Chloride ANHS 500gm	VWR	CACX0160-1
Caps for 2 ml vials	VWR	46610-712
chloroform	VWR	CACX1054-1
Cholesteryl palmitate	Sigma	C6072-1G
Chromarod S5	Shell USA	3252
Dichloromethane	VWR	CADX0831-1
DL-a-phosphatidylcholine, dipalmotoyl	Sigma	P5911-1g
Ethyl Ether, ACS grade anhydr 4L	VWR	CAEX0190-4
Glyceryl tripalmitate	Sigma	T5888-100MG
Hamilton Syringe 702SNR 25µl	Sigma	58381
Helium	Air Liquide	A0492781
Hexane	VWR	CAHX0296-1
Hydrogen regulator	VWR	55850-484
Iatroscan MK6	Shell USA
Kimwipes	Fisher	066662
Medical Air	Air Liquide	A0464563
Medium nitrile gloves	Fisher	191301597C
Nitrile gloves L	VWR	CA82013-782
Nitrogen	Air Liquide	A0464775
Nitrogen Regulator	VWR	55850-474
Nonadecane	Sigma	74158-1G
Palmitic acid	Sigma	P0500-10G
Repeating dispenser	Sigma	20943
Sodium Bicarbonate 1kg	VWR	CA97062-460
Sodium Sulfate Anhy ACS 500gr	VWR	CA71008-804
Sulfuric acid	VWR	CASX1244-5
Teflon tape	Fisher	14610120
tissue master 125 115V w/7mm homogenator	OMNI International	TM125-115
TLC development tank	Shell USA	3201
UHP hydrogen	Air Liquide	A0492788
VWR solvent repippetter	VWR	82017-766
VWR timer Flashing LED 2 channel	VWR	89140-196
Zebron ZB-Wax GC column	Phenomenex	7HM-G013-11

References

Couturier, L. I. E., et al. State of art and best practices for fatty acid analysis in aquatic sciences. ICES Journal of Marine Science. , (2020).
Parrish, C. C. Lipids in Marine Ecosystems. ISRN Oceanography. , 604045 (2013).
Folch, J., Lees, M., Stanley, G. H. S. A simple method for the isolation and purification of total lipides from animal tissues. Journal of Biological Chemistry. 226, 497-509 (1957).
Vaz, F. M., Pras-Raves, M., Bootsma, A. H., van Kampen, A. H. C. Principles and practice of lipidomics. Journal of Inherited Metabolic Disease. , (2014).
Wolf, C., Quinn, P. J. Lipidomics: practical aspects and applications. Progress in Lipid Research. 47, 15-36 (2008).
Parrish, C. C., Arts, M. T., ainman, B. C. Determination of total lipid, lipid classes, and fatty acids in aquatic samples. Lipids in Freshwater Ecosystems. , 4-20 (1999).
Jüttner, F. Liberation of 5,8,11,14,17-eicosapentaenoic acid and other polyunsaturated fatty acids from lipids as a grazer defense reaction in epilithic diatom biofilms. Journal of Phycology. 37, 744-755 (2001).
Carreón-Palau, L., Parrish, C. C., Pérez-España, H., Aguiñiga-Garcia, S. Elemental ratios and lipid classes in a coral reef food web under river influence. Progress in Oceanography. 164, 1-11 (2018).
Maciel, E., et al. Bioprospecting of marine macrophytes using MS-based lipidomics as a new approach. Marine Drugs. 14, 49 (2016).
Pernet, F., Tremblay, R., Comeau, L., Guderley, H. Temperature adaptation in two bivalve species from different thermal habitats: energetics and remodelling of membrane lipids. Journal of Experimental Biology. 210, 2999-3014 (2007).
Bergen, B. J., Quinn, J. G., Parrish, C. C. Quality-assurance study of marine lipid-class determination using Chromarod/Iatroscan thin-layer chromatography-flame ionization detector. Environmental Toxicology and Chemistry. 19, 2189-2197 (2000).
Foroutani, B. M., Parrish, C. C., Wells, J., Taylor, R. G., Rise, M. L. Minimizing marine ingredients in diets of farmed Atlantic salmon (Salmo salar): effects on liver and head kidney lipid class, fatty acid and elemental composition. Fish Physiology & Biochemistry. 46, 2331-2353 (2020).
Parrish, C. C., Deibel, D., Thompson, R. J. Effect of sinking spring phytoplankton blooms on lipid content and composition in suprabenthic and benthic invertebrates in a cold ocean coastal environment. Marine Ecology Progress Series. 391, 33-51 (2009).
Sinanoglou, V. J., et al. On the combined application of Iatroscan TLC-FID and GC-FID to identify total, neutral, and polar lipids and their fatty acids extracted from foods. ISRN Chromatography. , 59024 (2013).
Peters-Didier, J., Sewell, M. A. Maternal investment and nutrient utilization during early larval development of the sea cucumber Australostichopus mollis. Marine Biology. 164, 178 (2017).
Triesch, N., et al. Concerted measurements of lipids in seawater and on submicron aerosol particles at the Cape Verde Islands: biogenic sources, selective transfer and high enrichments. Atmospheric Chemistry and Physics. 21, 4267-4283 (2021).
Parrish, C. C., Bodennec, G., Gentien, P. Determination of glycoglycerolipids by Chromarod thin-layer chromatography with Iatroscan flame ionization detection. Journal of Chromatography A. 741, 91-97 (1996).
Mejri, S., et al. Bonefish (Albula vulpes) oocyte lipid class and fatty acid composition related to their development. Environmental Biology of Fishes. 102, 221-232 (2019).
Sewell, M. A. Utilization of lipids during early development of the sea urchin Evechinus chloroticus. Marine Ecology Progress Series. 304, 133-142 (2005).
Parrish, C. C., Bodennec, G., Gentien, P. Separation of polyunsaturated and saturated lipids from marine phytoplankton on silica gel coated Chromarods. Journal of Chromatography A. 607, 97-104 (1992).
Stevens, C. J., Deibel, D., Parrish, C. C. Incorporation of bacterial fatty acids and changes in a wax ester-based omnivory index during a long-term incubation experiment with Calanus glacialis Jaschnov. Journal of Experimental Marine Biology and Ecology. 303, 135-156 (2004).
Goutx, M., et al. Short term summer to autumn variability of dissolved lipid classes in the Ligurian Sea (NW Mediterranean). Biogeosciences. 6, 1229-1246 (2009).
Conlan, J. A., Rocker, M. M., Francis, D. S. A. comparison of two common sample preparation techniques for lipid and fatty acid analysis in three different coral morphotypes reveals quantitative and qualitative differences. PeerJ. 5, 3645 (2017).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

178

This article has been published

Video Coming Soon

Keep me updated:

Method Article