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Neste Artigo

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Resumo

O presente estudo fornece protocolos de ensaio de on-lona in vitro detalhados para a análise da atividade catalítica da ubiquitina E3. Proteínas recombinantes foram expressas usando sistemas procarióticos como a cultura Escherichia coli.

Resumo

A ligação covalente da ubiquitina (Ub) com resíduos de lisemina interna de uma proteína substrato, um processo denominado ubiquidade, representa uma das modificações pós-translacionais mais importantes em organismos eucarióticos. A ubiquização é mediada por uma cascata sequencial de três classes enzimes, incluindo enzimas ativadoras de ubiquitina (enzimas E1), enzimas conjugadoras de ubiquitina (enzimas E2) e ligaduras de ubiquitina (enzimas E3), e às vezes, fatores de alongamento da cadeia de ubiquitina (enzimas E4). Aqui, são fornecidos protocolos in vitro para ensaios de ubiquização, que permitem a avaliação da atividade ligase de ubiquitina E3, a cooperação entre pares E2-E3 e seleção de substratos. Os pares E2-E3 cooperantes podem ser rastreados monitorando a geração de cadeias gratuitas de poli-ubiquínea e/ou auto-ubiquização da ligase E3. A ubiquização do substrato é definida por ligação seletiva da liga ligase E3 e pode ser detectada por manchas ocidentais da reação in vitro. Além disso, é descrito um ensaio de descarga E2~Ub, que é uma ferramenta útil para a avaliação direta da cooperação funcional do E2-E3. Aqui, a transferência de ubiqutina dependente do E3 é seguida da enzima E2 correspondente para aminoácidos de lisina livre (imitando ubiquidades substratos) ou lisinas internas da própria Ligase E3 (auto-ubiquização). Em conclusão, são fornecidos três protocolos in vitro diferentes que são rápidos e fáceis de executar para abordar a funcionalidade catalítica do E3 ligase.

Introdução

A ubiquização é o processo pelo qual a Ub está covalentemente ligada a uma proteína substrato1. A modificação da Ub é catalisada por sucessivas reações enzimáticas envolvendo a ação de três classes enzimáticas diferentes, ou seja,e ., enzimas ativantes de Ub (E1s), enzimas ub-conjugadoras (E2s), ligaduras ub (E3s) e possivelmente fatores de alongamento da cadeia Ub (E4s)2,3,4,5. Após a adenosina triphosfato (ATP)- e a ativação dependente de magnésio (Mg2+)-dependent da Ub by E1, o local ativo cisteína do E1 ataca a glicecina terminal C da Ub, formando um complexo de tioéster (Ub~E1). A energia extraída da hidrólise ATP faz com que o Ub atinja um estado de transição de alta energia, que é mantido em toda a seguinte cascata enzimávia. Em seguida, a enzima E2 transfere a Ub ativada para sua cisteína catalítica interna, formando assim um vínculo de tiaester Ub~E2 transitório. Posteriormente, Ub é transferido para a proteína do substrato.

Isso pode ser feito de duas maneiras. Ou a ligadura E3 pode primeiro ligar-se ao E2, ou a liga ligase E3 pode ligar diretamente ub. Esta última forma resulta na formação de um intermediário E3~Ub. Em ambos os casos, a Ub está ligada à proteína do substrato por formação de vínculo isopeptida entre o grupo carboxíl terminal C da Ub e o grupo lysine Ɛ-amino do substrato6. O genoma humano codifica dois E1s, aproximadamente 40 E2s, e mais de 600 ligaduras putativas de ubiquitina7. Com base no mecanismo de transferência ub do E3, as ligases Ub são divididas em três categorias envolvendo ligaduras homologous para E6AP C-Terminus (HECT)-type, Really Interesting New Gene (RING)/U-box-type, e RING entre ligases tipo RING (RBR)8. Neste estudo, a caixa U contendo ligase, Carboxyl Terminus of HSC70-interacting Protein (CHIP), é usada como enzima E3 representativa. Em contraste com as enzimas E3 do tipo HECT que formam thioesters Ub~E3, o domínio da caixa U do CHIP liga E2~Ub e promove a transferência subsequente de Ub/substrato diretamente da enzima E28,9. Com base na importância da caixa U para a função enzimática, um mutante de caixa U inativo, CHIP(H260Q), é utilizado como um controle. CHIP(H260Q) não se liga aos seus E2s cognatos, perdendo assim sua atividade de ligadura E310.

A ubiquidade proteica desempenha um papel crucial na regulação de uma infinidade de eventos celulares em células eucarióticas. A diversidade de desfechos celulares que são promovidos pelo apego reversível das moléculas ub às proteínas substratos pode ser atribuída às características moleculares da Ub. Como a própria Ub contém sete resíduos de liseina (K) para posterior ubiquização, há uma rica variedade de tipos de cadeia Ub com diferentes tamanhos e/ou topologias11. Por exemplo, substratos podem ser modificados por uma única molécula Ub em uma (mono-ubiquização) ou lises múltiplas (multi-ubiquidade), e até mesmo por cadeias ub (poli-ubiquização)11. As cadeias ub são formadas homo ou heterotipicamente através dos mesmos ou diferentes resíduos de ub, o que poderia até resultar em cadeias ub ramificadas9. Assim, a ubiquização proteica leva a diversos arranjos de moléculas ub que fornecem informações específicas, por exemplo,para degradação, ativação ou localização de proteínas conjugadas12,13. Esses diferentes sinais ub permitem a reprogramação rápida de vias de sinalização celular, o que é um requisito importante para a capacidade da célula de responder às mudanças nas necessidades ambientais.

Um aspecto central da ubiquização está relacionado ao controle da qualidade da proteína. Proteínas mal dobradas ou irreversivelmente danificadas devem ser degradadas e substituídas por proteínas recém-sintetizadas para manter a homeostase proteica ou proteostase14. O controle de qualidade E3 ligase, CHIP, colabora com acompanhantes moleculares na degradação dependente de Ub de proteínas danificadas9,15,16,17. Além disso, o CHIP regula a estabilidade do acompanhante dirigido por miosina, UNC-45B (Unc-45 Homolog B), que é fortemente coordenado com função muscular e desvios dos níveis ideais levam à miopatia humana18,19,20,21. A degradação do UNC-45B pelo proteasome 26S é mediada pelo apego de uma cadeia de9poly-Ub ligada a K48 . Na ausência de proteínas de substrato, o CHIP realiza a auto-ubiquização10,22,23, que é característica das ligaduras de ubiquitina RING/U E324,25 e considerada para regular a atividade ligadura26. A aplicação dos métodos de ensaio de onipresença in vitro descritos neste artigo ajudou a identificar sistematicamente enzimas E2 que se unem ao CHIP para promover a formação de cadeias poli-ub gratuitas e/ou auto-ubiquização do CHIP (seção de protocolo 2). Além disso, observou-se a ubiquização dependente do CHIP da UNC-45B, que é um substrato conhecido da ligadura E318,19 (seção de protocolo 3). Em última análise, a transferência dependente de CHIP de Ub ativado do tioester Ub~E2 foi monitorada (seção de protocolo 4).

Protocolo

1. Preparação de tampões e reagentes

NOTA: Buffers e reagentes que foram preparados manualmente no laboratório estão listados abaixo. Todos os outros buffers e reagentes utilizados nos protocolos foram comprados de diferentes fontes e utilizados de acordo com as instruções dos fabricantes.

  1. Prepare 10x salina tamponada com fosfato (10x PBS). Para isso, misturar 1,37 M de cloreto de sódio (NaCl), cloreto de potássio de 27 mM (KCl), 80 mM de dihidrato de dissódio-hidrogênio-fosfato (Na2HPO4.2 H2O), e 20 mM de fosfato de potássio-dihidrogênio (KH2PO4) em 1 L de H2O destilado duplo (ddH2O). Autoclave o PBS 10x, e prepare uma solução PBS 1x em ddH2O.
    1. A autoclavagem é realizada por 15 min a 121 °C e 98,9 kPa.
      NOTA: A autoclavagem é realizada nessas condições para todos os buffers e soluções. Se não for indicado de outra forma, as soluções são armazenadas à temperatura ambiente (RT).
  2. Prepare 1 L de solução PBS-Tween (PBS-T) adicionando 0,1% Tween a 1 L de 1x PBS.
  3. Prepare 10 mL de uma solução de estoque de L-lysine de 0,5 M L dissolvendo L-lysine em ddH2O. Aliquot L-lysine em porções de 1 mL, e armazene-as a -20 °C até uso adicional.
    NOTA: A l-lysina pode ser congelada e descongelada repetidamente.
  4. Prepare uma solução de 0,25 M de diamina de diamina tetra actic (EDTA) dissolvendo EDTA em 200 mL de ddH2O.
    1. Ajuste o pH para 8,0 com hidróxido de sódio (NaOH).
    2. Ajuste o volume para 250 mL com ddH2O.
    3. Autoclave a solução.
  5. Prepare 10 mL de uma solução de albumina de soro bovino de 20 mg/mL (BSA) dissolvendo bsa em ddH2O. Armazene a -20 °C em 200 alíquotas μL.
    NOTA: A BSA pode ser congelada e descongelada repetidamente.
  6. Prepare 1 L de 2-(N-morpholino)ácido sulfônico de etano (MES) dissolvendo 50 mM MES, 50 mM Base Tris, 3,47 mM sulfato de dodecyl de sódio (SDS) e 1,03 mM EDTA em 0,9 L de ddH2O. Depois de misturar corretamente, ajuste o volume para 1 L.
    1. O pH do buffer 1x é 7.6. Não ajuste o pH com ácido ou base.
  7. Prepare 200 mL de solução de bloqueio (5% de leite) dissolvendo 10 g de leite em pó em 1x PBS-T. Armazene a solução de bloqueio a 4 °C por até uma semana.
  8. Prepare 1 L de tampão de transferência (ver a Tabela de Materiais) de acordo com a instrução do fabricante.
  9. Prepare o buffer de amostra SDS 2x dissolvendo a base tris de 125 mM, 4% SDS, 4% glicerol, 0,03% azul bromofenol e 50 μL/mL de β-mercaptoethanol em 50 mL ddH2O. Aliquot em porções de 1 mL, e armazenar a -20 °C até usar.

2. Ensaio de auto-ubiquização in vitro

  1. Preparação e execução de ensaios
    1. Calcule o volume de cada reagente necessário por reação com base nas molaridades dadas das proteínas e nas concentrações proteicas das soluções proteicas. Por reação de auto-ubiquização, use 100 nM E1, 1 μM E2, 1 μM E3 e 50 μM Ub. Ajuste o volume da reação para 20 μL com ddH2O.
      NOTA: A solução ATP e o buffer de ubiquização foram comprados como soluções de estoque 10x e usados em 1x.
    2. Prepare um esquema de pipetting para todas as reações. Teste nove enzimas E2 diferentes para sua capacidade de funcionar (I) com CHIP, (II) com um mutante CHIP (H260Q) catalíticomente inativo, e (III) sem CHIP em reações individuais de ubiquização.
    3. Para evitar erros de pipetação, prepare uma mistura mestre no gelo que contenha o volume necessário para todas as reações mais uma reação extra. Calcule a quantidade de mistura mestre necessária por reação.
      NOTA: Os componentes do mix mestre são reagentes igualmente necessários para cada reação, ou seja,., E1, E3, Ub, ATP e tampão de ubiquização.
    4. Adicione ddH2O e misture mestremente aos tubos de reação de corrente de polimerase (PCR). Mantenha os tubos no gelo.
    5. Antes de iniciar as reações de ubiquização adicionando as enzimas E2, configure um ciclo de calor PCR com o seguinte programa: 2 h, 37 °C seguido de 4 °C, infinitamente.
    6. Adicione 1 μM das enzimas E2 nos respectivos tubos e incubar as amostras no ciclo térmico PCR pelo período de tempo indicado.
    7. Depois de 2h, adicione o buffer de amostra SDS a cada reação e misture por pipetação para cima e para baixo várias vezes.
      NOTA: O volume necessário do buffer amostral depende da concentração de estoque do buffer amostral. Aqui, 20 μL de tampão amostra de SDS 2x foram adicionados a cada reação.
    8. Ferva as amostras imediatamente a 95 °C por 5 min, e continue com eletroforese de gel de poliacrilamida (PAGE). Armazene as proteínas desnaturadas a -20 °C.
  2. Eletroforese de gel e mancha ocidental
    1. Após o descongelamento, gire as amostras por aproximadamente 10 s e carregue o gel SDS-PAGE. Use uma escada de proteína como referência de tamanho.
      NOTA: Aqui, foram utilizados 4-12% géis gradientes Bis-Tris e 3 μL de escada proteica. Divida os volumes amostrais e carregue dois géis igualmente usando 20 μL de cada amostra.
    2. Execute o gel em 160-200 V por aproximadamente 30-45 min para que a frente da amostra atinja a parte inferior do gel.
    3. Transfira cada gel para um recipiente plástico cheio de tampão de manchas semidry e incuba-o por 2-5 min na RT. Remova o gel de empilhamento.
    4. Prepare duas peças de papel de mancha do tamanho de gel e uma membrana de nitrocelulose do tamanho de gel por gel SDS e pré-mergulhe em tampão de manchas semidry. Monte o sanduíche de mancha ocidental (WB) em uma câmara WB de baixo para cima na seguinte ordem: papel manchador, membrana nitrocelulose, gel SDS-PAGE, papel de mancha.
    5. Remova bolhas de ar que podem ter ficado presas entre as camadas do sanduíche. Para isso, use um rolo para rolar cuidadosamente o sanduíche algumas vezes.
    6. Feche a câmara e deixe o excesso de tampão de manchas drenar.
    7. Coloque a câmara no respectivo dispositivo de manchas e utilize o seguinte programa para manchas semidórias: 25 V, 1,0 A, 30 min.
    8. Transfira a membrana manchada para um recipiente plástico cheio de solução de bloqueio e incuba por 30 minutos na RT.
    9. Prepare a solução de anticorpos primário adicionando o anticorpo a 10 mL de PBS-T contendo um reagente de bloqueio (ver a Tabela de Materiais).
      NOTA: A concentração de trabalho do anticorpo é específica de anticorpos. Neste caso, um anticorpo anti-ubiquitina de camundongo monoclonal foi usado em uma diluição de 1:5.000. Para o segundo gel, um anticorpo anti-CHIP de coelho monoclonal foi usado em 1:5.000 em PBS-T/reagente de bloqueio.
    10. Substitua a solução de bloqueio pela solução de anticorpos primários e incuba durante a noite a 4 °C em um roqueiro.
    11. Lave a membrana três vezes por 10 minutos com PBS-T.
    12. Prepare a solução de anticorpos secundários adicionando o respectivo anticorpo a 10 mL de PBS-T.
      NOTA: Aqui, anticorpos anti-rato e camundongos são usados em uma diluição de 1:10.000.
    13. Incubar a membrana com o anticorpo secundário por 1 h no RT em um roqueiro.
    14. Lave a membrana três vezes por 5 minutos com PBS-T.
  3. Análise de dados
    1. Adicione reagentes de detecção de manchas ocidentais para anticorpos conjugados por rabanete (HRP) à membrana lavada de acordo com as instruções do fabricante e capture o sinal HRP usando películas de raios-X ou uma câmera de dispositivo acoplada a carga(Figura 1).

3. Ensaio de ubiquização de substrato in vitro

  1. Preparação e execução de ensaios
    1. Calcule o volume de cada reagente necessário por reação, com base nas molaridades dadas das proteínas e nas concentrações proteicas das soluções proteicas. Por reação de ubiquização substrato, use 100 nM E1, 1 μM E2, 1 μM E3, 1 μM substrato e 50 μM Ub. Use solução ATP 10x e tampão de ubiquização de 10x em 1x. Ajuste o volume da reação de ubiquização do substrato para 20 μL com ddH2O.
    2. Prepare um esquema de pipetting para todas as reações. Inclua reações de controle adequadas verificando se a ubiquização do substrato é específica do E3. Use a proteína UNC-45B como um substrato representativo do CHIP e um mutante CHIP cataticamente inativo (H260Q) como controle. Preparar as seguintes reações: E1, E2, Ub mix (incluindo Ub, ATP, tampão de ubiquidade); E1, E2, Ub mix, UNC-45B; E1, E2, Ub mix, CHIP(H260Q), UNC-45B; e E1, E2, Ub mix, CHIP, UNC-45B.
    3. Para evitar erros de pipetação, prepare uma mistura mestre no gelo que contenha o volume necessário para todas as reações mais uma reação extra. Calcule o volume da mistura mestre que é necessária por reação.
      NOTA: Os componentes de mixagem mestre para este ensaio incluem E1, E2, Ub, ATP e tampão de ubiquidade.
    4. Adicione componentes de reação na seguinte ordem: ddH2O, substrato, ligadura E3.
    5. Antes de iniciar a reação de ubiquização por adição do mix mestre, configure um cicloviário térmico PCR com o seguinte programa: 2 h, 37 °C seguido de 4 °C, infinitamente.
    6. Adicione a mistura mestre a cada tubo e incuba as amostras no ciclo-de-tempo térmico PCR pelo período de tempo indicado.
    7. Depois de 2 h, adicione 2x tampão de amostra SDS a cada reação, e misture por pipetar para cima e para baixo várias vezes.
    8. Após a corrida, ferva as amostras imediatamente a 95 °C por 5 minutos e continue com PAGE. Alternativamente, armazene as proteínas desnaturadas a -20 °C.
  2. Eletroforese de gel e mancha ocidental
    1. Realize eletroforese de gel e mancha ocidental conforme descrito na seção 2.2. Utilize anticorpos específicos para a detecção do substrato e da ligadura E3, respectivamente.
      NOTA: Aqui, o UNC-45B é fundido a uma etiqueta de proteína de polipeptídeo derivada do produto genético c-myc que permite o uso de um anticorpo anti-MYC de camundongo monoclonal. O Anti-MYC é usado em 1:10.000.
  3. Análise de dados
    1. Realizar análise de dados conforme descrito na seção 2.3 (Figura 2).

4. Ensaio de descarga de lysina

  1. Preparação e execução de ensaios
    1. Carregamento da enzima E2 com Ub by E1
      1. Calcule o volume de cada reagente necessário por reação com base nas molaridades dadas das proteínas e nas concentrações proteicas das soluções proteicas. Por reação de carregamento, use 2 μM E1, 4 μM E2 e 4 μM sem ubiquitina (Ub K0). Use 10x ATP e 10x ubiquitylation buffer em 1x. Ajuste o volume da reação de carregamento para 20 μL com ddH20.
        NOTA: O mutante Ub K0 semlise semlise é usado para impor a produção exclusiva do E2 mono-ubinciítulado. Ub tipo selvagem também pode ser usado; no entanto, isso pode levar a diversas modificações de E2~Ub (por exemplo,poli-ubiquidade do E2), que são mais difíceis de analisar. Para uso pela primeira vez ou ao usar uma nova enzima E2, determine o nível de carregamento ub no E2 que pode ser alcançado pelo E1. Para determinar o rendimento do carregamento, visualize o E2 não carregado via coloração Coomassie. Aqui, aproximadamente metade do Ub K0 foi convertido de forma confiável para UBE2D2~Ub ao usar relações equimolar de UBE2D2 e Ub K0(Figura Suplementar S2A).
      2. Prepare um esquema de pipetação para a reação de carregamento. Ajuste o volume da reação de carregamento às reações de descarga subsequentes de escolha, por exemplo,use CHIP e CHIP(H260Q) em reações individuais de descarga. Assim, prepare o dobro do volume de uma reação de carregamento.
        NOTA: Para uso pela primeira vez, teste diferentes concentrações da ligadura E3 de escolha para monitorar as condições ideais de descarga e analise-as por manchas ocidentais. Em uma condição ideal, a descarga de Ub a partir de E2 aumentará com o tempo até que a respectiva banda de proteína E2~Ub desapareça.
      3. Incubar a reação de carregamento por 15 min a 37 °C.
    2. Término da reação de cobrança
      1. Pare a reação de carregamento por adição de apyrase em uma concentração final de 1,8 U/mL. Realizar a incubação com apiráse por 5 min na RT, seguido pela adição de EDTA em uma concentração final de 30 mM. Ajuste o volume da reação de carregamento para 30 μL com ddH2O.
        NOTA: A apyrase é usado para converter moléculas DE ATP em moléculas de ADP (difosfato de adenosina). Como a atividade da enzima E1 é dependente de ATP, o E1 não pode mais carregar o E2. O EDTA é adicionalmente usado para garantir que o E1 seja inibido pela extinção de íons Mg2+ que são cofatores necessários para o E1. O volume de apirase necessário para parar a reação pode variar entre as condições de ensaio. Embora a apyrase por si só já sacia as moléculas atp disponíveis, uma combinação de apyrase e EDTA foi mais eficaz em parar a reação de carregamento para o par E1-UBE2D2. Como parar a reação é um fator crítico para a reprodutibilidade do ensaio, uma parada eficiente deve ser testada para novos pares E1-E2. Para isso, configure uma reação de carregamento, pare-a e colete amostras em pontos de tempo específicos, por exemplo,depois de 2, 5, 10 e 15 minutos. Os níveis não alterados de E2~Ub indicam que a reação parou, e que o tioester ficou estável durante esse período de tempo(Figura Suplementar S2B).
    3. Descarregamento de E2~Ub por E3
      1. Prepare quatro tubos correspondentes aos diferentes pontos de tempo (t0, t1, t2, t3); adicionar tampão amostral não redutor (6,7 μL de tampão de sulfato de dodecyl de lítio 4x (LDS) a cada tubo.
        NOTA: Não utilize agente redutor no buffer de amostra.
      2. Remova 6 μL da reação de carregamento parado para t0e ajuste o volume para 20 μL com ddH2O.
      3. Incubar a amostra t0 por 10 min a 70 °C.
        NOTA: Não ferva a amostra estendendo o tempo de incubação, pois os tioestres são labile a temperaturas mais altas.
      4. Calcule o volume de cada reagente necessário por reação de descarga. Utilize os 24 μL restantes do E2 carregado e adicione 10 mM L-lysine, 1 mg/ml BSA e 500 nM da liga ligase E3. Use o tampão de ubiquização em 1x e ajuste o volume para 80 μL com ddH2O.
      5. Prepare um esquema de pipetagem para todas as reações de descarga e use CHIP(H260Q) como controle, além de CHIP(WT).
      6. Configure as reações de descarga no gelo adicionando os componentes necessários na seguinte ordem: ddH2O, tampão de ubiquidade, BSA, lise, ligadura E3 e o E2 carregado para iniciar a reação.
      7. Incubar a reação de descarga na RT.
      8. Pegue amostras após 5, 30 e 60 min transferindo 20 μL da reação de descarga para os respectivos tubos de amostra.
        NOTA: Os pontos de tempo adequados que permitem o monitoramento adequado da descarga podem variar entre os pares E2-E3.
      9. Vórtice a amostra imediatamente, e incuba-la a 70 °C por 10 min.
      10. Prossiga diretamente com page.
        NOTA: Os tiostontes E2~Ub podem ser labile mesmo após a desnaturação no buffer de amostra. Assim, a eletroforese gel deve ser realizada diretamente após a execução do ensaio.
  2. Eletroforese de gel e mancha ocidental
    1. Realize a eletroforese do gel e a mancha ocidental conforme descrito na seção 2.2. Use um anticorpo específico ub e, se disponível, também use um anticorpo específico do E3 que foi criado em uma espécie diferente, permitindo a detecção simultânea do sinal ligase Ub e E3.
  3. Análise de dados
    1. Realizar análise de dados conforme descrito na seção 2.3 (Figura 3).

Resultados

Para identificar enzimas E2 que cooperam com o CHIP ligase ubiquitin, um conjunto de candidatos E2 foi testado em reações individuais de ubiquização in vitro. Os pares E2-E3 cooperantes foram monitorados pela formação de produtos de ubiquização dependentes do E3, ou seja,auto-ubiquidade da ligadura E3 e formação de polímeros Ub livres. Os produtos de ubiquização foram analisados por manchas ocidentais. A interpretação dos dados baseia-se na comparação de tamanho das faixas proteicas res...

Discussão

Este artigo descreve métodos básicos de ubiquização in vitro para a análise da função ligase E3. Ao realizar ensaios de onipresençação in vitro, deve-se considerar que algumas enzimas E2 podem realizar auto-ubiquidade devido ao ataque de sua cisteína ativa em seus próprios resíduos de lisesina que estão localizados nas proximidades do local ativo30. Para contornar esse problema, recomenda-se o uso de um mutante E2 no qual o respectivo resíduo de lise é trocado por...

Divulgações

Os autores não têm conflitos de interesse.

Agradecimentos

Agradecemos aos membros do nosso laboratório por discussão crítica e conselhos úteis sobre o manuscrito. Pedimos desculpas por não ter citado contribuições valiosas devido à limitação de tamanho. Este trabalho é apoiado pela Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG, German Research Foundation) - SFB 1218 - Projektnumber 269925409 e Cluster of Excellence EXC 229/ CECAD to TH. Este trabalho foi financiado pela Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG, German Research Foundation) sob a Estratégia de Excelência da Alemanha - EXC 2030 - 390661388 e - SFB 1218 - Projektnumber 269925409 à T.H. Diese Arbeit wurde von der Deutschen Forschungsgemeinschaft (DFG) im Rahmen der deutschen Exzellenzstrategie - EXC 2030 - 390661388 und - SFB 1218 - Projektnummer: 269925409 um T.H. gefördert.

Materiais

NameCompanyCatalog NumberComments
Amershan Protran 0.1 µm NCGE Healthcare10600000nitrocellulose membrane
Anti-CHIPCell Signaling2080Monoclonal rabbit anti-CHIP antibody, clone C3B6
Anti-MYCRocheOP10Monoclonal mouse anti-MYC antibody, clone 9E10
Anti-ubiquitinUpstate05-944Monoclonal mouse anti-Ub antibody, clone P4D1-A11
ApyraseSigmaA6535-100UN
ATP (10x)Enzo12091903
BSASigmaA6003-10G
EDTARoth8043.2
KClRoth6781.1
K2HPO4RothP749.2
KH2PO4Roth3904.1
LDS sample buffer (4x)novexB0007
L-LysineSigmaL5501-5G
MESRoth4256.4
MeOHVWR Chemicals2,08,47,307100%
MilchpulverRothT145.3
NaClRothP029.3
NuPAGE AntioxidantinvitrogenNP0005
NuPAGE Transfer buffer (20x)novexNP0006-1
Page ruler plusThermo Fisher26619Protein ladder
RotiBlockRothA151.1Blocking reagent
SDS (20%)Roth1057.1
S1000 Thermal CyclerBio Rad1852196
Trans-Blot TurboBio Rad1704150EDUTransfer system
Tris baseRoth4855.3
Tween 20Roth9127.2
UbcH Enzyme SetBostonBiochemK-980BE2 enzymes
UbiquitinBostonBiochemU-100H
Ubiquitin-activating enzyme E1EnzoBML-UW941U-0050
Ubiquitylation buffer (10x)EnzoBML-KW9885-001
Whatman blotting paperBio Rad1703969Extra thick filter paper

Referências

  1. Kuhlbrodt, K., Mouysset, J., Hoppe, T. Orchestra for assembly and fate of polyubiquitin chains. Essays in Biochemistry. 41, 1-14 (2005).
  2. Pickart, C. M., Eddins, M. J. Ubiquitin: structures, functions, mechanisms. Biochimica et Biophysica Acta. 1695 (1-3), 55-72 (2004).
  3. Dye, B. T., Schulman, B. A. Structural mechanisms underlying posttranslational modification by ubiquitin-like proteins. Annual Review of Biophysics and Biomolecular Structure. 36, 131-150 (2007).
  4. Koegl, M., et al. A novel ubiquitination factor, E4, is involved in multiubiquitin chain assembly. Cell. 96 (5), 635-644 (1999).
  5. Hoppe, T. Multiubiquitylation by E4 enzymes: 'one size' doesn't fit all. Trends in Biochemical Sciences. 30 (4), 183-187 (2005).
  6. Stewart, M. D., Ritterhoff, T., Klevit, R. E., Brzovic, P. S. E2 enzymes: more than just the middle men. Cell Research. 26 (4), 423-440 (2016).
  7. Clague, M. J., Heride, C., Urbé, S. The demographics of the ubiquitin system. Trends in Cell Biology. 25 (7), 417-426 (2015).
  8. Buetow, L., Huang, D. T. Structural insights into the catalysis and regulation of E3 ubiquitin ligases. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 17 (10), 626-642 (2016).
  9. French, M. E., Koehler, C. F., Hunter, T. Emerging functions of branched ubiquitin chains. Cell Discovery. 7, 6 (2021).
  10. Hatakeyama, S., Yada, M., Matsumoto, M., Ishida, N., Nakayama, K. I. U box proteins as a new family of ubiquitin-protein ligases. Journal of Biological Chemistry. 276 (35), 33111-33120 (2001).
  11. Herhaus, L., Dikic, I. Expanding the ubiquitin code through post-translational modification. EMBO Reports. 16 (9), 1071-1083 (2015).
  12. Deshaies, R. J., Joazeiro, C. A. RING domain E3 ubiquitin ligases. Annual Review of Biochemistry. 78, 399-434 (2009).
  13. Hochstrasser, M. Lingering mysteries of ubiquitin-chain assembly. Cell. 124 (1), 27-34 (2006).
  14. Hoppe, T., Cohen, E. Organismal protein homeostasis mechanisms. Genetics. 215 (4), 889-901 (2020).
  15. Okiyoneda, T., et al. Peripheral protein quality control removes unfolded CFTR from the plasma membrane. Science. 329 (5993), 805-810 (1997).
  16. Tawo, R., et al. The Ubiquitin ligase CHIP integrates proteostasis and aging by regulation of insulin receptor turnover. Cell. 169 (3), 470-482 (2017).
  17. Albert, M. C., et al. CHIP ubiquitylates NOXA and induces its lysosomal degradation in response to DNA damage. Cell Death and Disease. 11 (9), 740 (2020).
  18. Hoppe, T., et al. Regulation of the myosin-directed chaperone UNC-45 by a novel E3/E4-multiubiquitylation complex in C. elegans. Cell. 118 (3), 337-349 (2004).
  19. Kim, J., Löwe, T., Hoppe, T. Protein quality control gets muscle into shape. Trends in Cell Biology. 18 (6), 264-272 (2008).
  20. Janiesch, P. C., et al. The ubiquitin-selective chaperone CDC-48/p97 links myosin assembly to human myopathy. Nature Cell Biology. 9 (4), 379-390 (2007).
  21. Donkervoort, S., et al. Pathogenic variants in the myosin chaperone UNC-45B cause progressive myopathy with eccentric cores. The American Journal of Human Genetics. 107 (6), 1078-1095 (2020).
  22. Murata, S., Minami, Y., Minami, M., Chiba, T., Tanaka, K. CHIP is a chaperone-dependent E3 ligase that ubiquitylates unfolded protein. EMBO Reports. 2 (12), 1133-1138 (2001).
  23. Jiang, J., et al. CHIP is a U-box-dependent E3 ubiquitin ligase: identification of Hsc70 as a target for ubiquitylation. Journal of Biological Chemistry. 276 (64), 42938-42944 (2001).
  24. Yang, Y., Yu, X. Regulation of apoptosis: the ubiquitous way. The FASEB Journal. 17 (8), 790-799 (2003).
  25. Lamothe, B., et al. TRAF6 ubiquitin ligase is essential for RANKL signaling and osteoclast differentiation. Biochemical and Biophysical Research Communication. 359 (4), 1044-1049 (2007).
  26. Amemiya, Y., Azmi, P., Seth, A. Autoubiquitination of BCA2 RING E3 ligase regulates its own stability and affects cell migration. Molecular Cancer Research. 6 (9), 1385 (2008).
  27. Brzovic, P. S., Lissounov, A., Christensen, D. E., Hoyt, D. W., Klevit, R. E. A UbcH5/ubiquitin noncovalent complex is required for processive BRCA1-directed ubiquitination. Molecular Cell. 21 (6), 873-880 (2006).
  28. Sakata, E., et al. Crystal structure of UbcH5b~ubiquitin intermediate: Insight into the formation of the self-assembled E2~Ub conjugates. Structure. 18 (1), 138-147 (2010).
  29. Eddins, M. J., Carlile, C. M., Gomez, K. M., Pickart, C. M., Wolberger, C. Mms2-Ubc13 covalently bound to ubiquitin reveals the structural basis of linkage-specific polyubiquitin chain formation. Nature Structural and Molecular Biology. 13 (10), 915-920 (2006).
  30. Buetow, L., et al. Activation of a primed RING E3-E2 ubiquitin complex by non-covalent ubiquitin. Molecular Cell. 58 (2), 297-310 (2015).
  31. Dou, H., Buetow, L., Sibbet, G. J., Cameron, K., Huang, D. T. BIRC7-E2 ubiquitin conjugate structure reveals the mechanism of ubiquitin transfer by a RING dimer. Nature Structural and Molecular Biology. 19 (9), 876-883 (2012).
  32. McKenna, S., et al. Noncovalent interaction between ubiquitin and the human DNA repair protein Mms2 is required for Ubc13-mediated polyubiquitination. Journal of Biological Chemistry. 276 (43), 40120-40125 (2001).
  33. Plechanovová, A., et al. Mechanism of ubiquitylation by dimeric RING ligase RNF4. Nature Structural Biology. 18 (9), 1052-1059 (2011).
  34. Pierce, N. W., Kleiger, G., Shan, S. O., Deshaies, R. J. Detection of sequential polyubiquitylation on a millisecond timescale. Nature. 462 (7273), 615-619 (2009).
  35. Jain, A. K., Barton, M. C. Regulation of p53: TRIM24 enters the RING. Cell Cycle. 8 (22), 3668-3674 (2009).
  36. Swatek, K. N., Komander, D. Ubiquitin modifications. Cell Research. 26, 399-422 (2016).
  37. Yan, K., et al. The role of K63-linked polyubiquitination in cardiac hypertrophy. Journal of Cellular and Molecular Medicine. 22 (10), 4558-4567 (2018).
  38. Dammer, E. B., et al. Polyubiquitin linkage profiles in three models of proteolytic stress suggest the etiology of Alzheimer disease. Journal of Biological Chemistry. 286 (12), 10457-10465 (2011).

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