Determinación de clases totales de lípidos y lípidos en muestras marinas

Resumen

Este protocolo es para la determinación de lípidos en agua de mar y especímenes biológicos. Los lípidos en los filtrados se extraen con cloroformo o mezclas de cloroformo y metanol en el caso de los sólidos. Las clases de lípidos se miden mediante cromatografía de capa delgada de varilla con detección de ionización de llama y su suma da el contenido total de lípidos.

Resumen

Los lípidos están compuestos en gran parte de carbono e hidrógeno y, por lo tanto, proporcionan una mayor energía específica que otras macromoléculas orgánicas en el mar. Al ser ricos en carbono e hidrógeno, también son hidrófobos y pueden actuar como disolventes y portadores de absorción de contaminantes orgánicos y, por lo tanto, pueden ser impulsores de la bioacumulación de contaminantes en los ecosistemas marinos. Su naturaleza hidrofóbica facilita su aislamiento del agua de mar o de especímenes biológicos: el análisis de lípidos marinos comienza con el muestreo y luego la extracción en disolventes orgánicos no polares, proporcionando un método conveniente para su separación de otras sustancias en una matriz acuática.

Si se ha muestreado agua de mar, el primer paso generalmente implica la separación en facciones "disueltas" y "partículas" definidas operativamente por filtración. Se recogen muestras y se aíslan lípidos de la matriz muestral típicamente con cloroformo para materia verdaderamente disuelta y coloides, y con mezclas de cloroformo y metanol para sólidos y especímenes biológicos. Dichos extractos pueden contener varias clases de fuentes biogénicas y antropogénicas. En este momento, se pueden determinar los lípidos totales y las clases de lípidos. El lípido total se puede medir sumando clases de lípidos determinadas individualmente que habitualmente se han separado cromatográficamente. La cromatografía de capa delgada (TLC) con detección de ionización de llama (FID) se utiliza regularmente para el análisis cuantitativo de lípidos de muestras marinas. TLC-FID proporciona información de clase de lípidos sinópticos y, sumando clases, una medición total de lípidos.

La información sobre la clase de lípidos es especialmente útil cuando se combina con mediciones de componentes individuales, por ejemplo, ácidos grasos y / o esteroles, después de su liberación de extractos de lípidos. La amplia variedad de estructuras y funciones lipídicas significa que se utilizan ampliamente en la investigación ecológica y biogeoquímica que evalúa la salud de los ecosistemas y el grado de influencia de los impactos antropogénicos. Se han empleado para medir sustancias de valor dietético para la fauna marina (por ejemplo, alimentos acuícolas y / o presas), y como un indicador de la calidad del agua (por ejemplo, hidrocarburos).

Introducción

Los métodos descritos aquí se refieren a sustancias que se definen operativamente como lípidos marinos. Esta definición se basa en su capacidad para la extracción líquido-líquido en disolventes orgánicos no polares, y proporciona un método conveniente para su separación de otras sustancias en una matriz acuática. Su carácter hidrófobo facilita su aislamiento del agua de mar o de ejemplares biológicos, así como su enriquecimiento, y la eliminación de sales y proteínas.

La medición del contenido de lípidos y su composición en organismos marinos ha sido de gran interés en la ecología de la red alimentaria, la nutrición acuícola y la ciencia de los alimentos durante décadas. Los lípidos son componentes universales en los organismos vivos, que actúan como moléculas esenciales en las membranas celulares, como fuentes principales de energía biodisponible, proporcionando aislamiento térmico y flotabilidad, y sirviendo como moléculas de señalización. Aunque los procedimientos para la determinación de lípidos en otros campos se han descrito bien, su uso con muestras marinas comúnmente requiere modificaciones para adaptarse a las condiciones del campo, así como a la muestra tipo^1.

Para las muestras de agua de mar, el primer paso generalmente requiere la separación en las fracciones "disueltas" y "partículas" definidas operativamente, normalmente por filtración (paso 1 del Protocolo). La fracción de partículas es lo que retiene el filtro, y el tamaño de los poros es importante para definir el corte². A menudo, cuando estamos muestreando material particulado, nos gustaría relacionar las concentraciones de lípidos con las concentraciones de masa total, en cuyo caso se debe tomar una muestra separada y más pequeña (por ejemplo, 10 ml) para este propósito (paso 1 del Protocolo, nota). Para obtener una determinación precisa de la masa, es importante agregar formiato de amonio (35 g / L) al final de la filtración.

El filtrado de agua de mar de la muestra más grande debe ascender a entre 250 ml y 1 L dependiendo del tipo de muestra y se somete a extracción líquido-líquido en un embudo separador (paso 2 del protocolo). La naturaleza hidrofóbica de los lípidos significa que pueden separarse de otros compuestos mediante la extracción en un disolvente no polar como el cloroformo. Se crea un sistema de dos capas donde los lípidos se dividen en la capa orgánica mientras que los componentes solubles en agua permanecen en la capa acuosa.

Las muestras de partículas en un filtro, o muestras biológicas se extraen con una extracción modificada de Folch et al.³, que también involucra cloroformo (Protocolo paso 3). Una vez más, se crea un sistema orgánico / acuoso en el que los lípidos se dividen en la fase orgánica, mientras que las moléculas solubles en agua permanecen en la fase acuosa y las proteínas se precipitan. De hecho, para los sólidos, la mayoría de los laboratorios utilizan alguna variación del procedimiento de extracción de Folch et al.³ que involucra cloroformo y metanol. Para los filtros, el primer paso es homogeneizar en 2 mL de cloroformo y 1 mL de metanol.

Durante la extracción, se debe tener cuidado de proteger los lípidos de la modificación química o enzimática, manteniendo muestras y disolventes en hielo para reducir la hidrólisis del enlace éster o la oxidación de doble enlace carbono-carbono. Los tejidos y los lípidos celulares están bastante bien protegidos por antioxidantes naturales y por compartimentación⁴; sin embargo, después de la homogeneización de las muestras, los contenidos celulares se combinan haciendo que los lípidos estén más dispuestos a la alteración, química o enzimáticamente. Algunos lípidos, como la mayoría de los esteroles, son muy estables, mientras que otros, como los que contienen ácidos grasos poliinsaturados, son más susceptibles a la oxidación química. Otros, como los esteroles con dobles enlaces conjugados, son propensos a la oxidación catalizada por la luz⁵. Después de las extracciones, los lípidos son mucho más susceptibles a la oxidación química, y las muestras deben almacenarse bajo un gas inerte como el nitrógeno. También se utilizaría una corriente suave de nitrógeno para concentrar los extractos.

Después de la concentración, los lípidos normalmente se cuantificarían a granel, ya que son un componente importante de los ecosistemas marinos que proporcionan una alta concentración de energía, más del doble de kJ / g de carbohidratos y proteínas. Invariablemente se cuantificarían a continuación como componentes individuales: el análisis exhaustivo de los lípidos generalmente implica la separación en categorías más simples, de acuerdo con su naturaleza química. Por lo tanto, un análisis completo implica medir lípidos totales, clases de lípidos y compuestos individuales.

El lípido total se puede determinar tomando la suma de clases de lípidos medidas individualmente separadas por cromatografía⁶. Un extracto de lípidos marinos puede contener más de una docena de clases de fuentes biogénicas y antropogénicas. La amplia variedad de estructuras lipídicas significa que se puede obtener mucha información al determinar agrupaciones individuales de estructuras. Las clases de lípidos individualmente, o en ciertos grupos, se han utilizado para señalar la presencia de ciertos tipos de organismos, así como su estado fisiológico y actividad². También se han utilizado como un indicador de los orígenes de la materia orgánica, incluida la materia orgánica disuelta (DOM), así como los contaminantes hidrofóbicos.

Los triacilgliceroles, fosfolípidos y esteroles se encuentran entre las clases de lípidos biogénicos más importantes. Los dos primeros están relacionados bioquímicamente ya que poseen una columna vertebral de glicerol a la que se esterifican dos o tres ácidos grasos(Figura 1). Los triacilgliceroles, junto con los ésteres de cera son sustancias de almacenamiento muy importantes, mientras que otras clases de lípidos que contienen ácidos grasos, como los diacilgliceroles, los ácidos grasos libres y los monoacilgliceroles son generalmente constituyentes menores. Los ácidos grasos libres están presentes en concentraciones más bajas en los organismos vivos, ya que los insaturados pueden ser tóxicos⁷. Los esteroles (tanto en sus formas libres como esterificadas) y los alcoholes grasos también se incluyen entre los lípidos menos polares, mientras que los glicolípidos y fosfolípidos son lípidos polares. Los lípidos polares tienen un grupo hidrófilo, que permite la formación de bicapas lipídicas que se encuentran en las membranas celulares. Los esteroles libres también son componentes estructurales de la membrana, y cuando se toman en proporción a los triacilgliceroles proporcionan una condición o índice nutricional (TAG: ST) que ha sido ampliamente utilizado⁸. Cuando se toman en proporción a los fosfolípidos (ST: PL) se pueden utilizar para indicar la sensibilidad de la planta a la sal: los valores más altos mantienen la integridad estructural y disminuyen la permeabilidad de la membrana⁹. La inversa de esta relación (PL: ST) se ha estudiado en tejidos bivalvos durante la adaptación a la temperatura¹⁰.

Las clases de lípidos marinos se pueden separar mediante cromatografía de capa delgada (TLC) en varillas recubiertas de gel de sílice (Paso 4 del Protocolo) y luego detectarse y cuantificarse mediante detección de ionización de llama (FID) en un escáner FID automático. TLC/ FID se ha utilizado rutinariamente para muestras marinas, ya que proporciona rápidamente datos de clase de lípidos sinópticos de muestras pequeñas y, al tomar la suma de todas las clases, un valor para los lípidos totales. TLC/FID ha sido sometido a una evaluación de garantía de calidad (QA) y se encontró que cumple con los estándares requeridos para una calibración externa consistente, espacios en blanco bajos y análisis de réplica preciso¹¹. Los coeficientes de variación (CV) o las desviaciones estándar relativas son de alrededor del 10%, y los datos lipídicos totales del escáner FID son normalmente alrededor del 90% de los obtenidos por métodos gravimétricos y otros^{métodos 2}. La gravimetría proporciona lípidos totales más altos probablemente porque el escáner FID mide solo compuestos no volátiles, y también como resultado de la posible inclusión de material no lipídico en las mediciones gravimétricas.

La información proporcionada por el análisis de la clase de lípidos es especialmente útil cuando se combina con determinaciones de ácidos grasos como individuos, o esteroles, o los dos en combinación. El primer paso hacia estos análisis implica la liberación de todos los ácidos grasos componentes junto con los esteroles en los extractos de lípidos (Protocolo paso 5). La amplia variedad de estructuras y funciones lipídicas significa que han visto un amplio uso en estudios ecológicos y biogeoquímicos que evalúan la salud de los ecosistemas y la medida en que han sido influenciados por insumos antropogénicos y terrestres. Se han utilizado para medir la biosíntesis de sustancias de valor dietético para la fauna marina, así como para indicar la calidad de las muestras de agua. La medición de lípidos en muestras de núcleos de sedimentos ayuda a mostrar la sensibilidad de los sedimentos a los cambios en el uso humano de la tierra cerca del margen tierra-mar.

La herramienta principal para identificar y cuantificar compuestos lipídicos individuales ha sido tradicionalmente la cromatografía de gases (GC) con FID. Sin embargo, antes del análisis, estos compuestos se hacen más volátiles por derivatización. Los ácidos grasos se liberan en presencia de un catalizador ácido (H₂SO₄) de las clases de lípidos de acilo (Figura 1). En química orgánica, el grupo acilo (R-C = O) generalmente se deriva de un ácido carboxílico (R-COOH). Luego se vuelven a esterificar a ésteres metílicos de ácidos grasos (FAME), lo que proporciona mejores separaciones en las columnas GC (Paso 5 del protocolo).

Protocolo

NOTA: Para limpiar cristalería, instrumentos y filtros para análisis de lípidos, lávelos 3 veces con metanol seguido de 3 lavados con cloroformo, o caliécelos a 450 ° C durante al menos 8 horas.

1. Procedimiento de filtración para lípidos disueltos y particulados de agua de mar

NOTA: La fracción particular de interés está definida operativamente por el procedimiento de filtración. En este caso el tamaño de los poros es de 1,2 μm.

1. Configure el colector de filtración sin filtro y enjuague la configuración con agua de mar filtrada.
2. Con fórceps limpios, coloque un filtro de fibra de vidrio (GF/C) de 47 mm, que haya sido lavado, en el sistema de filtración limpio.
3. Tome la muestra y gire suavemente para volver a colocar cualquier material que pueda haberse asentado en el fondo del recipiente de recolección. Mida con precisión un volumen conocido, en este caso 1 L, y filtre esto a través del filtro.
   NOTA: El volumen dependerá de la cantidad de material particulado en la muestra: generalmente entre 250 mL y 5 L dependiendo de la temporada y la ubicación.
4. Cuando se haya medido la muestra, humedezca suavemente el filtro con agua de mar filtrada. Agregue toda la muestra lentamente al sistema de filtración y enjuague el cilindro graduado con agua de mar filtrada para asegurarse de que todas las partículas se agreguen al filtro. Enjuague la configuración con agua de mar filtrada en los lados para asegurarse de que todas las partículas se enjuaguen en el filtro.
   1. Permita que toda el agua de mar pase a través del filtro, pero no permita que el filtro se seque por completo, ya que puede interrumpir las células del filtro; romper la succión cuando desaparece la última parte del agua.
5. Usando torzas limpias y una pipeta limpia, doble el filtro por la mitad, luego en tercios y luego por la mitad a lo largo para enrollar el filtro en un tubo. Colóquelo en un vial de vidrio de 10 ml limpio y etiquetado.
6. Cubra el filtro con 2 ml de cloroformo. Llene el espacio de la cabeza con nitrógeno y selle con cinta de PTFE. Colocar en una rejilla en un congelador de -20 °C. Las muestras serán estables a esta temperatura hasta un año.
   NOTA: Para relacionar las concentraciones de lípidos con las concentraciones de masa total, también se necesita una medición del peso seco. Esto implica colocar un filtro prepesado de 24 mm en una configuración de filtración de peso seco, agitar la muestra y tomar una pequeña submuestra que se filtra en el filtro pequeño. Cuando el filtro está casi seco, se agregan aproximadamente 10 ml de formiato de amonio al 3.5% al filtro. El filtro se dobla por la mitad, se devuelve a una placa de Petri etiquetada y se coloca en un congelador.

2. Extracción líquido-líquido de agua de mar o muestras líquidas

1. Preparación de la muestra
   1. Mida un volumen conocido de filtrado en un cilindro graduado de vidrio limpio con lípidos. Coloque esta muestra en un embudo separador limpio de 1 L. Luego agregue 20 ml de cloroformo a la muestra y agite durante 2 minutos, ventilando con frecuencia.
2. Eliminación del primer extracto y adición de ácido después de la primera separación
   1. Envuelva el embudo en papel de aluminio y espere de 5 a 10 minutos para que ocurra la separación. Retire la parte inferior de la lámina para ver las dos capas. Recoja la capa orgánica inferior a través de la llave de paso en un matraz de fondo redondo limpio, teniendo cuidado de no incluir ninguna de las capas superiores. Tapa el matraz de fondo redondo bajo nitrógeno y colócase en el congelador.
   2. Agregue 0.25 ml de H₂SO₄ concentrado por cada litro de muestra, a la muestra en el embudo separador y agite el embudo suavemente.
   3. Agregue 10 ml de cloroformo y agite vigorosamente durante 2 minutos mientras ventila con frecuencia. Permita que se produzca la separación.
3. Segunda y tercera separación
   1. Espere la separación y agregue la capa inferior en el matraz de fondo redondo.
   2. Agregue un tercio de 10 ml de cloroformo y agite durante 2 minutos, ventilando nuevamente con frecuencia. Después de la separación, agregue la capa inferior al matraz de fondo redondo.
   3. Transfiera el extracto en el matraz de fondo redondo a un evaporador rotativo, evapore y transfiera a un vial de 2 ml.

3. Protocolo de extracción de sólidos (extracción modificada de Folch et al.³⁾

1. Arreglo
   NOTA: La configuración de extracción requiere un recipiente aislado lleno de hielo. Los disolventes incluyen metanol, agua extraída de cloroformo y cloroformo 2:1:metanol. Todos los disolventes deben colocarse sobre hielo para que estén fríos en el momento en que se inician las extracciones. Las muestras también van sobre hielo, por lo que todo permanece frío.
   1. Enjuague todos los tubos y tapas forradas de PTFE 3 veces con metanol y luego 3 veces con cloroformo. Se necesita un tubo de centrífuga y un vial de 15 ml con tapa para cada extracción.
   2. Coloque la muestra en un tubo de centrífuga que contenga 2 ml de cloroformo. El tamaño de la muestra depende de la cantidad de lípido presente, aproximadamente 5 a 10 mg de lípido preferido.
2. Molienda y extracción
   1. Agregue aproximadamente 1 ml de metanol helado y muela la muestra en una pulpa rápidamente con un homogeneizador limpio o una varilla de PTFE / metal.
   2. Lave la varilla de nuevo en el tubo con aproximadamente 1 ml de cloroformo 2:1 helado: metanol y luego con 1/2 ml de agua extraída de cloroformo helado. Si es necesario, use un juego limpio de pórceps para forzar que las partículas vuelvan al vial antes de lavarlas. Tapar el tubo y sonicar la mezcla durante 4 minutos en un baño ultrasónico (35 - 42 kHz).
3. Doble pipeteo:Centrifugar la muestra durante 2 min a 1800 × g. Recoge toda la capa orgánica (capa inferior) utilizando la técnica de doble pipeteo en la que una pipeta de 5 3/4" con la bombilla encendida se empuja suavemente a través de las dos capas, mientras se apreta la bombilla, haciendo que salgan burbujas.
   1. Cuando se alcance la parte inferior de la segunda capa, use el pulgar para quitar la bombilla sin dibujar la capa orgánica en la pipeta. Coloque una pipeta de 9" dentro de la de 5 3/4" y retire la capa inferior a través de la pipeta de 5 3/4".
   2. Coloque el extracto en un vial limpio. Continúe quitando la capa inferior hasta que se elimine todo.
4. Pipetasde lavado: Enjuague la pipeta de 9" en el vial que contiene la capa orgánica utilizando 1,5 ml de cloroformo helado para lavar el exterior de la pipeta y 1,5 ml para lavar el interior. Gire suavemente esa pipeta mientras lava y asegúrese de que todo el cloroformo corra por la pipeta en un vial.
   1. Enjuague la pipeta de 5 3/4" en el tubo que contiene la capa acuosa de la misma manera.
5. Sonicar y centrifugar las muestras y doble pipeta cuando se separan, utilizando pipetas nuevas cada vez. Repita al menos tres veces y auna todas las capas orgánicas. Después de retirar la capa orgánica por tercera vez, lave ambas pipetas en el vial que contiene la capa orgánica.
6. Usando una corriente suave de nitrógeno, concéntrese hasta el volumen, luego selle con cinta de PTFE y guárdelo en un congelador.

4. Desarrollo de sistemas y pasos para la separación de TLC de varillas de clases de lípidos marinos

1. Preparación de las varillas para TLC
   1. Escanee en blanco las varillas en el escáner FID automático tres veces
   2. Detección de una muestra:Aplique muestras y estándares con una jeringa a las varillas en o justo debajo del origen. Dispensar 0,5 μL y tocar la gota en la varilla. Dejar secar antes de colocar la siguiente gota en el mismo lugar. Detecte todas las muestras en una línea en varillas.
   3. Enfoque en acetona:Enfocar muestras dos veces (tres veces si las muestras están muy concentradas) en 70 mL de acetona. Observe el frente del disolvente mientras sube la varilla hasta que la parte inferior del punto se fusiona con la parte superior. Retire las varillas, séquelas durante unos 5 s, luego repita el procedimiento para producir una banda estrecha de material lipídico cerca de la parte inferior de la varilla.
   4. Secar y acondicionar las varillas en una cámara de humedad constante durante 5 min. Una cámara de humedad constante es un desecador con una solución saturada de cloruro de calcio debajo de la placa.
2. Secuencia que conduce al primer cromatograma (hidrocarburo a cetona)
   1. Primer sistema de desarrollo:El primer sistema de desarrollo es hexano:dietil éter:ácido fórmico, 98.95:1:0.05. Use una jeringa para agregar el ácido fórmico, pero primero enjuague la jeringa 3× con ácido fórmico. Enjuague el ácido fórmico de la jeringa inmediatamente después con cloroformo. Use 30 ml de la mezcla para mojar el papel y enjuagar el tanque. Deseche la solución de enjuague y agregue los 70 ml restantes al tanque.
      1. Tome los bastidores y baje suavemente en el tanque. Observe hasta que el frente del disolvente llegue a los puntos de la muestra, luego inicie el temporizador. Después de 25 min, retire las varillas de la cámara de desarrollo, séque en la cámara de humedad constante durante 5 min y vuelva a desarrollar en la misma solución durante otros 20 min.
   2. Seque las varillas durante 5 minutos en el escáner FID automático y luego escanee hasta el punto más bajo detrás del pico de cetonas utilizando un escaneo PPS de 25.
3. Secuencia que conduce al segundo cromatograma (triacilglicerol a diacilglicerol):
   1. Acondicionar las varillas durante 5 min en la cámara de humedad constante.
   2. Segundo sistema de desarrollo:El segundo sistema de desarrollo es hexano:dietil éter:ácido fórmico, 79:20:1. Agregue ~ 30 ml al tanque de desarrollo para mojar el papel y enjuagar el tanque. Luego deseche y desarrolle las varillas durante 40 minutos en los 70 ml restantes. Para la mejor separación entre los picos TAG (saturado) y TAG (poliinsaturado) use una mezcla de 79.9: 20: 0.1, pero para la separación de los picos ST y DAG use una mezcla de 79: 20: 1.
   3. Seque y escanee hasta el punto más bajo detrás del pico de diacilglicerol en una segunda exploración parcial utilizando una exploración PPS 11.
4. Secuencia que conduce al tercer cromatograma (lípido polar móvil de acetona y fosfolípido)
   1. Acondicione las varillas durante 5 minutos en la cámara de humedad constante.
   2. Desarrolle las varillas dos veces durante 15 minutos en 70 ml de acetona. Entre los desarrollos, seque al aire las varillas durante unos 30 segundos.
   3. Acondicione las varillas durante 5 minutos en la cámara de humedad constante.
   4. Tercer sistema de desarrollo:El tercer sistema de desarrollo es una mezcla de cloroformo, metanol y agua extraída de cloroformo, 50:40:10. Desarrolle las varillas dos veces durante 10 minutos en 70 ml de la mezcla. Entre los desarrollos, seque al aire las varillas durante unos 30 segundos.
   5. Seque y escanee toda la longitud de las varillas.

5. Derivatización FAME con H₂SO₄ en MeOH

1. Fabricación del reactivo Hilditch
   1. Preparación del metanol:Coloque 100 ml de MeOH en un matraz aforado limpio y luego espolvoree suavemente en NaSO₄ anhidro hasta que se cubra el fondo del matraz. Una vez cubierto, invierta dos veces para que cualquier agua en el metanol sea absorbida por el NaSO_4. Después de invertir y agitar, déjelo reposar durante al menos 5 minutos.
   2. Adición del ácido:Decantar lentamente el metanol en un frasco de vidrio (por ahora el NaSO₄ es un bulto duro en el fondo del matraz) y se agrega el H₂SO_4. Agregue lentamente 1.5 ml de ácido sulfúrico al metanol usando una pipeta. Agregue unas gotas a la vez y una vez que se haya agregado todo el ácido, tapa y revuelva suavemente para mezclar. La solución ya está lista para ser utilizada para derivados, pero debe ser compuesta semanalmente.
2. Hacer los derivados
   1. Transfiera aproximadamente 200 μg de lípidos de un vial de extracto que ha tenido el volumen llevado a una cantidad conocida, en un vial limpio de 15 ml y evapore bajo nitrógeno a sequedad. La cantidad extraída se determinará por la concentración de la muestra de TLC/FID. Use una pipeta limpia para extraer la muestra.
   2. Cuando la muestra se haya secado, agregue 1,5 ml de diclorometano y 3 ml del reactivo Hilditch recién hecho.
   3. Vórtice la muestra y sonicé la muestra en un baño ultrasónico durante 4 minutos para eliminar los lípidos que se han adherido al vial de vidrio. Llene el vial con nitrógeno, tapa y séllelo con cinta de PTFE y caliente a 100 ° C durante 1 hora.
3. Detener la reacción
   1. Deje que las muestras se enfríen completamente a temperatura ambiente durante 10 minutos después de retirar las muestras del horno, luego abra los viales con cuidado.
   2. Agregue lentamente aproximadamente 0,5 ml de solución saturada de bicarbonato de sodio (9 g/100 ml de agua extraída del cloroformo), luego 1,5 ml de hexano. Agite o vórtice el vial, luego deje reposar para que se separe en 2 capas.
4. Recogiendo los FAME's
   1. Extracción de la capa superior:Una vez detenida la derivatización, y haya una separación clara, retire la fase orgánica superior y colóquela en un vial de 2 ml de limpieza lipídica.
   2. Evaporar el disolvente en el vial de 2 ml hasta que se seque y rellenarlo con hexano a aproximadamente 0,5 ml.
   3. Llene el espacio de la cabeza del vial con nitrógeno, tape y selle el vial con cinta de PTFE, sonice durante otros 4 minutos para volver a suspender los ácidos grasos, y luego estará listo para ir al GC.
      NOTA: Si se requieren concentraciones de ácidos grasos, la capa acuosa debe lavarse tres veces con hexano y todas las capas orgánicas agrupadas en el vial de 2 ml. Esto implica agregar 2 ml de hexano, vórtice la muestra, centrifugar y eliminar la capa orgánica, todo repetido 3 veces.

Resultados

Como el sector de producción de alimentos de más rápido crecimiento, la acuicultura está evolucionando en términos de innovaciones tecnológicas y adaptaciones para satisfacer los requisitos cambiantes. Una de ellas es reducir la dependencia de la harina y el aceite de pescado de origen silvestre, que proporcionan ingredientes de alimentación para muchas especies acuícolas. Los aceites vegetales terrestres están siendo investigados como reemplazos sostenibles y económicos para el aceite de pescado en los aliment...

Discusión

La velocidad con la que el sistema TLC-FID proporciona información de clase de lípidos sinópticos a partir de muestras pequeñas hace que TLC-FID sea una herramienta capaz para examinar muestras marinas antes de emprender procedimientos analíticos más complicados. Tales análisis generalmente requieren la liberación de compuestos componentes de extractos de lípidos y derivatización para aumentar la volatilidad en el caso de la cromatografía de gases. Se ha encontrado que TLC-FID combinado con GC-FID es una poder...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
15 ml vials	VWR	66009-560
1-hexadecanol	Sigma	258741-1G
1-Monopalmitoyl-rac-glycerol	Sigma	M1640-1g
2 ml vials	VWR	46610-722
25 mm glass fibre filters	Fisher	09 874 32A
2ml pipet bulbs	VWR	82024-554
47 mm glass fibre filters	Fisher	09 874 32
5 3/4" pipets	Fisher	1367820A
9" pipets	Fisher	1367820C
Acetone	VWR	CAAX0116-1
Agilent GC-FID 6890	Agilent
Calcium Chloride ANHS 500gm	VWR	CACX0160-1
Caps for 2 ml vials	VWR	46610-712
chloroform	VWR	CACX1054-1
Cholesteryl palmitate	Sigma	C6072-1G
Chromarod S5	Shell USA	3252
Dichloromethane	VWR	CADX0831-1
DL-a-phosphatidylcholine, dipalmotoyl	Sigma	P5911-1g
Ethyl Ether, ACS grade anhydr 4L	VWR	CAEX0190-4
Glyceryl tripalmitate	Sigma	T5888-100MG
Hamilton Syringe 702SNR 25µl	Sigma	58381
Helium	Air Liquide	A0492781
Hexane	VWR	CAHX0296-1
Hydrogen regulator	VWR	55850-484
Iatroscan MK6	Shell USA
Kimwipes	Fisher	066662
Medical Air	Air Liquide	A0464563
Medium nitrile gloves	Fisher	191301597C
Nitrile gloves L	VWR	CA82013-782
Nitrogen	Air Liquide	A0464775
Nitrogen Regulator	VWR	55850-474
Nonadecane	Sigma	74158-1G
Palmitic acid	Sigma	P0500-10G
Repeating dispenser	Sigma	20943
Sodium Bicarbonate 1kg	VWR	CA97062-460
Sodium Sulfate Anhy ACS 500gr	VWR	CA71008-804
Sulfuric acid	VWR	CASX1244-5
Teflon tape	Fisher	14610120
tissue master 125 115V w/7mm homogenator	OMNI International	TM125-115
TLC development tank	Shell USA	3201
UHP hydrogen	Air Liquide	A0492788
VWR solvent repippetter	VWR	82017-766
VWR timer Flashing LED 2 channel	VWR	89140-196
Zebron ZB-Wax GC column	Phenomenex	7HM-G013-11