تعميم خطوط الخلايا السرطانية: أداة مبتكرة للبحوث الأساسية والترجمة

Summary

يسمح زرع CTCs بتوصيف وظيفي أعمق للسرطان ، من خلال قياس تعبير علامة محددة ، وتقييم مقاومة الدواء والقدرة على استعمار الكبد من بين إمكانيات أخرى. وعموما، يمكن أن تكون ثقافة لجنة مكافحة الإرهاب أداة سريرية واعدة للطب الشخصي لتحسين نتائج المرضى.

Abstract

الانبثاث هو السبب الرئيسي للوفاة بالسرطان. على الرغم من التحسينات في استراتيجيات العلاج، فإن السرطان النقيلي لديه تشخيص ضعيف. وبالتالي فإننا نواجه حاجة ملحة لفهم الآليات الكامنة وراء تطور الانبثاث، وبالتالي اقتراح علاجات فعالة للسرطان المتقدم. من الصعب علاج السرطانات النقيلية ، حيث أن الخزعات غازية ولا يمكن الوصول إليها. في الآونة الأخيرة ، كان هناك اهتمام كبير في الخزعات السائلة بما في ذلك كل من حمض deoxyribonucleic المتداول الخالي من الخلايا (DNA) وتعميم الخلايا السرطانية من الدم المحيطي وأنشأنا العديد من خطوط الخلايا السرطانية المتداولة من مرضى سرطان القولون والمستقيم النقيلي للمشاركة في توصيفها. في الواقع، لوصف هذه الخلايا النادرة وغير الموصوفة بشكل جيد، فإن الخطوة الحاسمة هي توسيعها. بمجرد تأسيسها ، يمكن بعد ذلك زراعة خطوط الخلايا السرطانية المتداولة (CTC) في ظروف التعليق أو التمسك. وعلى المستوى الجزيئي، يمكن استخدام خطوط CTC لتقييم التعبير عن علامات محددة ذات أهمية (مثل التمايز أو الخلايا الجذعية الظهارية أو السرطانية) عن طريق التحليل المناعي أو تحليل قياس الخلايا. بالإضافة إلى ذلك، يمكن استخدام خطوط CTC لتقييم حساسية الأدوية للعلاج الكيميائي القياسي الذهبي وكذلك للعلاجات المستهدفة. ويمكن أيضا اختبار قدرة خطوط لجنة مكافحة الإرهاب على بدء الأورام عن طريق الحقن تحت الجلد من CTCs في الفئران المناعية.

وأخيرا، من الممكن اختبار دور جينات محددة ذات أهمية قد تشارك في نشر السرطان عن طريق تحرير جينات CTC، عن طريق حمض ريبونوكليك دبوس الشعر القصير (shRNA) أو Crispr/Cas9. وبالتالي يمكن حقن CTCs المعدلة في طحال الفئران المناعية ، لمحاكاة جزء من عملية التطوير النقيلي في الجسم الحي.

في الختام، خطوط CTC هي أداة ثمينة للبحوث المستقبلية والطب الشخصي، حيث أنها سوف تسمح التنبؤ بكفاءة العلاج باستخدام الخلايا نفسها التي هي في الأصل مسؤولة عن الانبثاث.

Introduction

على الرغم من التحسينات الأخيرة في التشخيص المبكر للسرطان وفي الاستراتيجية العلاجية ، لا يزال أكثر من تسعين في المئة من مراضة السرطان بسبب الانبثاث^1. العملية النقيلية هي سلسلة متعددة الخطوات تبدأ بالانفصال المحلي للخلايا عن الورم الأساسي ودخولها إلى مجرى الدم حيث تصبح خلايا ورم متداولة (CTCs) لاستعمار مواقع بعيدة في النهاية مثل الكبد والرئتين ، في حالة سرطان القولون والمستقيم (CRC)². في الآونة الأخيرة ، كان هناك اهتمام متزايد بال خزعات السائل ، والتي هي أداة غير الغازية للكشف بشكل ملحوظ وعدد CTCs من عينات دم المريض. التغايرية الوراثية داخل الرحم هو سبب رئيسي لمقاومة المخدرات. وبالتالي، عزل الخلايا التمثيلية من مادة الورم يشكل أداة واعدة للطب الشخصي³.

على الرغم من انخفاض وتيرة CTCs في الدم (1 CTC لكل 10⁶ -^{10 7} الكريات البيض)⁴، تم تطوير العديد من تقنيات الكشف والعزل على أساس اختلافات الممتلكات بين CTCs والمكونات الأخرى للدم⁵. عدد CTCs في عينات دم المريض، وحدها، يمكن أن توفر معلومات عن مرحلة الأورام الخبيثة، والاستجابة للعلاج وتطور المرض^6،7. وبالتالي، فإن عزلة CTC هي أداة حاسمة للدراسات التحويلية لتقييم التغاير الوراثي أو إجراء فحص الأدوية، وكذلك للدراسات الأساسية لتوصيف هذه الخلايا الغازية، لأنها الجهات الفاعلة الرئيسية في الحث النقيلي^8،9. في الواقع ، بالمقارنة مع خطوط الخلايا السرطانية الراسخة تجاريا التي تراكمت الآلاف من الطفرات مع مرور الوقت ، تشترك CTCs الطازجة في السمات الرئيسية للورم الأساسي الأصلي بما في ذلك القدرة القوية على الانبثاث ، وهي انعكاس أفضل للمرض. هذه الميزات تجعلها أداة قوية للدراسات الأساسية ، وخاصة في تجارب خروج المغلوب من العوامل الرئيسية المتوقعة المشاركة في الانبثاث. يمكن التحقق من نتائج هذه التجارب في الجسم الحي، على الفئران ، كما هو موضح أدناه.

بمجرد عزل CTCs ، يمكن توسيعها في ظروف الثقافة غير الملتزمة ومن ثم ، يمكن التلاعب بها تماما مثل أي خط خلايا سرطان متاح ، أي يمكن استزراعها على قدم المساواة في ظروف التمسك أو تضمينها في Matrigel ، اعتمادا على السؤال العلمي¹⁰. على سبيل المثال، لاختبار التعبير عن البروتين ذي الاهتمام وتوطينه، يمكن زراعة مجالات CTC في حالة تعليق وتضمينها في Histogel لأداء الفلورة المناعية على أقسام المجال. بالإضافة إلى ذلك ، إذا كان البروتين ميمبرانوس ، يمكن قياس تعبيره على الخلايا الحية عن طريق القياس الخلوي.

للدراسات الوظيفية، لاختبار دور البروتين من الفائدة التي قد تلعب دورا في استعمار الكبد، CTCs مع الجينات تحريرها، من قبل shRNA أو CRISPR/Cas9، يمكن حقنها في طحال الفئران المناعية. هذه التجربة الأخيرة هي نموذج قوي لمحاكاة استعمار انبثاث الكبد¹¹.

يمكن تقييم قدرة CTCs على بدء الأورام عن طريق حقن عدد قليل جدا من الخلايا في الفئران التي تعاني من نقص المناعة. كما بدء الورم هو السمة المميزة للخلايا الجذعية السرطانية (CSCs) هذا الفحص سوف تشير إلى النسبة المئوية للCSCs داخل خطوط CTC. هذا النمط الظاهري للخلايا الجذعية يجعل خطوط الخلايا السرطانية المتداولة مقاومة لبعض علاجات السرطان ذات المعيار الذهبي. ولذلك يمكن استخدام أجهزة CTCs الموسعة لفحص الأدوية وتحديد أفضل علاج فعال محتمل للمريض؛ ويمكن اختبار استجابة لجنة مكافحة الإرهاب للعلاج في المختبر باستخدام اختبار قابلية البقاء على الاشتعال، على سبيل المثال.

ومن منظور طويل الأجل، يمكن استخدام فحص الأدوية على أجهزة CTCs المعزولة والمتضخمة حديثا كأداة جديدة للطب الشخصي للمساعدة في اختيار العلاج الأكثر كفاءة وتكييفا للمرضى.

في هذه الورقة، يتم تفصيل بروتوكولات لخطوط CTC الثقافة، لتلطيخ بروتينات محددة عن طريق التصبغ المناعي والقياس الخلوي، لإجراء اختبارات السمية الخلوية وكذلك في تجارب فيفو زينوغرافت مع CTC.

Protocol

تمت الموافقة على جميع بروتوكولات الجسم الحي من قبل الوكالات الأخلاقية الحيوانية.

1. مكافحة الإرهاب التضخيم في ظروف الثقافة 3D

1. زراعة CTCs في التعليق، CTCs البذور الأولى في آبار مرفق منخفض جدا (ULA) 24-جيدا لوحة في تركيز أقصى من 5 خلايا / ميكرولتر وإلى 1 مل من M12 المتوسطة (أي، متقدمة DMEM-F12 تستكمل مع 2 م ل الجلوتامين, 100 وحدة / مل البنسلين والستريبتوميسين, N2 الملحق, 20 نانوغرام / مل عامل نمو البشرة و 10 نانوغرام / مل عامل نمو الخلايا الليفية¹⁰).
2. للسماح بتشكيل الكرة وتوسيع الخلية، واحتضان الخلايا في ظروف نقص الأكز (2٪ O₂) بين 6 إلى 10 أيام.
3. مرة واحدة في المجالات كبيرة بما يكفي (100 ميكرومتر)، لمنع نخر، وتفكيك لهم لتضخيم.
   1. ضع تعليق الخلية في أنبوب سعة 2 مل أو أنبوب 15 مل ومطرد مركزي عند 300 × ز لمدة 5 دقائق.
   2. إزالة supernatant وإضافة 500 ميكرولتر من كاشف الفصام لطيف (على سبيل المثال، Accumax) إلى بيليه.
   3. دوامة بلطف واحتضان تعليق الخلية مع كاشف فصاشف لطيف لمدة 20 إلى 30 دقيقة في 37 درجة مئوية.
      ملاحظة: تجاوز وقت الحضانة في كاشف التفكك اللطيف (Accumax) قد يسبب زيادة غير طبيعية في وفيات الخلايا.
   4. أضف 1.5 مل من ملح الفوسفات العازل (PBS) واطرد الأنبوب لمدة 5 دقائق عند 300 × ز.
   5. صب قبالة supernatant وإعادة إنفاق بيليه في المتوسط M12 الطازجة للوصول إلى كثافة 1-5 خلايا لكل ميكرولتر.
   6. زرع تعليق الخلية في آبار جديدة من لوحة مرفق منخفضة للغاية: 10 مل لقوارير T75، و2 مل ل 6 لوحات بئر و100 ميكرولتر ل 96 لوحة بئر

2. Immuno-Fluorescence (IF) تلطيخ على أقسام كرة مكافحة الإرهاب

1. الطارد المركزي CTC المجالات في أنبوب 15 مل في 300 × ز لمدة 5 دقائق، يستنشق supernatant، وغسل بيليه مرتين مع برنامج تلفزيوني.
2. إعادة إنفاق بيليه مع 500 ميكروغرام من 4٪ بارافورمالديهايد (PFA) واحتضان لمدة 20 دقيقة على الجليد. الطرد المركزي تعليق في 300 × ز ويغسل مرتين مع 5 مل من برنامج تلفزيوني.
3. Resuspend بيليه مع (أي 15 إلى 20 ميكرولتر) هيستوجيل الساخنة والسائلة. مع ماصة، واتخاذ كل تعليق وجعل قطرة على سطح مبردة مسبقا في 4 درجة مئوية والسماح لها البلمرة لمدة 5 إلى 10 دقائق.
   ملاحظة: العمل بسرعة لتجنب بلمرة التعليق في تلميح.
4. فصل قطرة صلبة مع شفرة مشرط وإدراجه في كاسيت تضمين مجزأة.
5. قم بتنفيذ الخطوات التالية: إدراج البارافين، وتقسم البارافين، والإماهة المقطعية، واسترجاع المستضد، واحتضان الأجسام المضادة. هذه الخطوات هي نفسها بالنسبة لأي ورم أو عضو جزءا لا يتجزأ من البارافين ومعالجتها لتلطيخ immunofluorescence¹².
   ملاحظة: يمكن تخزين الكاسيت في الإيثانول بنسبة 70٪ عند درجة حرارة 4 درجات مئوية حتى تضمين البارافين.

3. تحليل قياس الخلايا

1. الطارد المركزي CTC المجالات في أنبوب 15 مل في 300 × ز لمدة 5 دقائق وغسل بيليه مرتين مع برنامج تلفزيوني.
2. يستنشق supernatant وإضافة 500 ميكرولتر من كاشف الفصام لطيف إلى بيليه.
3. دوامة بلطف واحتضان تعليق الخلية مع كاشف الفصام لطيف لمدة 20 إلى 30 دقيقة في 37 درجة مئوية.
   ملاحظة: تجاوز 40 دقيقة من الحضانة في كاشف التفكك لطيف (Accumax) قد يؤدي إلى زيادة غير طبيعية في وفيات الخلايا.
4. الطرد المركزي تعليق الخلية لمدة 5 دقائق في 300 × ز، والقضاء على supernatant وإعادة إنفاق بيليه في 5 مل من العازلة حجب (أي، PBS مع 1٪ ألبوم مصل البقر (BSA)).
5. تمرير تعليق الخلية من خلال مصفاة الخلية 40 ميكرومتر للقضاء على المجالات المتبقية.
6. بعد العد، ضع 200,000 خلية في ثلاثة أنابيب لفرز الخلايا المنشطة بالفلور (FACS)، والطرد المركزي على 300 × ز لمدة 5 دقائق وإزالة النافورة. استخدام واحد من أنبوب FACS الثلاثة كعنصر تحكم لن تتلقى أي الكواشف تلطيخ.
7. وفقا لصحيفة البيانات، إضافة الأجسام المضادة المناسبة في اثنين من أنابيب FACS المتبقية (أي، واحد الأجسام المضادة المترافقة ضد البروتين من الفائدة، واحد التحكم متساوي النمط المترافق).
8. بعد وقت الحضانة الموصى به، أضف 300 ميكرولتر من حاجز الحجب لغسل الخلايا، واطرد المركزي الأنابيب الثلاثة عند 300 × ز، ونسخ الناطور. كرر هذه الخطوة مرتين. ثم، إعادة إنفاق بيليه مع العازلة حجب مع كاشف تلطيخ صلاحية الخلية (باستثناء التحكم أنبوب FACS دون أي تلطيخ).
9. إبقاء الأنابيب على الجليد حتى تحليل FACS. استخدم الأنبوب أولا دون تلطيخ لتحديد البوابة لعدم قدرة الخلية على البقاء وتلطيخ الأجسام المضادة. ثم تحليل أنبوب FACS مع الأجسام المضادة المقترنة ضد البروتين من الفائدة، لتحديد النسبة المئوية للجنة مكافحة الإرهاب التعبير عن البروتين من الفائدة. يجب ألا يشير أنبوب FACS مع التحكم المقترن بالنمط المتساوي إلى حدوث تحول. وهذا يؤكد أن التحول هو محدد للبروتين المستهدفة من الفائدة.
   ملاحظة: إذا كان ذلك ممكنا، استخدم خط الخلية الذي يعبر عن مستوى عال من البروتين من الفائدة كعنصر تحكم إيجابي وخط الخلية التي لا تعبر عن البروتين كعنصر تحكم سلبي.

4. فحص قابلية البقاء على الاشتعال (CellTiter-Glo)

1. إعادة التشبيه فصل CTCs (كما هو موضح في القسم 1.4.5) في M12 المتوسطة. عد الخلايا وتكييف تركيز الخلية إلى 200،000 خلية / مل.
2. في لوحة ULA 96-well، البذور 10،000 CTCs فصل لكل بئر، في 50 ميكرولتر، واحتضان لوحة في نقص الأكسيجة (2٪ O₂) لمدة 24 ساعة.
3. في اليوم التالي، إضافة 50 ميكرولتر من المخدرات اختبارها إلى CTCs. من المستحسن سابقا إجراء المعايرة لتركيز الدواء ، لتحديد تركيز مثبط نصف الحد الأقصى (IC50). علاج بعض الآبار مع السيارة فقط لتحديد صلاحية الخلية القاعدية.
   ملاحظة: قد يختلف عدد الخلايا المصنفة بين أسطر CTC، اعتمادا على وقت مضاعفة. بالإضافة إلى ذلك، يجب أن تزرع الخلايا في ثلاث نسخ لتقليل تقلب النتائج.
4. احتضان لوحات في نقص الأكسيا لمدة 48 ساعة أخرى.
5. في اليوم 3، ضع اللوحات المستزرعة وحاجز قابلية بقاء الخلية التلألؤ والركيزة في درجة حرارة الغرفة وإعادة تشكيل الركيزة مع حجم مناسب من العازلة، وفقا لبروتوكول الشركة المصنعة.
6. إضافة 70 ميكرولتر من مزيج قابلية البقاء التلألؤ في كل لوحة مثقفة جيدا. ضع لوحات على شاكر مداري لمدة 20 دقيقة للحث على تحلل الخلية ثم نقل 100 ميكرولتر من المزيج إلى لوحة متعددة الآبار مبهمة الجدران ، متوافقة مع مقياس الإنارة.
7. السماح للوح للراحة في درجة حرارة الغرفة، وتغطية ذلك مع رقائق الألومنيوم من أجل تحقيق الاستقرار في إشارة الإنارة.
   ملاحظة: إشارة الإنارة مستقرة لمدة تصل إلى 3 ساعات.
8. سجل التلألؤ باستخدام قارئ microplate (أي، Tecan Infinite 200 برو).
9. لتحليل البيانات، احسب متوسط وحدة الضوء النسبي ثلاثية الطبيعة RLU لكل حالة. لتقييم النسبة المئوية لقابلية البقاء وفقا لكل تركيز المخدرات اللازمة: (RLU من الخلايا المعالجة / RLU من الخلايا غير المعالجة) × 100.

5. الحقن تحت الجلد

1. في أنبوب الطرد المركزي الدقيق، إعادة إنفاق الخلايا في 100 ميكرولتر من برنامج تلفزيوني معقم. إذا كان عدد الخلايا المحقونة منخفضا ، فإن خلايا إعادة الإنفاق في 1:1 PBS / Matrigel ، تنخفض في عوامل النمو ، لتركيز الخلايا معا وتعزيز بدء الورم.
   ملاحظة: يمكن أن تكون كثافة الخلية من 10 خلايا (لتحدي قدرة بدء الورم) إلى مليون من الخلايا اعتمادا على السؤال العلمي والهدف من التجربة.
2. سحب ما يصل حجم كامل في حقنة الأنسولين.
3. على فأرة تعاني من نقص المناعة، قم بقرص جلد الجناح بين السبابة وإصبع الخاتم وأدخل الإبرة برفق في قاعدة الجلد.
   ملاحظة: هذا الإجراء ليس مؤلما ويتم على الفئران واعية.
4. حقن ببطء حجم في نفس المكان لمنع انتشار الخلايا. وهذا سيخلق بليب صغير تحت الجلد.
5. تطبيق ضغط لطيف على موقع الحقن لمنع التدفق الخلفي للحجم.
6. مراقبة نمو الورم، كل يومين، وذلك باستخدام الفرجار.
7. التضحية بالحيوان إذا تجاوز الورم 1500 مم³. اعتمادا على توافر المواد، والقتل الرحيم الفئران عن طريق ثاني أكسيد الكربون أو استنشاق الغازات المخدرة أو عن طريق خلع عنق الرحم.

6. الحقن داخل الجنب

1. قبل البدء، أوتوكلاف الأدوات الجراحية (مقص والمملقط) في 124 درجة مئوية لمدة 15 دقيقة وتنظيف جميع أسطح مساحة العمل مع الإيثانول 70٪.
2. في أنبوب الطرد المركزي الدقيق، وإعادة إنفاق الخلايا في 50 ميكرولتر من برنامج تلفزيوني عقيم وتخزينها على الجليد. يمكن أن ترتفع كثافة الخلايا من 0.5 إلى مليون خلية. وهناك عدد أكبر من الخلايا يمكن أن يسبب تطور جلطات في الدورة الدموية.
3. قبل حقن الخلايا, حقن 100 μL من 0.015 ملغم / مل buprenorphine تحت الجلد, لتخفيف الألم.
4. ضع الماوس في غرفة التعريفي، حيث يتم الحفاظ على isoflurane في 3٪، لمدة 2-3 دقائق. عندما لا يعود الحيوان متجاوبا مع الحركة، ضعه على جانبه الأيمن على وسادة تدفئة وحافظ على التخدير باستخدام قناع وجه دائرة التنفس الذي يقدم خليط غاز من O₂ وisoflurane.
5. ضعي مواد تشحيم العين على كل عين لتجنب جفاف العين أثناء الجراحة. تطهير منطقة الصدر بمحلول بوفيدوني اليود (أي بيتادين).
6. على الجانب الظهري، قم بعمل شق صغير طوله 0.5 سم باستخدام مقص أسفل الضلع الزائف العاشر.
7. رفع بلطف الطحال ووضعها على الشاش العقيم. باستخدام حقنة الأنسولين، قم بحقن 50 ميكرولتر من CTCs في طرف الطحال. تأكد من الحفاظ على حقنة تستقيم وانتظر 3-5 دقائق لتجنب التدفق الخلفي، ومن ثم إزالة الإبرة.
8. Ligate الأوعية splenic من الجانبين (الشرايين والأوردة) وإزالة الطحال عن طريق قطع مباشرة فوق اثنين من الأربطة. تتم إزالة الطحال لمنع تكوين الورم غير المرغوب فيه في هذا الجهاز.
9. غرزة في الصفاق البطني ثم الجلد باستخدام 5.0 الغرز المعقمة القابلة للتحلل.
10. حافظ على دفء الفأر حتى يتعافى تماما من التخدير.
11. مراقبة الماوس 3 أيام في الأسبوع لوظيفة الجسم غير طبيعية، وحركة غير طبيعية والموقف وفقدان الوزن.
12. التضحية بالحيوان عندما تصل نقاط النهاية الإنسانية (حوالي 6 أسابيع بعد الجراحة) لتحليل انبثاث الكبد.

النتائج

كل من التعبيرات EpCAM و CD26 التي لاحظها IF (الشكل 1A لوحة الحق) و FACS ( الشكل1B) على التوالي، تشير إلى أن خط CTC هو الظهارية وعرض واحدة من السمات المميزة CSC¹⁰. يمكن أن تتميز هذه السمة الظهارية كذلك عن طريق تلطيخ مع الأجسام المضادة الموجهة ضد علامات ?...

Discussion

تم استخدام البروتوكول المذكور أعلاه في البداية لتوصيف وظيفي للجنة مكافحة الإرهاب القولون والمستقيم ، ولكن يمكن استخدامه لأنواع أخرى من السرطان مثل سرطان الثدي ويمكن تكييفه لنماذج الماوس.

العامل الحقيقي هو الحد من عدد من CTCs موجودة في عينة الدم وكفاءة التقنية المستخدمة لعز?...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Accumax solution	Sigma-Aldrich	A7089
Advanced DMEM/F-12	Gibco	12634028
CellTiter-Glo Luminescent Cell Viability Assay	Promega	G7570
Corning Matrigel Growth Factor Reduced (GFR) Basement Membrane Matrix	Corning	354230
Costar 24-well Clear Flat Bottom Ultra-Low Attachment Multiple Well Plates,	Corning	3473
Histiogel Specimen Medium	LabStorage	HG-4000
Human EGF, premium grade	Miltenyi Biotec	130-097-751
Human FGF-2, premium grade	Miltenyi Biotec	130-093-564
L-Glutamine (200 mM)	Gibco	25030081
N-2 Supplement	Gibco	17502048
Penicillin-Streptomycin (5,000 U/mL)	Gibco	15070063