Циркулирующие линии опухолевых клеток: инновационный инструмент для фундаментальных и трансляционных исследований

Резюме

Культивирование CTC позволяет более глубокой функциональной характеристике рака путем анализа экспрессии конкретных маркеров и оценки лекарственной устойчивости и способности колонизировать печень среди других возможностей. В целом, культура CTC может стать многообещающим клиническим инструментом для персонализированной медицины для улучшения результатов лечения пациентов.

Аннотация

Метастазирование является основной причиной смерти от рака. Несмотря на улучшения в стратегиях лечения, метастатический рак имеет плохой прогноз. Таким образом, мы сталкиваемся с настоятельной необходимостью понять механизмы развития метастазирования и, таким образом, предложить эффективные методы лечения прогрессирующего рака. Метастатический рак трудно поддается лечению, так как биопсия инвазивна и недоступна. В последнее время наблюдается значительный интерес к жидким биопсиям, включая как бесклеточную циркулирующую дезоксирибонуклеиновую кислоту (ДНК), так и циркулирующие опухолевые клетки из периферической крови, и мы установили несколько циркулирующих линий опухолевых клеток у пациентов с метастатическим колоректальным раком для участия в их характеристике. Действительно, чтобы функционально охарактеризовать эти редкие и плохо описанные клетки, решающим шагом является их расширение. После установления линии циркулирующих опухолевых клеток (CTC) могут быть культивированы в условиях суспензии или приверженности. На молекулярном уровне линии CTC могут быть дополнительно использованы для оценки экспрессии специфических маркеров, представляющих интерес (таких как дифференцировка, эпителиальные или раковые стволовые клетки) с помощью иммунофлуоресцентного или цитометрического анализа. Кроме того, линии CTC могут использоваться для оценки чувствительности лекарств к химиотерапии золотого стандарта, а также к таргетной терапии. Способность линий CTC инициировать опухоли также может быть проверена путем подкожной инъекции CTC у иммунодефицитных мышей.

Наконец, можно проверить роль специфических генов, представляющих интерес, которые могут быть вовлечены в распространение рака, путем редактирования генов CTC с помощью короткой шпильки рибонуклеиновой кислоты (шРНК) или Crispr / Cas9. Таким образом, модифицированные CTC могут быть введены в иммунодефицитную селезенку мышей, чтобы экспериментально имитировать часть процесса метастатического развития in vivo.

В заключение, линии CTC являются ценным инструментом для будущих исследований и для персонализированной медицины, где они позволят прогнозировать эффективность лечения с использованием тех самых клеток, которые изначально ответственны за метастазирование.

Введение

Несмотря на недавние улучшения в ранней диагностике рака и в терапевтической стратегии, более девяноста процентов заболеваемости раком по-прежнему связано с метастазированием^1. Метастатический процесс представляет собой многоступенчатый каскад, который начинается с локальной отслойки клеток от первичной опухоли и их поступления в кровоток, где они становятся циркулирующими опухолевыми клетками (ЦОК), чтобы окончательно колонизировать отдаленные участки, такие как печень и легкие, в случае колоректального рака (CRC)^2. В последнее время растет внимание к жидким биопсиям, которые являются неинвазивным инструментом для выявления и перечисления ЦОК из образцов крови пациентов. Внутриопухолевая генетическая гетерогенность является основной причиной лекарственной устойчивости; таким образом, выделение репрезентативных клеток из опухолевого материала представляет собой перспективный инструмент персонализированной^{медицины3.}

Несмотря на низкую частоту ЦОК в крови (1 ЦПК на 10⁶ - 10⁷ лейкоцитов)^4,было разработано несколько методик обнаружения и выделения, основанных на различиях свойств между ЦОК и другими компонентами крови^5. Количество ЦОК в образцах крови пациента, само по себе, может дать информацию о стадии злокачественности, реакции на лечение и прогрессировании заболевания^6,7. Таким образом, изоляция CTC является важнейшим инструментом для трансляционных исследований для оценки генетической гетерогенности или проведения скрининга лекарств, а также для фундаментальных исследований для характеристики этих инвазивных клеток, поскольку они являются ключевыми субъектами метастатической индукции^8,9. Действительно, по сравнению с коммерчески установленными линиями раковых клеток, которые накопили тысячи мутаций с течением времени, свежие ЦОК разделяют основные особенности исходной первичной опухоли, включая мощную способность метастазировать, и они являются лучшим отражением заболевания. Эти особенности делают их надежным инструментом для фундаментальных исследований, особенно в нокаут-экспериментах с предсказанными ключевыми факторами, участвующими в метастазировании. Результат этих экспериментов может быть подтвержден in vivo,на мышах, как описано ниже.

Как только ЦОК выделены, они могут быть расширены в условиях неадгезивной культуры, а затем ими можно манипулировать так же, как и любой доступной линией раковых клеток, то есть они могут быть в равной степени культивированы в условиях адгептации или встроены в Matrigel, в зависимости от научного вопроса^10. Например, чтобы проверить экспрессию и локализацию интересующего белка, сферы CTC могут быть выращены в состоянии суспензии и встроены в гистоген для выполнения иммунофлуоресценции на участках сферы. Кроме того, если белок мембранный, его экспрессию на живых клетках можно измерить с помощью цитометрии.

Для функциональных исследований, чтобы проверить роль интересующего белка, который может играть роль в колонизации печени, CTC с генами, отредактированными шРНК или CRISPR / Cas9, могут быть введены в селезенку иммунодефицитных мышей. Этот последний эксперимент является мощной моделью для имитации колонизации метастазов в печень^11.

Способность ЦОК инициировать опухоли может быть оценена путем введения очень небольшого количества клеток мышам с иммунодефицитом. Поскольку инициация опухоли является отличительной чертой раковых стволовых клеток (CSC), этот анализ будет указывать на процент CSC в линиях CTC. Этот фенотип стволовых клеток делает циркулирующие линии опухолевых клеток устойчивыми к некоторым методам лечения рака золотого стандарта. Таким образом, расширенные ЦОК могут использоваться для скрининга лекарств и определения наилучшего потенциально эффективного лечения для пациента; Реакция CTC на лечение может быть проверена in vitro с использованием, например, анализа жизнеспособности люминесценции.

В долгосрочной перспективе скрининг лекарств на свежеизолированных и усиленных ЦОК может быть использован в качестве нового инструмента персонализированной медицины, чтобы помочь в выборе наиболее эффективного и адаптированного лечения для пациентов.

В настоящем документе подробно описаны протоколы культивирования линий CTC, окрашивания специфических белков с помощью иммуноокрашивания и цитометрии, проведения анализов цитотоксичности, а также экспериментов in vivo с ксенотрансплантатами с CTC.

протокол

Все протоколы in vivo были одобрены агентствами по этике животных.

1. Усиление CTC в условиях 3D культуры

1. Для культивирования ЦОК в суспензии первые семена ЦОК в колодцах 24-луночной пластины со сверхнизким прикреплением (ULA) при максимальной концентрации 5 клеток/мкл и в 1 мл среды M12 (т.е. усовершенствованный DMEM-F12, дополненный 2 мМ l-глутамином, 100 единиц / мл пенициллина и стрептомицина, добавкой N2, 20 нг / мл эпидермального фактора роста и 10 нг / мл фактора роста фибробластов^10).
2. Чтобы обеспечить образование сфер и расширение клеток, инкубируют клетки в гипоксических условиях (2%_O2)от 6 до 10 дней.
3. Как только сферы станут достаточно большими (100 мкм), чтобы предотвратить некроз, диссоциируют их для усиления.
   1. Поместите клеточную суспензию в трубку 2 мл или трубку 15 мл и центрифугу по 300 х г в течение 5 минут.
   2. Удалите супернатант и добавьте в гранулу 500 мкл мягкого реагента диссоциации (например, Accumax).
   3. Осторожно вихрь и инкубируют клеточную суспензию с мягким диссоциационным реагентом в течение 20-30 минут при 37 °C.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Превышение времени инкубации в мягком диссоциационном реагенте (Accumax) может привести к аномальному увеличению смертности клеток.
   4. Добавьте 1,5 мл фосфатного буферного физиологического раствора (PBS) и центрифугируйте трубку в течение 5 минут при 300 х г.
   5. Вылейте супернатант и повторно суспендируйте гранулу в свежей среде M12 до плотности 1-5 клеток на мкл.
   6. Засейте клеточную суспензию в новых скважинах пластины Ultra-Low Attachment: 10 мл для колб T75, 2 мл для 6 плит скважин и 100 мкл для 96 плит скважин

2. Иммунофлуоресцентное окрашивание (ИФ) на сечениях сферы CTC

1. Центрифугируйте сферы CTC в трубку объемом 15 мл при 300 х г в течение 5 минут, аспирируйте супернатант и дважды промывайте гранулу PBS.
2. Повторно суспендировать гранулу с 500 мкл 4% параформальдегида (PFA) и инкубировать в течение 20 мин на льду. Центрифугировать суспензию при 300 х г и дважды промыть 5 мл PBS.
3. Повторно суспендировать гранулы с (т.е. от 15 до 20 мкл) горячим и жидким гистогеном. С пипеткой возьмите всю суспензию и сделайте каплю на предварительно охлажденной поверхности при 4 °C и дайте ей полимеризоваться в течение 5-10 минут.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Работайте быстро, чтобы избежать полимеризации суспензии в наконечник.
4. Отсоедините твердую каплю лезвием скальпеля и вставьте ее в отсек для встраивания кассеты.
5. Выполните следующие этапы: включение парафина, секционирование парафина, регидратация сечения, извлечение антигена и инкубация антител. Эти этапы такие же, как для любой опухоли или органа, встроенного в парафин и обработанного для иммунофлуоресцентного окрашивания^12.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Кассету можно хранить в 70% этаноле при 4 °C до встраивания парафина.

3. Анализ цитометрии

1. Центрифуга CTC помещает в трубку объемом 15 мл при 300 х г в течение 5 мин и дважды промывает гранулу PBS.
2. Аспирируйте надосадочное вещество и добавьте в гранулу 500 мкл мягкого реагента диссоциации.
3. Осторожно вихрь и инкубируют клеточную суспензию с мягким диссоциационным реагентом в течение 20-30 мин при 37 °C.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Превышение 40 мин инкубации в мягком диссоциационном реагенте (Accumax) может привести к аномальному увеличению смертности клеток.
4. Центрифугируют клеточную суспензию в течение 5 мин при 300 х г, устраняют супернатант и повторно суспендируют гранулу в 5 мл блокирующего буфера (т.е. PBS с 1% бычьего сывороточного альбумина (BSA)).
5. Пропустите клеточную суспензию через клеточный сетчатый фильтр 40 мкм, чтобы устранить оставшиеся сферы.
6. После подсчета поместите 200 000 клеток в три трубки для сортировки клеток с флуоресцентной активацией (FACS), центрифугу при 300 x g в течение 5 минут и удалите супернатант. Используйте одну из трех трубок FACS в качестве контроля, который не будет получать никаких окрашивающих реагентов.
7. Согласно техническому описанию, добавьте соответствующее антитело в две оставшиеся пробирки FACS (т.е. одно конъюгированное антитело против интересующего белка, один конъюгированный контроль изотипа).
8. После рекомендуемого времени инкубации добавьте 300 мкл блокирующего буфера для промывки клеток, центрифугируйте 3 пробирки при 300 х г и аспирируйте супернатант. Повторите этот шаг дважды. Затем повторно суспендируйте гранулу блокирующим буфером с реагентом окрашивания жизнеспособности клеток (за исключением контроля трубки FACS без какого-либо окрашивания).
9. Держите трубки на льду до анализа FACS. Используйте сначала трубку без окрашивания, чтобы определить ворота для жизнеспособности клеток и окрашивания антител. Затем проанализируйте трубку FACS с конъюгированным антителом против интересующего белка, чтобы количественно оценить процент CTC, экспрессирующего интересующий белок. Трубка FACS с сопряженным контролем изотипа не должна указывать на смещение. Это подтверждает, что сдвиг специфичен для целевого белка, представляющего интерес.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Если возможно, используйте клеточную линию, экспрессирующую высокий уровень белка, представляющего интерес, в качестве положительного контроля и клеточную линию, которая не экспрессирует белок в качестве отрицательного контроля.

4. Анализ люминесцентной жизнеспособности (CellTiter-Glo)

1. Ресуспенд диссоциированных ЦОК (как описано в разделе 1.4.5) в среде M12. Подсчитайте клетки и адаптируйте концентрацию клеток к 200 000 клеток/мл.
2. В 96-луночной пластине ULA высевают 10 000 диссоциированных ЦОК на лунку в 50 мкл и инкубируют пластину при гипоксии (2%_O2)в течение 24 ч.
3. На следующий день добавьте 50 мкл испытуемого препарата в ЦОК. Предварительно рекомендуется выполнить титрование концентрации препарата, чтобы определить половину максимальной ингибирующей концентрации (IC50). Обрабатывайте некоторые колодцы транспортным средством только для определения жизнеспособности базальных клеток.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Количество посеянных ячеек может различаться между линиями CTC в зависимости от времени их удвоения. Кроме того, клетки должны быть посеяны в три раза, чтобы свести к минимуму изменчивость результатов.
4. Инкубировать пластины при гипоксии еще 48 ч.
5. На 3-й день поместите культивируемые пластины и буфер жизнеспособности люминесцентных клеток и подложку при комнатной температуре и восстановите подложку соответствующим объемом буфера в соответствии с протоколом производителя.
6. Добавьте 70 мкл смеси люминесцентной жизнеспособности в каждую культивируемую пластину. Поместите пластины на орбитальный шейкер в течение 20 минут, чтобы индуцировать лизис клеток, а затем перенесите 100 мкл смеси в непрозрачную многолуночную пластину, совместимую с люминометром.
7. Дайте пластине отдохнуть при комнатной температуре, накройте ее алюминиевой фольгой, чтобы стабилизировать люминесцентный сигнал.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Люминесцентный сигнал стабилен в течение 3 часов.
8. Записывайте люминесценцию с помощью микропластичного считывателя (например, Tecan Infinite 200 Pro).
9. Для анализа данных рассчитайте среднее значение тройной относительной световой единицы RLU для каждого условия. Для оценки процента жизнеспособности в соответствии с каждой концентрацией препарата необходимо: (RLU обработанных клеток / RLU необработанных клеток) x 100.

5. Подкожные инъекции

1. В микроцентрифужной трубке повторно суспендируют клетки в 100 мкл стерильного PBS. Если количество вводимых клеток низкое, повторно суспендируйте клетки в 1:1 PBS / Matrigel, уменьшенные в факторах роста, чтобы сконцентрировать клетки вместе и способствовать инициации опухоли.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Плотность клеток может составлять от 10 клеток (чтобы бросить вызов способности инициации опухоли) до 1 миллиона клеток в зависимости от научного вопроса и цели эксперимента.
2. Увеличьте полный объем в инсулиновом шприце.
3. На мыши с иммунодефицитом зажмите кожу бока между указательным и безымянным пальцами и аккуратно вставьте иглу в основание кожи.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Эта процедура не является болезненной и проводится на сознательных мышах.
4. Медленно вводите объем в то же место, чтобы предотвратить распространение клеток. Это создаст небольшой пузырь под кожей.
5. Нанесите мягкое давление на место инъекции, чтобы предотвратить обратный поток объема.
6. Следите за ростом опухоли, через день, используя штангенциркуль.
7. Приносят в жертву животное, если опухоль превышает 1500^мм3. В зависимости от наличия материала, усыпляют мышей путем вдыхания углекислого газа или анестезирующих газов или вывиха шейки матки.

6. Внутрипленичная инъекция

1. Перед началом работы автоклавируйте хирургические инструменты (ножницы и щипцы) при 124 °C в течение 15 мин и очистите все поверхности рабочего пространства 70% этанолом.
2. В микроцентрифужной трубке повторно суспендируют клетки в 50 мкл стерильного PBS и хранят их на льду. Плотность клеток может варьироваться от 0,5 до 1 миллиона клеток. Большее количество клеток может вызвать развитие сгустков в кровообращении.
3. Перед инъекцией клеткам вводят 100 мкл 0,015 мг/мл бупренорфина подкожно, для облегчения боли.
4. Поместите мышь в индукционную камеру, где изофлуран поддерживается на уровне 3%, в течение 2-3 мин. Когда животное больше не реагирует на движение, положите его с правой стороны на грелку и поддерживайте анестезию, используя маску для лица дыхательного контура, которая доставляет газовую смесь O₂ и изофлурана.
5. Нанесите глазную смазку на каждый глаз, чтобы избежать высыхания глаз во время операции. Дезинфицируйте грудную область раствором Повидона-йода (т.е. бетадином).
6. На дорсовентральной стороне сделайте небольшой разрез в 0,5 см ножницами ниже 10-го ложного ребра.
7. Осторожно выньте селезенку и выложите ее на стерильную марлю. Используя инсулиновый шприц, введите 50 мкл ЦОК в кончик селезенки. Обязательно держите шприц в вертикальном положении и подождите 3-5 минут, чтобы избежать обратного потока, а затем извлеките иглу.
8. Разложите селезеночные сосуды с двух сторон (артерий и вен) и удалите селезенку, разрезав непосредственно над двумя лигатурами. Селезенка удаляется для предотвращения нежелательного образования опухоли в этом органе.
9. Сшить брюшную брюшину, а затем кожу с помощью 5,0 разлагаемых стерильных швов.
10. Держите мышь в тепле до полного восстановления после анестезии.
11. Контролируйте мышь 3 дня в неделю на предмет аномальной функции организма, аномальных движений и осанки, а также для потери веса.
12. Принесите животное в жертву, когда гуманные конечные точки достигнут (примерно через 6 недель после операции), чтобы проанализировать метастазы в печени.

Результаты

Выражения EpCAM и CD26, наблюдаемые IF(рисунок 1A правая панель)и FACS(рисунок 1B)соответственно, указывают на то, что линия CTC является эпителиальной и отображает один из отличительных признаков CSC^10. Этот эпителиальный признак может быть доп?...

Обсуждение

Протокол, описанный выше, первоначально использовался для функциональной характеристики колоректального CTC, но он может быть использован для других типов рака, таких как рак молочной железы, и может быть адаптирован для мышиных моделей.

Реальным ограничивающим фактором...

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
Accumax solution	Sigma-Aldrich	A7089
Advanced DMEM/F-12	Gibco	12634028
CellTiter-Glo Luminescent Cell Viability Assay	Promega	G7570
Corning Matrigel Growth Factor Reduced (GFR) Basement Membrane Matrix	Corning	354230
Costar 24-well Clear Flat Bottom Ultra-Low Attachment Multiple Well Plates,	Corning	3473
Histiogel Specimen Medium	LabStorage	HG-4000
Human EGF, premium grade	Miltenyi Biotec	130-097-751
Human FGF-2, premium grade	Miltenyi Biotec	130-093-564
L-Glutamine (200 mM)	Gibco	25030081
N-2 Supplement	Gibco	17502048
Penicillin-Streptomycin (5,000 U/mL)	Gibco	15070063