Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • النتائج
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

تقدم هذه الدراسة بروتوكولات مفصلة في اختبار التكميل في المختبر لتحليل النشاط الحفاز E3 ubiquitin ligaalytic. تم التعبير عن البروتينات المؤتلفة باستخدام أنظمة prokaryotic مثل ثقافة الإشريكية القولونية.

Abstract

يمثل الارتباط التساهمي لليوبيكتين (Ub) ببقايا (بقايا) اليسين الداخلية لبروتين الركيزة ، وهي عملية يطلق عليها اسم ubiquitylation ، أحد أهم التعديلات بعد الترجمية في الكائنات الحية النواة. يتم التوسط في كل مكان من خلال سلسلة متتابعة من ثلاث فئات إنزيمية بما في ذلك الإنزيمات المنشطة لكل مكان (إنزيمات E1) ، والإنزيمات المترافقة مع كل مكان (إنزيمات E2) ، وليجات يوبيكتين (إنزيمات E3) ، وفي بعض الأحيان ، عوامل استطالة سلسلة الubiquitin (إنزيمات E4). هنا، يتم توفير بروتوكولات في المختبر لمقايسات كل مكان، والتي تسمح بتقييم نشاط E3 ubiquitin ligase، والتعاون بين أزواج E2-E3، واختيار الركيزة. يمكن فحص أزواج E2-E3 المتعاونة من خلال مراقبة توليد سلاسل متعددة البيكيتين المجانية و / أو التو-يوبيكيتيليج من ليجاز E3. يتم تعريف الركيزة في كل مكان عن طريق الربط الانتقائي لليغاز E3 ويمكن الكشف عنها عن طريق النشاف الغربي من رد الفعل في المختبر. وعلاوة على ذلك، يوصف اختبار تفريغ E2~Ub، وهو أداة مفيدة للتقييم المباشر للتعاون الوظيفي E2-E3. هنا، ويتبع نقل E3 تعتمد على كل مكان من إنزيم E2 المقابلة على الأحماض الأمينية الليسين الحرة (تقليد الركيزة في كل مكان) أو الليسينات الداخلية من ليغاز E3 نفسها (لصناعة السيارات في كل مكان). في الختام، يتم توفير ثلاثة بروتوكولات مختلفة في المختبر التي هي سريعة وسهلة لأداء لمعالجة E3 ligase وظيفة الحفاز.

Introduction

يوبيكيتيلييشن هي العملية التي يرتبط بها Ub بشكل مشترك ببروتين الركيزة1. يتم تحفيز تعديل Ub من خلال التفاعلات الأنزيمية المتتالية التي تنطوي على عمل ثلاث فئات إنزيم مختلفة ، أيإنزيمات تنشيط Ub (E1s) ، والإنزيمات المصاحبة (E2s) ، وUb ligases (E3s) ، وربما عوامل استطالة سلسلة Ub (E4s)2و3و4و5. بعد الأدينوزين ثلاثي الفوسفات (ATP) - والمغنيسيوم (Mg2+) - تعتمد على تنشيط Ub بواسطة E1 ، يهاجم الموقع النشط سيستين E1 الجليسين C-terminal من Ub ، مما يشكل مجمع ثيوستر (Ub ~ E1). الطاقة المستمدة من التحلل المائي ATP يسبب Ub لتحقيق حالة انتقالية عالية الطاقة، والتي يتم الحفاظ عليها في جميع أنحاء سلسلة الانزيم التالية. بعد ذلك ، ينقل إنزيم E2 Ub المنشط إلى السيستين الحفاز الداخلي ، وبالتالي تشكيل رابطة ثيوستر Ub ~ E2 العابرة. في وقت لاحق، يتم نقل Ub إلى بروتين الركيزة.

ويمكن القيام بذلك بطريقتين. إما أن E3 ligase قد ربط أولا إلى E2، أو يمكن ربط ليغاز E3 مباشرة Ub. نتائج الطريقة الأخيرة في تشكيل وسيط E3 ~ Ub. في كلتا الحالتين، يرتبط Ub إلى بروتين الركيزة عن طريق تشكيل رابطة إيسوببتيد بين مجموعة كاربوكسيل C-terminal من Ub ومجموعة اليسين الأمينية Ɛ من الركيزة6. الجينوم البشري يشفر اثنين من E1s، ما يقرب من 40 E2s، وأكثر من 600 ليغاز في كل مكانالمفترضة 7. استنادا إلى آلية نقل Ub من E3، وتنقسم إلى ثلاث فئات Ub ligases التي تنطوي على Homologous إلى E6AP C-Terminus (HECT) من نوع، جين جديد مثير للاهتمام حقا (RING)/U-مربع من نوع، وRING بين RING (RBR) من نوع ليغاز8. في هذه الدراسة، يتم استخدام U-مربع التي تحتوي على الليغاز، كاربوكسيل تيرمينوس من البروتين HSC70 التفاعل (CHIP)، كما انزيم E3 ممثل. على النقيض من HECT من نوع E3 الإنزيمات التي تشكل Ub ~ E3 thioesters، المجال U-مربع من CHIP يربط E2 ~ Ub ويعزز نقل Ub/substrate اللاحقة مباشرة من إنزيم E28،9. استنادا إلى أهمية U-box للدالة الأنزيمية، يتم استخدام متحولة غير نشطة CHIP U-box، CHIP (H260Q)، كعنصر تحكم. فشل CHIP (H260Q) لربط إلى E2s cognate لها، وبالتالي تفقد نشاطها E3 ligase10.

البروتين في كل مكان يلعب دورا حاسما في تنظيم العديد من الأحداث الخلوية في الخلايا eukaryotic. يمكن أن يعزى تنوع النتائج الخلوية التي يتم تعزيزها من خلال التعلق القابل للعكس لجزيئات Ub إلى بروتينات الركيزة إلى الخصائص الجزيئية ل Ub. كما يحتوي على Ub نفسه سبعة مخلفات ليسين (K) لمزيد من ubiquitylation, هناك مجموعة متنوعة غنية من أنواع سلسلة Ub مع أحجام مختلفة و / أو طبولوجيا11. على سبيل المثال، يمكن تعديل الركائز بواسطة جزيء Ub واحد في واحد (أحادية كل ubiquitylation) أو اليسينات متعددة (متعدد أحادية كل مكان)، وحتى من قبل سلاسل Ub (متعددة في كل مكان)11. تتشكل سلاسل Ub إما homo- أو heterotypically عبر نفس أو مختلف مخلفات ليسين من Ub، والتي يمكن أن تؤدي حتى في سلاسل Ub المتفرعة9. وهكذا، يؤدي انتشار البروتين في كل مكان إلى ترتيبات متنوعة من جزيئات Ub التي توفر معلومات محددة، على سبيل المثال،لتدهور أو تنشيط أو توطين البروتينات المترافقة12و13. وتتيح إشارات Ub المختلفة هذه إعادة برمجة سريعة لمسارات الإشارات الخلوية، وهو مطلب مهم لقدرة الخلية على الاستجابة للاحتياجات البيئية المتغيرة.

يرتبط الجانب المركزي من كل كمية من البروتين بمراقبة الجودة. يجب أن تتحلل البروتينات المطوية أو التالفة بشكل لا رجعة فيه واستبدالها بالبروتينات المركبة حديثا للحفاظ على التوازن البروتيني أو داء البروتيوستاسي14. مراقبة الجودة E3 ligase، CHIP، تتعاون مع المرافقين الجزيئية في تدهور Ub تعتمد على البروتينات التالفة9،15،16،17. وبصرف النظر عن ذلك، ينظم CHIP استقرار المرافق الموجه من الميوزين، UNC-45B (Unc-45 Homolog B)، والذي يتم تنسيقه بإحكام مع وظيفة العضلات والانحرافات عن المستويات المثلى تؤدي إلى اعتلال عضلي الإنسان18،19،20،21. يتم التوسط تدهور UNC-45B بواسطة بروتياسوم 26S بواسطة مرفق سلسلة متعددة Ub مرتبطة K489. في غياب البروتينات الركيزة، CHIP ينفذ لصناعة السيارات في كل مكان10،22،23، والتي هي سمة من RING / U- مربع E3 يوبيكتين ليغاز24،25 وتعتبر لتنظيم نشاط ليغانيس26. ساعد تطبيق طرق فحص الكبد في المختبر الموصوفة في هذه الورقة على تحديد إنزيمات E2 بشكل منهجي التي تتعاون مع CHIP لتعزيز تكوين سلاسل بولي يو بي الحرة و / أو التوائية في كل مكان من CHIP (القسم البروتوكول 2). وعلاوة على ذلك، لوحظ انتشار UNC-45B المعتمد على رقاقة، وهو ركيزة معروفة من اللوغاز E318،19 (القسم البروتوكول 3). وفي نهاية المطاف، تم رصد نقل Ub المنشط من ثيوستر Ub~E2 المعتمد على CHIP (قسم البروتوكول 4).

Protocol

1. إعداد المخازن المؤقتة والكواشف

ملاحظة: يتم سرد المخازن المؤقتة والكواشف التي تم إعدادها يدويا في المختبر أدناه. تم شراء جميع المخازن المؤقتة والكواشف الأخرى المستخدمة في البروتوكولات من مصادر مختلفة واستخدامها وفقا لتعليمات المصنعين.

  1. إعداد 10x الفوسفات العازلة المالحة (10x PBS). لهذا الغرض، مزيج 1.37 M كلوريد الصوديوم (NaCl), 27 mM كلوريد البوتاسيوم (KCl), 80 m من ثنائي هيدروجين فوسفات ثنائي هيدروجين (Na2HPO4.2H2O), و 20 mM من فوسفات البوتاسيوم-ديهيدروجين (KH2PO4) في 1 لتر من H2O المقطر المزدوج (ddH2O). أوتوكلاف برنامج تلفزيوني 10x ، وإعداد حل برنامج تلفزيوني 1x في DDH2O.
    1. يتم الالاستعباد التلقائي لمدة 15 دقيقة عند 121 درجة مئوية و 98.9 كيلو باسكال.
      ملاحظة: يتم تنفيذ Autoclaving تحت هذه الشروط لكافة المخازن المؤقتة والحلول. إذا لم يذكر خلاف ذلك، يتم تخزين الحلول في درجة حرارة الغرفة (RT).
  2. إعداد 1 L من PBS-توين (PBS-T) الحل عن طريق إضافة 0.1٪ توين إلى 1 لتر من برنامج تلفزيوني 1x.
  3. إعداد 10 مل من محلول الأسهم L-lysine 0.5 M عن طريق حل L-lysine في ddH2O. Aliquot L-lysine في أجزاء 1 مل، وتخزينها في -20 درجة مئوية حتى مزيد من الاستخدام.
    ملاحظة: L-lysine يمكن تجميدها و إذابتها بشكل متكرر.
  4. إعداد محلول 0.25 M إيثيلين ديامين رباعي الخليك (EDTA) عن طريق حل EDTA في 200 مل من ddH2O.
    1. ضبط درجة الحموضة إلى 8.0 مع هيدروكسيد الصوديوم (NaOH).
    2. ضبط مستوى الصوت إلى 250 مل مع ddH2O.
    3. أوتوكلاف الحل.
  5. إعداد 10 مل من 20 ملغم / مل مصل البقري الألبومين (جيش تحرير شعبة البوصل) حل عن طريق حل جيش تحرير شعبة الاحلال في ddH2O. مخزن في -20 درجة مئوية في 200 μL aliquots.
    ملاحظة: يمكن تجميد BSA و إذابته بشكل متكرر.
  6. إعداد 1 لتر من 2-(N-morpholino)ethane حمض الكبريتون (MES) تشغيل العازلة عن طريق حل 50 MM MES, 50 mM تريس قاعدة, 3.47 mM الصوديوم دودسيل كبريتات (SDS), و 1.03 m M EDTA في 0.9 لتر من DDH2O. بعد الخلط بشكل صحيح، ضبط مستوى الصوت إلى 1 لتر.
    1. رقم الحموضة من المخزن المؤقت 1x هو 7.6. لا تعدل درجة الحموضة مع حمض أو قاعدة.
  7. إعداد 200 مل من حل حجب (5٪ الحليب) عن طريق حل 10 غرام مسحوق الحليب في 1x PBS-T. تخزين حل حظر في 4 درجة مئوية لمدة تصل إلى أسبوع واحد.
  8. إعداد 1 لتر من مخزن نقل (انظر جدول المواد)وفقا لتعليمات الشركات المصنعة.
  9. إعداد 2x SDS عينة العازلة عن طريق حل 125 mM تريس قاعدة, 4٪ SDS, 4٪ الجلسرين, 0.03٪ بروموفينول الأزرق, و 50 ميكرولتر / مل من β ميركابتوثانول في 50 مل ddH2O. Aliquot في 1 أجزاء مل, وتخزينها في -20 درجة مئوية حتى الاستخدام.

2. في المختبر التلقائي في كل مكان المقايسة

  1. إعداد الفحص وتنفيذه
    1. حساب حجم كل كاشف المطلوبة لكل رد فعل على أساس الأضراس معينة من البروتينات وتركيزات البروتين من حلول البروتين. لكل تفاعل تلقائي في كل مكان، استخدم 100 nM E1 و 1 ميكرومتر E2 و 1 ميكرومتر E3 و 50 ميكرومترUb. ضبط حجم التفاعل إلى 20 ميكرولتر مع ddH2O.
      ملاحظة: تم شراء حل ATP وحاجز ubiquitylation كحلول مخزون 10x واستخدم في 1x.
    2. إعداد مخطط الأنابيب لجميع ردود الفعل. اختبار تسعة إنزيمات E2 مختلفة لقدرتها على العمل (I) مع رقاقة، (الثاني) مع CHIP غير نشطة بشكل حفاز (H260Q) متحولة، و (الثالث) دون رقاقة في ردود الفعل الفردية في كل مكان.
    3. لتجنب أخطاء ماصة، قم بإعداد مزيج رئيسي على الجليد يحتوي على الحجم المطلوب لجميع ردود الفعل بالإضافة إلى رد فعل إضافي واحد. حساب مقدار المزيج الرئيسي المطلوب لكل رد فعل.
      ملاحظة: مكونات المزيج الرئيسي هي الكواشف المطلوبة على قدم المساواة لكل رد فعل، أي.،E1، E3، Ub، ATP، ومخازن مؤقتة في كل مكان.
    4. إضافة ddH2O ومزيج رئيسي إلى أنابيب تفاعل البوليميراز المتسلسل (PCR). أبقي الأنابيب على الثلج
    5. قبل البدء في ردود الفعل في كل مكان عن طريق إضافة الإنزيمات E2، وإعداد دورة الحرارية PCR مع البرنامج التالي: 2 ساعة، 37 درجة مئوية تليها 4 درجة مئوية، بلا حدود.
    6. إضافة 1 ميكرومتر من الإنزيمات E2 في الأنابيب المعنية، واحتضان العينات في دورة PCR الحرارية للفترة المشار إليها من الزمن.
    7. بعد 2 ساعة، إضافة المخزن المؤقت عينة SDS إلى كل رد فعل، ومزيج عن طريق pipetting صعودا وهبوطا عدة مرات.
      ملاحظة: يعتمد حجم المطلوبة من المخزن المؤقت عينة على تركيز المخزون من المخزن المؤقت عينة. هنا، تمت إضافة 20 ميكرولتر من المخزن المؤقت لعينة SDS 2x إلى كل رد فعل.
    8. غلي العينات على الفور في 95 درجة مئوية لمدة 5 دقائق، والاستمرار مع البولي أكريلاميد هلام الكهربائي (PAGE). تخزين البروتينات المشوهة في -20 درجة مئوية.
  2. جل الكهربائي ولطخة الغربية
    1. بعد ذوبان الجليد، تدور أسفل العينات لحوالي 10 ق وتحميل هلام SDS-PAGE. استخدام سلم البروتين كمرجع الحجم.
      ملاحظة: هنا، تم استخدام 4-12٪ من المواد الهلامية التدرج بيس تريس و 3 ميكرولتر من سلم البروتين. تقسيم أحجام العينة وتحميل اثنين من المواد الهلامية بالتساوي باستخدام 20 ميكرولتر من كل عينة.
    2. تشغيل هلام في 160-200 V لمدة 30-45 دقيقة تقريبا بحيث الجبهة عينة تصل إلى الجزء السفلي من هلام.
    3. نقل كل هلام إلى وعاء بلاستيكي مملوءة المخزن المؤقت النشاف نصف مجفف، واحتضانه لمدة 2-5 دقائق في RT. إزالة هلام التراص.
    4. إعداد قطعتين من ورق النشاف هلام الحجم وغشاء النيتروسليلوز هلام الحجم لكل هلام SDS وقبل نقع في العازلة النشاف شبه المتنوعة. تجميع لطخة الغربية (البنك الدولي) ساندويتش في غرفة البنك الدولي من أسفل إلى أعلى بالترتيب التالي: النشاف ورقة، غشاء النيتروسليلوز، هلام SDS-PAGE، ورقة النشاف.
    5. إزالة فقاعات الهواء التي قد تكون محاصرة بين طبقات شطيرة. لهذا الغرض، استخدم الأسطوانة للفة بعناية أكثر من شطيرة عدة مرات.
    6. إغلاق الغرفة، والسماح العازلة لطخة الزائدة لاستنزاف.
    7. ضع الغرفة في جهاز النشاف المعني ، واستخدم البرنامج التالي للنشاف شبه المتنوع: 25 V ، 1.0 A ، 30 دقيقة.
    8. نقل الغشاء الملطخ إلى وعاء بلاستيكي مليء بمحلول الحجب ، واحتضانه لمدة 30 دقيقة في RT.
    9. إعداد الحل الأساسي للأجسام المضادة بإضافة الأجسام المضادة إلى 10 مل من برنامج تلفزيوني-T تحتوي على كاشف حجب (انظر جدول المواد).
      ملاحظة: تركيز عمل الأجسام المضادة هو الأجسام المضادة محددة. في هذه الحالة ، تم استخدام جسم مضاد للفأر أحادي النسيلة مضاد للبيبيكيتين في تخفيف 1:5،000. بالنسبة للهلام الثاني ، تم استخدام جسم مضاد للأرنب أحادي النسيلة مضاد CHIP في الساعة 1:500 في كاشف PBS-T/blocking.
    10. استبدال حل حجب مع الحل الأساسي للأجسام المضادة، واحتضان بين عشية وضحاها في 4 درجة مئوية على الروك.
    11. غسل الغشاء ثلاث مرات لمدة 10 دقائق مع برنامج تلفزيوني تي.
    12. إعداد حل الأجسام المضادة الثانوية عن طريق إضافة الأجسام المضادة المعنية إلى 10 مل من برنامج تلفزيوني-T.
      ملاحظة: هنا، يتم استخدام الأجسام المضادة للفأرة والفأرة المضادة للأرانب عند تخفيف 1:10،000.
    13. احتضان الغشاء مع الأجسام المضادة الثانوية لمدة 1 ساعة في RT على الروك.
    14. غسل الغشاء ثلاث مرات لمدة 5 دقائق مع برنامج تلفزيوني-T.
  3. تحليل البيانات
    1. إضافة الكواشف الغربية الكشف عن لطخة للبيروكسيداز الفجل (HRP) - الأجسام المضادة المقترنة إلى الغشاء غسلها وفقا لتعليمات الشركة المصنعة، والتقاط إشارة HRP باستخدام أفلام الأشعة السينية أو كاميرا جهاز المسؤول إلى جانب (الشكل 1).

3. في المختبر الركيزة في كل مكان اختبار

  1. إعداد الفحص وتنفيذه
    1. حساب حجم كل كاشف المطلوبة لكل رد فعل، استنادا إلى الأضراس معينة من البروتينات وتركيزات البروتين من حلول البروتين. لكل تفاعل الركيزة في كل مكان، استخدم 100 nM E1، 1 ميكرومتر E2، 1 ميكرومتر E3، 1 ميكرومتر ركيزة، و 50 ميكرومترUb. استخدام 10x ATP الحل و10x في كل مكان العازلة في 1x. ضبط حجم رد فعل الركيزة في كل مكان إلى 20 ميكرولتر مع ddH2O.
    2. إعداد مخطط الأنابيب لجميع ردود الفعل. وتشمل ردود فعل السيطرة السليمة التحقق من أن الركيزة في كل مكان هو E3 محددة. استخدام البروتين UNC-45B كركيزة تمثيلية من رقاقة وشريحة متحولة غير نشطة بشكل حفاز (H260Q) كعنصر تحكم. إعداد ردود الفعل التالية: E1، E2، Ub مزيج (بما في ذلك Ub، ATP، المخزن المؤقت في كل مكان)؛ E1، E2، Ub مزيج، UNC-45B؛ E1، E2، Ub مزيج، رقاقة (H260Q)، UNC-45B؛ وE1، E2، Ub مزيج، رقاقة، UNC-45B.
    3. لتجنب أخطاء ماصة، قم بإعداد مزيج رئيسي على الجليد يحتوي على الحجم المطلوب لجميع ردود الفعل بالإضافة إلى رد فعل إضافي واحد. حساب حجم المزيج الرئيسي المطلوب لكل رد فعل.
      ملاحظة: مكونات المزيج الرئيسي لهذا المقايسة تتضمن E1 و E2 و Ub و ATP و المخزن المؤقت لكل مكان.
    4. إضافة مكونات رد الفعل بالترتيب التالي: ddH2O، الركيزة، E3 ligase.
    5. قبل البدء في رد فعل كل مكان عن طريق إضافة المزيج الرئيسي ، قم بإعداد دورة حرارية PCR مع البرنامج التالي: 2 ساعة ، 37 درجة مئوية تليها 4 درجات مئوية ، بلا حدود.
    6. إضافة المزيج الرئيسي إلى كل أنبوب، واحتضان العينات في دورة PCR الحرارية للفترة المشار إليها من الزمن.
    7. بعد 2 ساعة، إضافة 2X SDS عينة المخزن المؤقت لكل رد فعل، وتخلط عن طريق pipetting صعودا وهبوطا عدة مرات.
    8. بعد التشغيل، قم بغلي العينات على الفور عند 95 درجة مئوية لمدة 5 دقائق، و استمر في PAGE. بدلا من ذلك، تخزين البروتينات المشوهة في -20 درجة مئوية.
  2. جل الكهربائي ولطخة الغربية
    1. إجراء إلكتروفورسيس هلام ولطخة الغربية كما هو موضح في القسم 2.2. استخدام أجسام مضادة محددة للكشف عن الركيزة وE3 ligase، على التوالي.
      ملاحظة: هنا، يتم دمج UNC-45B إلى علامة بروتين متعدد الببتيد مشتقة من منتج الجينات c-myc مما يسمح باستخدام جسم مضاد للماوس أحادي النسيلة مضاد ل MYC. يستخدم مكافحة MYC في 1:10،000.
  3. تحليل البيانات
    1. إجراء تحليل للبيانات كما هو موضح في القسم 2.3(الشكل 2).

4. ليسين تفريغ المقايسة

  1. إعداد الفحص وتنفيذه
    1. شحن إنزيم E2 مع Ub بواسطة E1
      1. حساب حجم كل كاشف المطلوبة لكل رد فعل على أساس الأضراس معينة من البروتينات وتركيزات البروتين من حلول البروتين. لكل رد فعل الشحن، استخدم 2 ميكرومتر E1، 4 ميكرومتر E2، و 4 ميكرومتر من البيسين الخالي من اليوبيكيتين (Ub K0). استخدام 10x ATP و 10x في كل مكان العازلة في 1x. ضبط حجم رد فعل الشحن إلى 20 ميكرولتر مع ddH20.
        ملاحظة: يتم استخدام متحولة Ub K0 الخالية من ال ليسين لفرض الإنتاج الحصري ل E2 أحادي الانتشار. ويمكن أيضا استخدام Ub البرية من نوع; ومع ذلك ، قد يؤدي هذا إلى تعديلات E2 ~ Ub المتنوعة(على سبيل المثال، تعدد الثقافات في E2) ، والتي يصعب تحليلها. لأول مرة استخدام أو عند استخدام إنزيم E2 جديد، تحديد مستوى Ub الشحن على E2 التي يمكن تحقيقها من قبل E1. لتحديد عائد الشحن، تصور E2 غير المشحون مقابل الشحن عبر تلطيخ Coomassie. هنا، تم تحويل ما يقرب من نصف Ub K0 بشكل موثوق إلى UBE2D2 ~ Ub عند استخدام نسب الاعتدال من UBE2D2 وUb K0 (الشكل التكميلي S2A).
      2. إعداد مخطط الأنابيب لرد فعل الشحن. ضبط حجم رد فعل الشحن لتفاعلات التفريغ اللاحقة التي تختارها، على سبيل المثال،استخدم CHIP و CHIP (H260Q) في ردود فعل التفريغ الفردية. وبالتالي، قم بإعداد ضعف حجم رد فعل الشحن واحد.
        ملاحظة: لأول مرة استخدام, اختبار تركيزات مختلفة من ليغانس E3 من اختيار لرصد ظروف التفريغ الأمثل, وتحليلها عن طريق النشاف الغربية. في حالة مثالية، سوف التفريغ من Ub من E2 زيادة مع مرور الوقت حتى يختفي الفرقة البروتين E2 ~ Ub المعنية.
      3. احتضان رد فعل الشحن لمدة 15 دقيقة عند 37 درجة مئوية.
    2. إنهاء رد فعل الشحن
      1. وقف رد فعل الشحن بإضافة apyrase بتركيز نهائي قدره 1.8 U/mL. تنفيذ الحضانة مع apyrase لمدة 5 دقائق في RT، تليها إضافة EDTA بتركيز نهائي قدره 30 mM. ضبط حجم رد فعل الشحن إلى 30 ميكرولتر مع ddH2O.
        ملاحظة: يستخدم Apyrase لتحويل جزيئات ATP إلى جزيئات ADP (أدينوسين ثنائي الفوسفات). وبما أن نشاط إنزيم E1 يعتمد على ATP، لم يعد بإمكان E1 شحن E2. EDTA بالإضافة إلى ذلك يستخدم لضمان أن E1 هو تثبيط بواسطة إرواء2 + ملغ الأيونات التي هي العوامل المشتركة اللازمة لE1. حجم apyrase المطلوب لوقف رد الفعل يمكن أن تختلف بين شروط المقايسة. على الرغم من أن apyrase وحدها تطفئ بالفعل جزيئات ATP المتاحة ، إلا أن مزيجا من apyrase و EDTA كان أكثر فعالية في إيقاف رد فعل الشحن لزوج E1-UBE2D2. وبما أن إيقاف التفاعل عامل حاسم في قابلية الاستنساخ، يجب اختبار التوقف الفعال لأزواج E1-E2 الجديدة. لهذا الغرض، قم بإعداد رد فعل الشحن، ووقفه، وجمع العينات في نقاط زمنية محددة، على سبيل المثال،بعد 2 و 5 و 10 و 15 دقيقة. مستويات غير متغيرة من E2 ~ Ub تشير إلى أن رد الفعل قد توقف، وأن ثيوستر كان مستقرا خلال تلك الفترة من الزمن(الشكل التكميلي S2B).
    3. تفريغ E2 ~ Ub بواسطة E3
      1. إعداد أربعة أنابيب المقابلة لنقاط زمنية مختلفة (ر0، ر1، ر2، ر3)؛ إضافة المخزن المؤقت عينة غير الحد (6.7 ميكرولتر من 4x الليثيوم دودسيل كبريتات (LDS) العازلة) إلى كل أنبوب.
        ملاحظة: لا تستخدم عامل تقليل في المخزن المؤقت عينة.
      2. إزالة 6 ميكرولتر من رد فعل الشحن توقف ل t0، وضبط حجم إلى 20 ميكرولتر مع DDH2O.
      3. احتضان عينة T0 لمدة 10 دقائق عند 70 درجة مئوية.
        ملاحظة: لا تغلي العينة بتمديد فترة الحضانة حيث أن الثيويسترات هي اللبنية في درجات حرارة أعلى.
      4. حساب حجم كل كاشف المطلوبة لكل رد فعل التفريغ. استخدام المتبقية 24 ميكرولتر من E2 المشحونة, وإضافة 10 م م L-ليسين, 1 ملغ/ مل BSA, و 500 nM من ليغاز E3. استخدم المخزن المؤقت للتكتيل في كل مكان عند 1x، واضبط مستوى الصوت إلى 80 ميكرولتر مع ddH2O.
      5. إعداد مخطط pipetting لكافة تفاعلات التفريغ واستخدام CHIP(H260Q) كتحكم بالإضافة إلى CHIP(WT).
      6. إعداد ردود فعل التفريغ على الجليد عن طريق إضافة المكونات المطلوبة بالترتيب التالي: ddH2O، المخزن المؤقت في كل مكان، BSA، ليسين، E3 ligase، وE2 مشحونة لبدء رد الفعل.
      7. احتضان رد فعل التفريغ في RT.
      8. أخذ عينات بعد 5 و 30 و 60 دقيقة عن طريق نقل 20 ميكرولتر من تفاعل التصريف في أنابيب العينة المعنية.
        ملاحظة: يمكن أن تختلف النقاط الزمنية المناسبة التي تسمح بالرصد السليم للتسريح بين أزواج E2-E3.
      9. دوامة العينة على الفور، واحتضانها في 70 درجة مئوية لمدة 10 دقيقة.
      10. تابع مباشرة مع PAGE.
        ملاحظة: E2 ~ Ub ثيويسترس يمكن أن يكون labile حتى بعد إزالة التشجير في المخزن المؤقت عينة. وهكذا، ينبغي أن يتم هلام الكهربائي مباشرة بعد تنفيذ المقايسة.
  2. جل الكهربائي ولطخة الغربية
    1. أداء الكهربائي هلام والنشاف الغربية كما هو موضح في القسم 2.2. استخدم الأجسام المضادة الخاصة ب Ub، وإذا توفرت، استخدم أيضا الأجسام المضادة الخاصة ب E3 التي تم تربيتها في نوع مختلف، مما يسمح بالكشف المتزامن عن إشارة Ub و E3 ligase.
  3. تحليل البيانات
    1. إجراء تحليل للبيانات كما هو موضح في القسم 2.3(الشكل 3).

النتائج

لتحديد إنزيمات E2 التي تتعاون مع ubiquitin ligase CHIP ، تم اختبار مجموعة من المرشحين E2 في ردود الفعل الفردية في المختبر في كل مكان. تم رصد التعاون E2-E3 أزواج من خلال تشكيل منتجات كل مكان E3 تعتمد، أيلصناعة السيارات في كل مكان من ليغاز E3 وتشكيل البوليمرات Ub الحرة. تم تحليل منتجات كل مكان عن طريق...

Discussion

تصف هذه الورقة طرق التكميل في المختبر الأساسية لتحليل وظيفة E3 ligase. عند إجراء في المختبر في كل مكانالمقايسات, وينبغي النظر في أن بعض الإنزيمات E2 يمكن أن تؤدي لصناعة السيارات في كل مكان بسبب هجوم السيستين النشطة على بقايا ليسين الخاصة بهم التي تقع على مقربة من موقع نشط30

Disclosures

ولا يوجد بين أصحاب البلاغ تضارب في المصالح.

Acknowledgements

نشكر أعضاء مختبرنا على المناقشات النقدية والمشورة المفيدة بشأن المخطوطة. نعتذر عن عدم ذكر مساهمات قيمة بسبب الحد من الحجم. ويدعم هذا العمل من قبل دويتشه Forschungsgemeinschaft (DFG، مؤسسة البحوث الألمانية) - SFB 1218 - Projektnumber 269925409 ومجموعة التميز EXC 229 / CECAD إلى TH. تم تمويل هذا العمل من قبل دويتشه فورتشونجسجيمينشافت (DFG، مؤسسة الأبحاث الألمانية) في إطار استراتيجية التميز الألمانية - EXC 2030 - 390661388 و - SFB 1218 - Projektnumber 269925409 إلى T.H. ديسي أربيت ووردي فون دير دويتشن فورتشونغشجيمينشافت (DFG) ايم رحمين دير deutschen Exzellenzstrategie - EXC 2030 - 390661388 أوند - SFB 1218 - Projektnummer: 269925409 gefördert T.H.

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
Amershan Protran 0.1 µm NCGE Healthcare10600000nitrocellulose membrane
Anti-CHIPCell Signaling2080Monoclonal rabbit anti-CHIP antibody, clone C3B6
Anti-MYCRocheOP10Monoclonal mouse anti-MYC antibody, clone 9E10
Anti-ubiquitinUpstate05-944Monoclonal mouse anti-Ub antibody, clone P4D1-A11
ApyraseSigmaA6535-100UN
ATP (10x)Enzo12091903
BSASigmaA6003-10G
EDTARoth8043.2
KClRoth6781.1
K2HPO4RothP749.2
KH2PO4Roth3904.1
LDS sample buffer (4x)novexB0007
L-LysineSigmaL5501-5G
MESRoth4256.4
MeOHVWR Chemicals2,08,47,307100%
MilchpulverRothT145.3
NaClRothP029.3
NuPAGE AntioxidantinvitrogenNP0005
NuPAGE Transfer buffer (20x)novexNP0006-1
Page ruler plusThermo Fisher26619Protein ladder
RotiBlockRothA151.1Blocking reagent
SDS (20%)Roth1057.1
S1000 Thermal CyclerBio Rad1852196
Trans-Blot TurboBio Rad1704150EDUTransfer system
Tris baseRoth4855.3
Tween 20Roth9127.2
UbcH Enzyme SetBostonBiochemK-980BE2 enzymes
UbiquitinBostonBiochemU-100H
Ubiquitin-activating enzyme E1EnzoBML-UW941U-0050
Ubiquitylation buffer (10x)EnzoBML-KW9885-001
Whatman blotting paperBio Rad1703969Extra thick filter paper

References

  1. Kuhlbrodt, K., Mouysset, J., Hoppe, T. Orchestra for assembly and fate of polyubiquitin chains. Essays in Biochemistry. 41, 1-14 (2005).
  2. Pickart, C. M., Eddins, M. J. Ubiquitin: structures, functions, mechanisms. Biochimica et Biophysica Acta. 1695 (1-3), 55-72 (2004).
  3. Dye, B. T., Schulman, B. A. Structural mechanisms underlying posttranslational modification by ubiquitin-like proteins. Annual Review of Biophysics and Biomolecular Structure. 36, 131-150 (2007).
  4. Koegl, M., et al. A novel ubiquitination factor, E4, is involved in multiubiquitin chain assembly. Cell. 96 (5), 635-644 (1999).
  5. Hoppe, T. Multiubiquitylation by E4 enzymes: 'one size' doesn't fit all. Trends in Biochemical Sciences. 30 (4), 183-187 (2005).
  6. Stewart, M. D., Ritterhoff, T., Klevit, R. E., Brzovic, P. S. E2 enzymes: more than just the middle men. Cell Research. 26 (4), 423-440 (2016).
  7. Clague, M. J., Heride, C., Urbé, S. The demographics of the ubiquitin system. Trends in Cell Biology. 25 (7), 417-426 (2015).
  8. Buetow, L., Huang, D. T. Structural insights into the catalysis and regulation of E3 ubiquitin ligases. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 17 (10), 626-642 (2016).
  9. French, M. E., Koehler, C. F., Hunter, T. Emerging functions of branched ubiquitin chains. Cell Discovery. 7, 6 (2021).
  10. Hatakeyama, S., Yada, M., Matsumoto, M., Ishida, N., Nakayama, K. I. U box proteins as a new family of ubiquitin-protein ligases. Journal of Biological Chemistry. 276 (35), 33111-33120 (2001).
  11. Herhaus, L., Dikic, I. Expanding the ubiquitin code through post-translational modification. EMBO Reports. 16 (9), 1071-1083 (2015).
  12. Deshaies, R. J., Joazeiro, C. A. RING domain E3 ubiquitin ligases. Annual Review of Biochemistry. 78, 399-434 (2009).
  13. Hochstrasser, M. Lingering mysteries of ubiquitin-chain assembly. Cell. 124 (1), 27-34 (2006).
  14. Hoppe, T., Cohen, E. Organismal protein homeostasis mechanisms. Genetics. 215 (4), 889-901 (2020).
  15. Okiyoneda, T., et al. Peripheral protein quality control removes unfolded CFTR from the plasma membrane. Science. 329 (5993), 805-810 (1997).
  16. Tawo, R., et al. The Ubiquitin ligase CHIP integrates proteostasis and aging by regulation of insulin receptor turnover. Cell. 169 (3), 470-482 (2017).
  17. Albert, M. C., et al. CHIP ubiquitylates NOXA and induces its lysosomal degradation in response to DNA damage. Cell Death and Disease. 11 (9), 740 (2020).
  18. Hoppe, T., et al. Regulation of the myosin-directed chaperone UNC-45 by a novel E3/E4-multiubiquitylation complex in C. elegans. Cell. 118 (3), 337-349 (2004).
  19. Kim, J., Löwe, T., Hoppe, T. Protein quality control gets muscle into shape. Trends in Cell Biology. 18 (6), 264-272 (2008).
  20. Janiesch, P. C., et al. The ubiquitin-selective chaperone CDC-48/p97 links myosin assembly to human myopathy. Nature Cell Biology. 9 (4), 379-390 (2007).
  21. Donkervoort, S., et al. Pathogenic variants in the myosin chaperone UNC-45B cause progressive myopathy with eccentric cores. The American Journal of Human Genetics. 107 (6), 1078-1095 (2020).
  22. Murata, S., Minami, Y., Minami, M., Chiba, T., Tanaka, K. CHIP is a chaperone-dependent E3 ligase that ubiquitylates unfolded protein. EMBO Reports. 2 (12), 1133-1138 (2001).
  23. Jiang, J., et al. CHIP is a U-box-dependent E3 ubiquitin ligase: identification of Hsc70 as a target for ubiquitylation. Journal of Biological Chemistry. 276 (64), 42938-42944 (2001).
  24. Yang, Y., Yu, X. Regulation of apoptosis: the ubiquitous way. The FASEB Journal. 17 (8), 790-799 (2003).
  25. Lamothe, B., et al. TRAF6 ubiquitin ligase is essential for RANKL signaling and osteoclast differentiation. Biochemical and Biophysical Research Communication. 359 (4), 1044-1049 (2007).
  26. Amemiya, Y., Azmi, P., Seth, A. Autoubiquitination of BCA2 RING E3 ligase regulates its own stability and affects cell migration. Molecular Cancer Research. 6 (9), 1385 (2008).
  27. Brzovic, P. S., Lissounov, A., Christensen, D. E., Hoyt, D. W., Klevit, R. E. A UbcH5/ubiquitin noncovalent complex is required for processive BRCA1-directed ubiquitination. Molecular Cell. 21 (6), 873-880 (2006).
  28. Sakata, E., et al. Crystal structure of UbcH5b~ubiquitin intermediate: Insight into the formation of the self-assembled E2~Ub conjugates. Structure. 18 (1), 138-147 (2010).
  29. Eddins, M. J., Carlile, C. M., Gomez, K. M., Pickart, C. M., Wolberger, C. Mms2-Ubc13 covalently bound to ubiquitin reveals the structural basis of linkage-specific polyubiquitin chain formation. Nature Structural and Molecular Biology. 13 (10), 915-920 (2006).
  30. Buetow, L., et al. Activation of a primed RING E3-E2 ubiquitin complex by non-covalent ubiquitin. Molecular Cell. 58 (2), 297-310 (2015).
  31. Dou, H., Buetow, L., Sibbet, G. J., Cameron, K., Huang, D. T. BIRC7-E2 ubiquitin conjugate structure reveals the mechanism of ubiquitin transfer by a RING dimer. Nature Structural and Molecular Biology. 19 (9), 876-883 (2012).
  32. McKenna, S., et al. Noncovalent interaction between ubiquitin and the human DNA repair protein Mms2 is required for Ubc13-mediated polyubiquitination. Journal of Biological Chemistry. 276 (43), 40120-40125 (2001).
  33. Plechanovová, A., et al. Mechanism of ubiquitylation by dimeric RING ligase RNF4. Nature Structural Biology. 18 (9), 1052-1059 (2011).
  34. Pierce, N. W., Kleiger, G., Shan, S. O., Deshaies, R. J. Detection of sequential polyubiquitylation on a millisecond timescale. Nature. 462 (7273), 615-619 (2009).
  35. Jain, A. K., Barton, M. C. Regulation of p53: TRIM24 enters the RING. Cell Cycle. 8 (22), 3668-3674 (2009).
  36. Swatek, K. N., Komander, D. Ubiquitin modifications. Cell Research. 26, 399-422 (2016).
  37. Yan, K., et al. The role of K63-linked polyubiquitination in cardiac hypertrophy. Journal of Cellular and Molecular Medicine. 22 (10), 4558-4567 (2018).
  38. Dammer, E. B., et al. Polyubiquitin linkage profiles in three models of proteolytic stress suggest the etiology of Alzheimer disease. Journal of Biological Chemistry. 286 (12), 10457-10465 (2011).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

171

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved