해양 샘플의 총 지질 및 지질 수업 결정

요약

이 프로토콜은 해수 및 생물학적 표본에서 지질의 결정을 위한 것입니다. 여과류의 지질은 고체의 경우 클로로폼 또는 클로로폼및 메탄올혼합물로 추출됩니다. 지질 클래스는 화염 이온화 감지와 막대 얇은 층 크로마토그래피에 의해 측정되고 그들의 합계는 총 지질 함량을 제공합니다.

초록

지질은 주로 탄소와 수소로 구성되어 있으며, 따라서 바다에서 다른 유기 거대 분자보다 더 큰 특정 에너지를 제공합니다. 탄소와 수소가 풍부하기 때문에 소수성이며 유기 오염 물질용 용매 및 흡수 담체 역할을 할 수 있으므로 해양 생태계에서 오염 물질 바이오 축적의 원동력이 될 수 있습니다. 그들의 소수성 특성은 해수 또는 생물학적 표본에서 그들의 격리를 용이하게 합니다: 해양 지질 분석은 수생 매트릭스에 있는 그밖 물질에서 그들의 분리를 위한 편리한 방법을 제공하는 비 극성 유기 용매에 있는 샘플링 그리고 그 때 추출으로 시작됩니다.

해수를 샘플링한 경우, 첫 번째 단계는 일반적으로 여과에 의한 운영 정의된 '용해'와 '미립자' 진영으로 분리하는 것을 포함합니다. 시료는 진정으로 용존된 물질과 콜로이드를 위해 일반적으로 클로로폼을 사용하여 시료 매트릭스로부터 분리된 지질을 수집하고, 고체 및 생물학적 표본을 위한 클로로폼과 메탄올의 혼합물을 포함한다. 이러한 추출 물 생물 발생 및 인위적 소스에서 여러 클래스를 포함 할 수 있습니다. 이때, 총 지질 및 지질 클래스가 결정될 수 있다. 총 지질은 관례적으로 구분된 개별적으로 결정된 지질 클래스를 합산하여 측정할 수 있습니다. 화염 이온화 검출(FID)을 가진 얇은 층 크로마토그래피(TLC)는 해양 샘플에서 지질의 정량적 분석에 정기적으로 사용됩니다. TLC-FID는 시놉틱 지질 클래스 정보를 제공하며, 클래스를 합산하여 총 지질 측정을 제공합니다.

지질 등급 정보는 지질 추출물에서 방출된 후 지방산 및/또는 스테롤과 같은 개별 성분의 측정과 결합될 때 특히 유용합니다. 지질 구조와 기능의 다양한 그들은 생태계 건강과 인류학적 영향에 의해 영향의 정도를 평가 생태 및 생물 지질 연구에 광범위하게 사용 된다는 것을 의미한다. 그들은 해양 동물군 (예 : 아쿠아 피드 및 / 또는 먹이)에 식이 값의 물질을 측정하고 수질 (예 : 탄화수소)의 지표로 사용되었습니다.

서문

여기에 설명 된 방법은 해양 지질으로 작동적으로 정의 되는 물질에 관한. 이 정의는 비극성 유기 용매에서 액체 액체 추출에 대한 그들의 편의성을 기반으로하며 수중 매트릭스에서 다른 물질과 분리하는 편리한 방법을 제공합니다. 그들의 소수성 성질은 바닷물 또는 생물학 견본에서 그들의 격리를, 그들의 농축, 소금과 단백질의 제거를 촉진합니다.

지질 함량의 측정과 해양 생물의 구성은 수십 년 동안 식품 웹 생태학, 양식 영양 및 식품 과학에 큰 관심을 가지고 있습니다. 지질은 살아있는 유기체에 있는 보편적인 분대입니다, 세포막에 있는 필수적인 분자로 작동합니다, 생체 이용 가능한 에너지의 주요 근원으로, 단열 및 부력을 제공하고, 신호 분자로 봉사합니다. 다른 분야에서 지질 측정을 위한 절차가 잘 설명되었지만, 해양 샘플과의 사용은 일반적으로^1형뿐만 아니라 현장 조건에 적응하기 위해 수정이 필요하다.

해수 샘플의 경우, 첫 번째 단계는 일반적으로 여과(프로토콜 단계 1)에 의해 작동적으로 정의된 '용해'와 '미립자' 분획으로 분리가 필요합니다. 미립자 분획은 필터에 의해 유지되는 것이며, 모공의 크기는 컷오프^2를정의하는 데 중요하다. 종종 미립자 물질을 샘플링할 때 지질 농도를 총 질량 농도에 관련시키고 자하며, 이 경우 별도의 더 작은 샘플(예: 10mL)을 이 목적을 위해 취해야 합니다(프로토콜 단계 1, 참고). 정확한 질량 결정을 얻으려면 여과 끝에 암모늄 포메이트 (35 g/L)를 추가하는 것이 중요합니다.

더 큰 시료로부터의 해수 여과는 시료 유형에 따라 250mL에서 1L 사이로 양해야 하며 분리 깔때기에서 액체 액체 추출을 받게 된다(프로토콜 단계 2). 지질의 소수성 성질은 클로로폼과 같은 비극성 용매에서 추출하여 다른 화합물과 분리될 수 있음을 의미한다. 2층 시스템은 지질이 유기 층으로 분할되는 반면 수용성 성분은 수성 층에 유지되도록 생성됩니다.

필터상 미립자 시료, 또는 생물학적 시편은 수정된 Folch 외. 추출^3,또한 클로로폼(Protocol step 3)을 수반한다. 다시 말하지만, 유기/수성 시스템은 지질이 유기 상으로 분할되는 반면, 수용성 분자는 수성 상에 남아 있고 단백질이 침전됩니다. 사실, 고형물의 경우, 대부분의 실험실은 엽록소와 메탄올을 포함하는 Folch 외. 추출³ 절차의 일부 변형을 사용합니다. 필터의 경우, 첫 번째 단계는 클로로폼 2mL 및 메탄올 1mL로 균질화하는 것입니다.

추출 하는 동안, 주의 화학 또는 효소 수정에서 지질을 보호 하기 위해, 에스 테르 결합 가수 분해 또는 탄소 탄소 이중 결합 산화를 줄이기 위해 얼음에 샘플 및 용매를 유지 하 여. 조직과 세포 지질은 천연 항산화제와 구획화^4에의해 아주 잘 보호됩니다. 그러나, 시료의 균질화에 따라, 세포 내용물들은 지질을 더 변경, 화학적 또는 효소적으로 배치하는 렌더링을 결합한다. 대부분의 스테롤과 같은 일부 지질은 매우 안정적이며, 고도 불포화 지방산을 함유하는 지질과 같은 지질은 화학 적 산화에 더 취약합니다. 이중 결합을 결합한 스테롤과 같은 다른 사람들은 빛^5에의해 산화되는 경향이 있다. 추출 후 지질은 화학 적 산화에 훨씬 더 취약하며 샘플은 질소와 같은 불활성 가스 아래에 보관해야합니다. 질소의 부드러운 스트림은 또한 추출 물을 집중 하는 데 사용 됩니다.

농도 후, 지질은 일반적으로 대량으로 정량화 될 것 이다 그들은 높은 농도 의 에너지를 제공 하는 해양 생태계의 중요 한 구성 요소, 탄수화물과 단백질의 두 배 kJ/g 이상. 변함없이 그들은 다음 개별 구성 요소로 정량화 될 것 이다: 지질의 포괄적인 분석 일반적으로 간단한 범주로 분리 포함, 그들의 화학 적 특성에 따라. 따라서 전체 분석은 총 지질, 지질 클래스 및 개별 화합물을 측정하는 것을 포함합니다.

총 지질은 크로마토그래피^6에의해 분리된 개별적으로 측정된 지질 클래스의 합을 취함으로써 결정될 수 있다. 해양 지질 추출물은 생생및 인위적 인 공급원으로부터 12 개 이상의 클래스를 포함 할 수 있습니다. 지질 구조의 다양한 구조의 개별 그룹을 결정하 여 많은 정보를 얻을 수 있습니다 의미. 지질 클래스는 개별적으로, 또는 특정 그룹에서, 유기체의 특정 유형의 존재를 신호하는 데 사용되었습니다, 뿐만 아니라 자신의 생리 상태 및 활동^2. 그들은 또한 유기 물질의 기원의 지표로 사용 되었습니다., 용존 유기 물질을 포함 하 여 (DOM) 뿐만 아니라 소수성 오염 물질.

트리아실글리세롤, 인지질 및 스테롤은 더 중요한 생체 생성 지질 클래스 중 하나입니다. 처음 두 가지는 2개 또는 3개의 지방산이 에스테르화되는 글리세롤 백본을 소유하기 때문에 생화학적으로 관련되어있다(도 1). 트리아실글리세롤은 왁스 에스테르와 함께 매우 중요한 저장 물질이며, 다른 지방산 함유 지질 클래스는 투석기류, 자유 지방산 및 모노아실글리세롤과 같은 일반적으로 사소한 성분입니다. 불포화 지방산은^독성이있을 수 있기 때문에 살아있는 유기체에서 낮은 농도로 존재한다. 스테롤 (그들의 자유롭고 에스테르 화 된 형태로 모두) 지방 알코올은 또한 덜 극성 지질 중 포함, 글리콜리피와 인지질은 극지 지질 동안. 극성 지질에는 세포막에서 발견되는 지질 이중층의 형성을 허용하는 친수성 그룹이 있습니다. 무료 스테롤은 또한 막 구조 성분이며 트리아실글리세롤에 대한 비율로 복용하면^8에널리 사용된 상태 또는 영양 지수(TAG : ST)를 제공한다. 인지질(ST : PL)에 대한 비율로 복용하면 염에 대한 식물 민감도를 나타내는 데 사용할 수 있습니다: 높은 값은 구조적 무결성을 유지하고 멤브레인 투과성을 감소시킵니다^9. 이 비율의 역 (PL : ST)은 온도 적응¹⁰동안 바이 밸브 조직에서 연구되었습니다.

해양 지질 클래스는 실리카 젤 코팅 막대(프로토콜 단계 4)의 얇은 층 크로마토그래피(TLC)로 분리한 다음 자동 FID 스캐너에서 화염 이온화 검출(FID)에 의해 검출및 정량화될 수 있다. TLC/FID는 작은 샘플에서 시놉틱 지질 클래스 데이터를 빠르게 제공하고 전체 지질에 대한 가치인 모든 클래스의 합을 취함으로써 해양 샘플에 일상적으로 사용되었습니다. TLC/FID는 품질 보증(QA) 평가를 받았으며 일관된 외부 교정, 낮은 블랭크 및 정밀 복제^{분석(11)에}필요한 표준을 충족하는 것으로 나타났습니다. 변형계수(CV) 또는 상대적 표준 편차는 약 10%, FID 스캐너 총 지질 데이터는 일반적으로 중력 및 기타^방법에의해 얻은 지질 데이터의 약 90%이다. 중력은 FID 스캐너가 비휘발성 화합물만을 측정하고, 또한 중력 측정에 비 지질 물질을 포함할 수 있기 때문에 더 높은 총 지질을 제공합니다.

지질 등급 분석에 의해 제공되는 정보는 개인, 또는 스테롤, 또는 조합에 있는 둘의 결정과 결합될 때 특히 유용합니다. 이러한 분석을 향한 첫 번째 단계는 지질 추출물의 스테롤과 함께 모든 성분 지방산의 방출을 포함한다 (프로토콜 단계 5). 지질 구조와 기능의 다양한 그들은 생태계 건강과 그들이 인류와 지상파 입력에 의해 영향을받은 정도를 평가하는 생태 및 생지구 화학 연구에서 광범위한 사용을 보았다 는 것을 의미한다. 그들은 해양 동물군뿐만 아니라 물 샘플의 품질을 나타내는 식이 값의 물질의 생합성을 측정하는 데 사용되었습니다. 퇴적물 코어 샘플에서 지질을 측정하면 육지-바다 마진 근처의 인간 토지 사용의 변화에 대한 퇴적물의 민감도를 보여주는 데 도움이 됩니다.

개별 지질 화합물을 식별하고 정량화하기 위한 주요 공구는 전통적으로 FID를 가진 가스 크로마토그래피 (GC)이었습니다. 그러나 분석하기 전에, 이러한 화합물은 파생에 의해 더 휘발성이 만들어집니다. 지방산은 아킬 지질클래스(도 1)로부터산성 촉매(H₂SO_4)의존재에서 방출된다. 유기 화학에서, 아실 군 (R-C=O)은 일반적으로 카복실산 (R-COOH)에서 파생됩니다. 그(것)들은 그 때 GC 열에 더 나은 분리를 주는 지방산 메틸 에스테르 (FAME)에 다시 에스테르 (프로토콜 단계 5).

프로토콜

참고: 지질 분석을 위한 유리제품, 기기 및 필터를 청소하려면 메탄올로 3회 세척한 다음 엽록소로 3개의 세척을 하거나 최소 8시간 동안 450°C로 가열하십시오.

1. 해수 용해 및 미립지질에 대한 여과 절차

참고: 특정 관심 분수는 여과 절차에 의해 운영적으로 정의됩니다. 이 경우 기공 크기는 1.2 μm입니다.

1. 필터없이 여과 매니폴드를 설정하고 여과 된 바닷물로 설정을 헹구습니다.
2. 깨끗한 집게를 사용하여 47mm 유리 섬유 (GF / C) 필터를 세척하여 깨끗한 여과 시스템에 넣습니다.
3. 샘플을 가져 와서 부드럽게 소용돌이하여 수집 용기의 바닥에 정착 했을 수 있는 모든 재료를 다시 중단합니다. 이 경우 알려진 볼륨을 정확하게 측정하고 필터를 통해 이를 필터링합니다.
   참고: 부피는 시료의 미립자 물질의 양에 따라 달라집니다: 일반적으로 계절과 위치에 따라 보통 250mL에서 5L 사이.
4. 시료를 측정하면 필터를 여과된 바닷물로 부드럽게 적시십시오. 전체 샘플을 여과 시스템에 천천히 추가하고 모든 입자가 필터에 추가되도록 여과된 바닷물로 졸업한 실린더를 헹구킵니다. 모든 입자가 필터에 헹구지 않도록 측면에 여과된 해수로 설정을 헹구어 놓습니다.
   1. 모든 바닷물이 필터를 통과하도록 허용하지만 필터의 세포를 방해 할 수 있으므로 필터가 완전히 건조되는 것을 허용하지 않습니다. 물의 마지막이 사라짐에 따라 흡입을 끊습니다.
5. 깨끗한 집게와 깨끗한 파이펫을 사용하여 필터를 반으로 접은 다음 3분의 1로 반으로 접어 필터를 튜브로 굴려 냅니다. 10mL 유리 유리 바이알로 표시된 깨끗하고 깨끗한 유리 바이알에 넣습니다.
6. 필터를 클로로폼 2mL로 덮습니다. 머리 공간을 질소로 채우고 PTFE 테이프로 밀봉하십시오. -20°C 냉동고에 랙에 넣습니다. 샘플은 이 온도에서 최대 1년까지 안정될 것입니다.
   참고: 지질 농도를 총 질량 농도에 관련시키기 위해서는 건조 중량 측정도 필요합니다. 여기에는 24mm 의 미리 계량된 필터를 건식 중량 여과 설정에 넣고 샘플을 교반하고 작은 필터에 여과되는 작은 하위 샘플을 채취하는 작업이 포함됩니다. 필터가 거의 건조하면 약 10mL의 3.5% 암모늄용암모늄이 필터에 추가됩니다. 필터는 반으로 접혀, 라벨이 붙은 페트리 접시에 반환하고 냉동실에 놓습니다.

2. 해수 또는 액체 샘플의 액체 액체 추출

1. 샘플 준비
   1. 지질 청정 유리 졸업 실린더에 알려진 양의 여과를 측정합니다. 이 샘플을 깨끗한 1 L 분리 깔때기에 놓습니다. 그런 다음 20mL의 클로로폼을 샘플에 넣고 2분 동안 흔들어 자주 배출합니다.
2. 첫 번째 분리 후 첫 번째 추출물 제거 및 산 첨가
   1. 깔때기를 알루미늄 호일로 감싸고 분리가 발생할 때까지 5~10분 기다립니다. 호일의 바닥을 다시 껍질을 벗기고 두 레이어를 볼 수 있습니다. 스톱콕을 통해 바닥의 유기층을 깨끗한 둥근 바닥 플라스크로 모아 상단 층을 포함하지 않도록 주의하십시오. 둥근 바닥 플라스크를 질소 아래에 캡을 씌운 다음 냉동실에 놓습니다.
   2. 시료의 각 리터에 대해 0.25 mL의 농축 H₂SO_{SO 4를} 추가하여 분리 깔때기의 샘플에 넣고 깔때기를 부드럽게 흔들어 줍니다.
   3. 10mL의 클로로폼을 넣고 자주 배출하는 동안 2 분 동안 힘차게 흔들어줍니다. 분리가 수행되도록 허용합니다.
3. 두 번째 및 세 번째 분리
   1. 분리를 기다린 후 하단 레이어를 둥근 바닥 플라스크에 추가합니다.
   2. 클로로폼의 세 번째 10mL를 추가하고 2 분 동안 흔들어 다시 자주 배출합니다. 분리 후 아래쪽 레이어를 둥근 바닥 플라스크에 추가합니다.
   3. 둥근 바닥 플라스크에서 추출물을 회전 증발기로 옮기고, 증발하여 2mL 바이알로 이송한다.

3. 고체에 대한 추출 프로토콜 (수정 된 Folch^{외. 3} 추출)

1. 설치
   참고: 추출 설정에는 얼음이 채워진 절연 용기가 필요합니다. 용매에는 메탄올, 클로로폼 추출물 및 2:1 클로로폼:메탄올이 포함됩니다. 모든 용매는 추출이 시작될 때까지 추워지도록 얼음 위에 두어야 합니다. 샘플은 또한 얼음에 가서 모든 것이 차가운 상태로 유지되도록합니다.
   1. 모든 튜브와 PTFE 라이닝 캡을 메탄올로 3번 헹구고 클로로폼으로 3회 헹구십시오. 각 추출에는 원심분리기 튜브 1개와 캡이 있는 15mL 바이알 1회가 필요합니다.
   2. 샘플을 클로로폼 2mL가 함유한 원심분리기 튜브에 놓습니다. 시료의 크기는 지질의 양에 따라 달라 지며, 약 5~10 mg의 지질이 바람직하다.
2. 연삭 및 추출
   1. 약 1mL의 얼음 차가운 메탄올을 넣고 깨끗한 균질화또는 PTFE/금속 형 막대로 샘플을 펄프로 빠르게 갈아 넣습니다.
   2. 약 1mL의 얼음 차가운 클로로폼인 메탄올을 넣고 1/2mL의 얼음 차가운 클로로폼 추출물로 막대를 튜브안으로 다시 씻으십시오. 필요한 경우 깨끗한 집게 세트를 사용하여 세척 하기 전에 다시 유리병에 입자를 강제로. 튜브를 캡하고 초음파 욕조 (35 - 42 kHz)에서 4 분 동안 혼합물을 초음파 처리합니다.
3. 이중 파이펫팅: 원심 분리는 1800 × g에서2 분 동안 샘플을 원심 분리합니다. 전구가 있는 5 3/4" 파이펫이 두 층을 부드럽게 밀어내고 전구를 압박하면서 거품이 나오는 이중 파이펫팅 기술을 사용하여 전체 유기 층(하부 레이어)을 수집합니다.
   1. 두 번째 레이어의 맨 아래에 도달하면 엄지 손가락을 사용하여 파이펫에 유기 층을 그리지 않고 전구를 제거합니다. 5 3/4" 파이펫 내부에 9" 파이펫을 놓고 5 3/4" 파이펫을 통해 아래쪽 레이어를 제거합니다.
   2. 추출물을 깨끗한 유리병에 놓습니다. 모든 레이어가 제거될 때까지 아래쪽 레이어를 계속 제거합니다.
4. 세척 파이펫: 얼음 차가운 클로로폼 1.5mL을 사용하여 유기 층을 포함하는 유리층으로 9"파이펫을 헹구어 파이펫의 바깥쪽을 씻어 내고 1.5 mL을 씻어 내부를 씻어냅니다. 세탁하는 동안 파이펫을 부드럽게 돌리고 모든 클로로폼이 파이펫을 바이알로 실행되도록 하십시오.
   1. 같은 방법으로 수성 층을 포함하는 튜브에 5 3/4 "파이펫을 헹굴.
5. 매번 새 파이펫을 사용하여 샘플을 초음파 처리하고 원심분리하고 분리할 때 이중 파이펫을 분리합니다. 적어도 세 번 반복하고 모든 유기 층을 풀. 유기 층을 세 번째로 제거 한 후, 유기 층을 포함하는 유리병에 두 파이펫을 세척.
6. 부드러운 질소 스트림을 사용하여 부피에 농축한 다음 PTFE 테이프로 밀봉하고 냉동실에 보관하십시오.

4. 해양 지질 클래스의 로드 TLC 분리를위한 시스템 및 단계 개발

1. TLC용 막대 준비
   1. 자동 FID 스캐너에서 로드를 세 번 스캔합니다.
   2. 샘플 발견: 원점에서 또는 바로 아래 막대에 주사기와 샘플 및 표준을 적용합니다. 0.5 μL을 분배하고 막대에 드롭을 터치합니다. 같은 자리에 다음 방울을 놓기 전에 건조시키십시오. 막대의 선에 모든 샘플을 발견합니다.
   3. 아세톤에 초점: 아세톤의 70mL에서 초점 샘플두 번 (샘플이 매우 집중되는 경우 세 번). 현물 바닥이 상단과 합쳐질 때까지 막대를 올라갈 때 용매 전면을 지켜보십시오. 막대를 제거하고 약 5 s로 말린 다음 절차를 반복하여 막대 바닥 근처의 좁은 지질 재료 밴드를 생성합니다.
   4. 5 분 동안 일정한 습도 챔버에서 막대를 건조하고 조절하십시오. 일정한 습도 챔버는 접시 아래에 염화 칼슘의 포화 용액을 가진 건조기입니다.
2. 첫 번째 크로마토그램(케톤까지 탄화수소)으로 이어지는 서열
   1. 첫 번째 개발 시스템: 첫 번째 개발 시스템은 헥산입니다 : diethyl 에테르 : 포믹 산, 98.95:1:05. 주사기를 사용하여 포믹산을 추가하지만 먼저 주사기 3× 포믹산으로 헹군다. 바로 그 후 클로로폼으로 주사기에서 포름산을 헹구십시오. 혼합물의 30mL를 사용하여 종이를 적시고 탱크를 헹노게하십시오. 헹기 용액을 버리고 나머지 70mL를 탱크에 추가합니다.
      1. 랙을 가져 와서 부드럽게 탱크로 낮춥춥습니다. 용매 전면이 샘플 반점에 도달할 때까지 지켜본 다음 타이머를 시작합니다. 25분 후, 개발 챔버에서 막대를 제거하고, 일정한 습도 챔버에서 5분 동안 건조하고, 20분 동안 동일한 용액으로 재개발한다.
   2. 자동 FID 스캐너에서 5분 동안 막대를 건조한 다음 25의 PPS 스캔을 사용하여 케톤 피크 뒤의 가장 낮은 지점으로 스캔합니다.
3. 두 번째 크로마토그램으로 이어지는 서열 (트리아실글리세롤에서 디아실리세롤) :
   1. 일정한 습도 챔버에서 5 분 동안 막대를 조건.
   2. 제2개발시스템: 제2개발시스템은 헥산:디틸 에테르:포믹산, 79:20:1이다. 개발 탱크에 ~30mL를 추가하여 종이를 적시고 탱크를 헹노게 합니다. 그런 다음 나머지 70mL에서 40 분 동안 막대를 버리고 개발합니다. 태그(포화)와 TAG(고도불포화) 봉우리 사이의 최상의 분리를 위해 79.9:20:0.1의 혼합물을 사용하지만 ST 및 DAG 피크의 분리는 79:20:1의 혼합물을 사용합니다.
   3. PPS 스캔(11)을 사용하여 두 번째 부분 스캔에서 디아실리세롤 피크 뒤의 가장 낮은 지점까지 건조하고 스캔합니다.
4. 세 번째 크로마토그램으로 이어지는 서열(아세톤-이동식 극지 지질 및 인지질)
   1. 일정한 습도 챔버에서 5 분 동안 막대를 조건.
   2. 아세톤의 70mL에서 15분 동안 두 번 막대를 개발합니다. 개발 사이에 공기는 약 30 초 동안 막대를 건조.
   3. 일정한 습도 챔버에서 5 분 동안 막대를 조건.
   4. 제3개발시스템: 제3개발시스템은 클로로폼, 메탄올, 클로로폼 추출물의 혼합물로, 50:40:10이다. 혼합물의 70mL에서 10분 동안 두 번 막대를 개발한다. 개발 사이에, 공기는 약 30 초 동안 막대를 건조.
   5. 전체 길이의 막대를 건조하고 스캔합니다.

5. MeOH에서 H₂SO_4로 명예 파생

1. 힐디치 시약 만들기
   1. 메탄올 준비: 깨끗한 볼륨 플라스크에 MeOH의 100 mL을 배치 한 다음 플라스크의 바닥이 덮일 때까지 무수성 NaSO_4에 부드럽게 뿌립니다. 일단 덮여, 메탄올의 모든 물이 NaSO_4에의해 흡수되도록 두 번 반전. 반전과 흔들림 후, 적어도 5 분 동안 앉아 보자.
   2. 산 추가: 천천히 메탄올을 유리 항아리에 데산 (현재 NaSO_4은 플라스크의 바닥에 단단한 덩어리입니다) H₂SO_4가 추가됩니다. 파이펫을 사용하여 메탄올에 1.5mL 황산을 천천히 넣습니다. 한 번에 몇 방울을 추가하고 모든 산이 추가되면 뚜껑을 뚜껑을 부드럽게 저어 섞습니다. 이제 솔루션은 파생 상품에 사용할 준비가 되었지만 매주 구성되어야 합니다.
2. 파생상품 만들기
   1. 약 200 μg의 지질을 추출 된 양으로 가져온 추출물 유리병에서 깨끗한 15 mL 유리병으로 옮기고 질소 하에서 건조하게 증발합니다. 제거된 양은 TLC/FID로부터 의 시료의 농도에 의해 결정됩니다. 깨끗한 파이펫을 사용하여 샘플을 제거합니다.
   2. 시료가 건조되면 새로 만든 힐디치 시약의 디클로로메탄 1.5mL및 3mL를 추가하십시오.
   3. 샘플을 소용돌이시키고 유리 유리병에 부착 한 지질을 제거하기 위해 4 분 동안 초음파 욕조에서 초음파 처리합니다. 유리병을 질소, 캡으로 채우고 PTFE 테이프로 밀봉하고 1시간 동안 100°C에서 가열합니다.
3. 반응 중지
   1. 오븐에서 제거 한 후 10 분 동안 샘플을 실온으로 완전히 식힌 다음 바이알을 조심스럽게 엽니다.
   2. 약 0.5mL 포화 나트륨 중탄산염 용액(9g/100mL 클로로폼 추출물), 1.5mL 헥산을 천천히 추가합니다. 유리병을 흔들거나 소용돌이쳐 두 층으로 분리되도록 방치하십시오.
4. 명예의 수집
   1. 상부층 제거: 발출이 중단되고 명확한 분리가 있으면, 상부, 유기상을 제거하고 지질 청정 2mL 바이알에 배치한다.
   2. 2mL 바이알에서 용매를 증발하여 약 0.5mL로 육사네로 재충전합니다.
   3. 유리병의 머리 공간을 질소로 채우고, 뚜껑을 씌우고, PTFE 테이프로 유리병을 밀봉하고, 지방산을 다시 중단하기 위해 또 다른 4분 동안 초음파 처리한 다음 GC로 갈 준비가 되어 있습니다.
      참고: 지방산 농도가 필요한 경우, 수성 층은 헥산으로 세 번 세척해야 하며 모든 유기층은 2mL 바이알로 풀링되어야 합니다. 여기에는 헥산 2mL를 추가하고, 시료를 소용돌이게 하고, 원심분리하고, 유기층을 제거하는 것이 포함되며, 모두 3회 반복된다.

결과

가장 빠르게 성장하는 식품 생산 부문으로서 양식업은 변화하는 요구 사항을 충족하기 위해 기술 혁신과 적응 측면에서 진화하고 있습니다. 그 중 하나는 많은 양식 종에 대 한 사료 재료를 제공 하는 야생 공급 생선 밀및 생선 기름에 대 한 의존을 줄이기 위해. 육상식물유는 아쿠아피드에서 생선기름에 대한 지속가능하고 경제적인 대체품으로 조사되고 있으며, 간은^{지질대사의}

토론

TLC-FID 시스템이 작은 샘플에서 시놉틱 지질 클래스 정보를 제공하는 속도는 TLC-FID를 해양 샘플을 선별할 수 있는 도구로 만들어 더 많은 관련 분석 절차를 착수합니다. 이러한 분석은 일반적으로 지질 추출물에서 성분 화합물의 방출을 필요로하고 가스 크로마토그래피의 경우 변동성을 증가. TLC-FID와 GC-FID가 결합된 것은 해산물 추출물 및 기타 식품^14의추출물을 위한 강력한 조?...

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
15 ml vials	VWR	66009-560
1-hexadecanol	Sigma	258741-1G
1-Monopalmitoyl-rac-glycerol	Sigma	M1640-1g
2 ml vials	VWR	46610-722
25 mm glass fibre filters	Fisher	09 874 32A
2ml pipet bulbs	VWR	82024-554
47 mm glass fibre filters	Fisher	09 874 32
5 3/4" pipets	Fisher	1367820A
9" pipets	Fisher	1367820C
Acetone	VWR	CAAX0116-1
Agilent GC-FID 6890	Agilent
Calcium Chloride ANHS 500gm	VWR	CACX0160-1
Caps for 2 ml vials	VWR	46610-712
chloroform	VWR	CACX1054-1
Cholesteryl palmitate	Sigma	C6072-1G
Chromarod S5	Shell USA	3252
Dichloromethane	VWR	CADX0831-1
DL-a-phosphatidylcholine, dipalmotoyl	Sigma	P5911-1g
Ethyl Ether, ACS grade anhydr 4L	VWR	CAEX0190-4
Glyceryl tripalmitate	Sigma	T5888-100MG
Hamilton Syringe 702SNR 25µl	Sigma	58381
Helium	Air Liquide	A0492781
Hexane	VWR	CAHX0296-1
Hydrogen regulator	VWR	55850-484
Iatroscan MK6	Shell USA
Kimwipes	Fisher	066662
Medical Air	Air Liquide	A0464563
Medium nitrile gloves	Fisher	191301597C
Nitrile gloves L	VWR	CA82013-782
Nitrogen	Air Liquide	A0464775
Nitrogen Regulator	VWR	55850-474
Nonadecane	Sigma	74158-1G
Palmitic acid	Sigma	P0500-10G
Repeating dispenser	Sigma	20943
Sodium Bicarbonate 1kg	VWR	CA97062-460
Sodium Sulfate Anhy ACS 500gr	VWR	CA71008-804
Sulfuric acid	VWR	CASX1244-5
Teflon tape	Fisher	14610120
tissue master 125 115V w/7mm homogenator	OMNI International	TM125-115
TLC development tank	Shell USA	3201
UHP hydrogen	Air Liquide	A0492788
VWR solvent repippetter	VWR	82017-766
VWR timer Flashing LED 2 channel	VWR	89140-196
Zebron ZB-Wax GC column	Phenomenex	7HM-G013-11