Yazarlar
Bize Ulaşın

Oturum Aç

Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliği gereklidir. Oturum açın veya ücretsiz deneme sürümünü başlatın.

Bu Makalede

  • Özet
  • Özet
  • Giriş
  • Protokol
  • Sonuçlar
  • Tartışmalar
  • Açıklamalar
  • Teşekkürler
  • Malzemeler
  • Referanslar
  • Yeniden Basımlar ve İzinler

Özet

Bu çalışma, E3 ubiquitin ligase katalitik aktivitesinin analizi için ayrıntılı in vitro ubiquitylation tahlil protokolleri sunmaktadır. Rekombinant proteinler Escherichia coli kültürü gibi prokaryotik sistemler kullanılarak ifade edildi.

Özet

Ubiquitin'in (Ub) substrat proteininin iç lizin kalıntılarına, her yerde bulunan bir işlem olarak adlandırılan bir işleme bağlanması, ökaryotik organizmalardaki en önemli çeviri sonrası değişikliklerden birini temsil eder. Her yerde bulunan, ubiquitin aktive edici enzimler (E1 enzimleri), ubiquitin-konjugating enzimleri (E2 enzimleri) ve ubiquitin ligazları (E3 enzimleri) ve bazen de ubiquitin zinciri uzama faktörleri (E4 enzimleri) dahil olmak üzere üç enzim sınıfından oluşan sıralı bir basamaklama ile aracılık edilir. Burada, E3 ubiquitin ligaz aktivitesinin değerlendirilmesine, E2-E3 çiftleri arasındaki işbirliğine ve substrat seçimine olanak sağlayan her yerde bulunan tahliller için in vitro protokoller sağlanmaktadır. İşbirliği yapan E2-E3 çiftleri, ücretsiz poli-ubiquitin zincirlerinin ve/veya E3 ligase'in otomatik olarak her yerde bulunmasına dikkat edilerek taranabilir. Substrat her yerde bulunan, E3 ligazın seçici bağlanması ile tanımlanır ve in vitro reaksiyonun batı lekesi ile tespit edilebilir. Ayrıca, fonksiyonel E2-E3 işbirliğinin doğrudan değerlendirilmesi için yararlı bir araç olan bir E2 ~ Ub deşarj tahlilleri açıklanmıştır. Burada, E3 bağımlı ubiquitin transferi, ilgili E2 enziminden serbest lizin amino asitlerine (her yerde bulunan substratı taklit eden) veya E3 ligazının iç lizinlerine (otomatik her yerde bulunan) takip edilir. Sonuç olarak, E3 ligaz katalitik işlevselliğini ele almak için hızlı ve gerçekleştirilmesi kolay üç farklı in vitro protokol sağlanmaktadır.

Giriş

Ubiquitylation, Ub'in bir substrat proteinine birlikte bağlandığı süreçtir1. Ub modifikasyonu, üç farklı enzim sınıfının, yaniUb aktive edici enzimlerin (E1'ler), Ub-konjugating enzimlerinin (E2s), Ub ligases (E3s) ve muhtemelen Ub zincir uzama faktörlerinin (E4s)2,3,4,5'inetkisini içeren ardışık enzymatic reaksiyonlarla katalizöre edilir. Adenozin trifosfat (ATP)- ve magnezyumdan (Mg2+)- Ub'un E1 tarafından bağımlı aktivasyonundan sonra, E1'in aktif bölge sisteini Ub'un C terminali glisinine saldırarak bir tiyoester kompleksi oluşturur (Ub ~ E1). ATP hidrolizinden alınan enerji, Ub'un aşağıdaki enzim kaskadı boyunca tutulan yüksek enerji geçiş durumuna geçmesine neden olur. Daha sonra, E2 enzimi aktif Ub'yi iç katalitik sisteinine aktarır ve böylece geçici bir Ub ~ E2 tiyoester bağı oluşturur. Daha sonra, Ub substrat proteinine aktarılır.

Bu iki şekilde yapılabilir. E3 ligase önce E2'ye bağlanabilir veya E3 ligase doğrudan Ub'a bağlanabilir. İkinci yol bir E3 ~ Ub ara oluşumu ile sonuçlanır. Her iki durumda da, Ub, Ub'nin C-terminal karboksil grubu ile substratın lizin Ɛ-amino grubu arasında bir izopenptid bağının oluşumu ile substrat proteinine bağlanır6. İnsan genomları iki E1, yaklaşık 40 E2 ve 600'den fazla putatif ubiquitin ligases7kodlar. E3'ün Ub transfer mekanizmasına dayanarak, Ub ligases Homologous ila E6AP C-Terminus (HECT)- tipi, Gerçekten İlginç Yeni Gen (RING)/U-box tipi ve RING (RBR) tipi bağlar arasındaki RING8'i içeren üç kategoriye ayrılır. Bu çalışmada, ligaz içeren U kutusu, HSC70 etkileşimli Proteinin (CHIP) Karboksil Terminus'u temsili bir E3 enzimi olarak kullanılmaktadır. Ub ~ E3 tiyosesterlerini oluşturan HECT tipi E3 enzimlerinin aksine, CHIP'in U kutusu etki alanı E2 ~ Ub'yi bağlar ve sonraki Ub / substrat transferini doğrudan E2 enziminden8,9. U kutusunun enzymatic fonksiyon için önemine dayanarak, etkin olmayan bir CHIP U kutusu mutant, CHIP (H260Q), bir kontrol olarak kullanılır. CHIP (H260Q) konyak E2'lerine bağlanamaz, böylece E3 ligaz aktivitesinikaybeder 10.

Protein her yerde bulunma, ökaryotik hücrelerde çok sayıda hücresel olayın düzenlenmesinde çok önemli bir rol oynar. Ub moleküllerinin proteinleri substrata geri dönüşümlü olarak bağlaması ile teşvik edilen hücresel sonuçların çeşitliliği Ub'in moleküler özelliklerine bağlanabilir. Ub'un kendisi daha fazla her yerde bulunan yedi lizin (K) kalıntısı içerdiğinden, farklı boyutlarda ve / veya topolojilere sahip zengin Ub zincir türleri çeşitliliği vardır11. Örneğin, substratlar tek bir Ub molekülü tarafından tek bir Ub molekülü (mono-her yerde) veya çoklu lizinler (çoklu mono-her yerde) ve hatta Ub zincirleri (poli-her yerde)11ile değiştirilebilir. Ub zincirleri, Ub'nin aynı veya farklı lizin kalıntıları aracılığıyla homo veya heterotipik olarak oluşur, bu da dallı Ub zincirleri9ile bile sonuçlanabilir. Bu nedenle, protein her yerde bulunma, Ub moleküllerinin, örneğinkonjuge proteinlerin bozulması, aktivasyonu veya lokalizasyonu için belirli bilgiler sağlayan çeşitli düzenlemelerine yol açar12,13. Bu farklı Ub sinyalleri, hücresel sinyal yollarının hızlı bir şekilde yeniden programlanmasını sağlar ve bu da hücrenin değişen çevresel ihtiyaçlara yanıt verebilmesi için önemli bir gerekliliktir.

Her yerde bulunanın merkezi bir yönü protein kalite kontrolü ile ilgilidir. Yanlış katlanmış veya geri döndürülemez şekilde zarar görmüş proteinler bozulmalı ve protein homeostazını veya proteostazını korumak için yeni sentezlenmiş proteinlerle değiştirilmelidir14. Kalite kontrolü E3 ligase, CHIP, hasarlı proteinlerinUb'abağlı bozulmasında moleküler refakatçilerle işbirliği yapıyor 9,15,16,17. Bunun dışında CHIP, kas fonksiyonu ile sıkı bir şekilde koordine edilen ve optimum seviyelerden sapmalar insan miyopatisine yol açan18, 19,20,21olan miyosin yönlendirilmiş refakatçi UNC-45B'nin (Unc-45 Homolog B) stabilitesini düzenler. UNC-45B'nin 26S proteazom tarafından bozulması, K48 bağlantılı bir poli-Ub zincirininbağlanmasıyla aracılıkedilir 9 . Substrat proteinlerinin yokluğunda CHIP, RING/U-box E3 ubiquitin ligases 24,25'inkarakteristiği olan ve ligase aktivitesini düzenlediği düşünülen10,22, 23 otomatik her yerde10 , 22,23 ' ü gerçekleştirir. Bu makalede açıklanan in vitro her yerde test yöntemlerinin uygulanması, chip'in serbest poli-Ub zincirlerinin oluşumunu ve/veya otomatik olarak her yerde oluşturulmasını teşvik etmek için CHIP ile birlikte gelen E2 enzimlerinin sistematik olarak tanımlanmasına yardımcı oldu (protokol bölüm 2). Ayrıca, E3 ligaz18,19'un bilinen bir alt tabakası olan UNC-45B'nin CHIP'e bağımlı her yerde olduğu gözlenmiştir (protokol bölüm 3). Sonuç olarak, etkinleştirilen Ub'nin Ub ~E2 tiyoesterinden CHIP'e bağımlı transferi izlendi (protokol bölüm 4).

Protokol

1. Tamponların ve reaktiflerin hazırlanması

NOT: Laboratuvarda manuel olarak hazırlanan tamponlar ve reaktifler aşağıda listelenmiştir. Protokollerde kullanılan diğer tüm tamponlar ve reaktifler farklı kaynaklardan satın alınmış ve üreticilerin talimatlarına göre kullanılmıştır.

  1. 10x fosfat tamponlu salin (10x PBS) hazırlayın. Bu amaçla, karışım 1.37 M sodyum klorür (NaCl), 27 mM potasyum klorür (KCl), 80 mM disodiyum-hidrojen-fosfat dihidrat (Na2HPO4.2H2O) ve 20 mM potasyum-dihidrojen fosfat (KH2PO4) 1L çift damıtılmış H2O (ddH2O). 10x PBS'yi otomatik olarak örtün ve ddH2O'da 1x PBS çözümü hazırlayın.
    1. Otomatik kapanma 121 °C ve 98,9 kPa'da 15 dakika boyunca gerçekleştirilir.
      NOT: Otomatik kapanma, tüm tamponlar ve çözümler için bu koşullar altında gerçekleştirilir. Aksi belirtilmezse, çözeltiler oda sıcaklığında (RT) saklanır.
  2. 1X PBS'nin 1 L'sine %0,1 Ara ekleyerek 1 L PBS-Ara (PBS-T) çözeltisi hazırlayın.
  3. DdH 2 O. Aliquot L-lizin'deki L-lizini 1 mL porsiyonlarda eriterek0,5M L-lizin stok çözeltisinin 10 mL'lik kısmını hazırlayın ve bir sonraki kullanıma kadar -20 °C'de saklayın.
    NOT: L-lizin tekrar tekrar dondurulabilir ve çözülebilir.
  4. EDTA'yı 200 mLddH2 O'da eriterek 0,25 M etilen diamin tetra asetik asit (EDTA) çözeltisi hazırlayın.
    1. Sodyum hidroksit (NaOH) ile pH'ı 8,0'a ayarlayın.
    2. ddH 2 O ile ses seviyesini250mL'ye ayarlayın.
    3. Çözümü otomatik olarak örtün.
  5. BSA'yı ddH 2 O.'da 200 μL aliquots'ta-20°C'de çözerek 20 mg/mL sığır serum albümin (BSA) çözeltisinin 10 mL'lik kısmını hazırlayın.
    NOT: BSA tekrar tekrar dondurulabilir ve çözülebilir.
  6. 50 mM MES, 50 mM Tris tabanı, 3,47 mM sodyum dodecyl sülfat (SDS) ve 1,03 mM EDTA'yı 0,9 L dDH2O'da eriterek 1 L 2-(N-morfotin)etan sülfinik asit (MES) çalıştırma tamponu hazırlayın. Düzgün bir şekilde karıştırdıktan sonra ses seviyesini 1 L'ye ayarlayın.
    1. 1x arabelleğin pH'ı 7.6'dır. pH'ı asit veya bazla ayarlamayın.
  7. 10 g süt tozunun 1x PBS-T'de çözünmesiyle 200 mL blokaj çözeltisi (%5 süt) hazırlayın. Engelleme sokasını 4 °C'de bir haftaya kadar saklayın.
  8. Üreticilerin talimatına göre 1 L transfer tamponu hazırlayın (Malzeme Tablosunabakın).
  9. 125 mM Tris tabanı, %4 SDS, %4 gliserol, %0,03 bromofenol mavisi ve 50 μL/mL β-mercaptoethanol'u 1 mL porsiyonlarda 1 mL porsiyonlarda2xSDS numune tamponu hazırlayın ve kullanıma kadar -20 °C'de saklayın.

2. In vitro otomatik-ubiquitylation tahlil

  1. Tahlil hazırlama ve yürütme
    1. Proteinlerin verilen azı dişlerine ve protein çözeltilerinin protein konsantrasyonlarına bağlı olarak reaksiyon başına gereken her reaktifin hacmini hesaplayın. Otomatik her yerde bulunma reaksiyona göre 100 nM E1, 1 μM E2, 1 μM E3 ve 50 μM Ub kullanın. DDH 2 O ile reaksiyonun hacmini20 μL'yeayarlayın.
      NOT: ATP çözeltisi ve her yerde bulunan tampon 10x stok çözümleri olarak satın alınmış ve 1x'te kullanılmıştır.
    2. Tüm reaksiyonlar için bir pipetleme şeması hazırlayın. Chip ile (I), (II) katalitik olarak inaktif CHIP (H260Q) mutant ve (III) ile bireysel her yerde bulunan reaksiyonlarda CHIP olmadan çalışma yetenekleri için dokuz farklı E2 enzimini test edin.
    3. Pipetleme hatalarını önlemek için, tüm reaksiyonlar için gereken hacmi ve bir ekstra reaksiyon içeren buz üzerinde bir ana karışım hazırlayın. Reaksiyon başına gereken ana karışım miktarını hesaplayın.
      NOT: Ana karışım bileşenleri, her reaksiyon için eşit derecede gerekli olan reaktiflerdir, örneğinE1, E3, Ub, ATP ve her yerde bulunan tampon.
    4. Polimeraz zincir reaksiyonu (PCR) tüplerine ddH2O ve master mix ekleyin. Tüpleri buzda tut.
    5. E2 enzimlerini ekleyerek her yerde bulunan reaksiyonlara başlamadan önce, aşağıdaki programla bir PCR termal çevrimci kurun: 2 saat, 37 °C ve ardından 4 °C, sonsuz.
    6. İlgili tüplere 1 μM E2 enzimleri ekleyin ve pcr termal çevriminde belirtilen süre boyunca örnekleri kuluçkaya yatırın.
    7. 2 saat sonra, her reaksiyona SDS örnek arabelleği ekleyin ve birkaç kez yukarı ve aşağı pipetleme yaparak karıştırın.
      NOT: Numune arabelleği gerekli hacmi, numune arabelleği stok konsantrasyonuna bağlıdır. Burada her reaksiyona 20 μL 2x SDS numune tamponu eklendi.
    8. Numuneleri 95 °C'de 5 dakika kaynatın ve poliakrilamid jel elektroforez (PAGE) ile devam edin. Denatüre proteinleri -20 °C'de saklayın.
  2. Jel elektroforezi ve batı lekesi
    1. Çözdükten sonra, örnekleri yaklaşık 10 sn döndürün ve SDS-PAGE jelini yükleyin. Boyut referansı olarak bir protein merdiveni kullanın.
      NOT: Burada %4-12 Bis-Tris gradyan jelleri ve 3 μL protein merdiveni kullanılmıştır. Numune hacimlerini bölün ve her numunenin 20 μL'sini kullanarak iki jeli eşit olarak yükleyin.
    2. Jel 160-200 V'ta yaklaşık 30-45 dakika boyunca çalıştırın, böylece numune önü jelin altına ulaşır.
    3. Her jeli semidry blotting tamponu ile dolu plastik bir kaba aktarın ve RT'de 2-5 dakika kuluçkaya yatırın.
    4. SDS jel başına iki parça jel boyutlu şişkin kağıt ve jel büyüklüğünde nitroselüloz membran hazırlayın ve yarı yarıya şişirme tamponuna önceden batırın. Batı blot (WB) sandviçini aşağıdan yukarıya doğru bir WB odasında aşağıdaki sırayla birleştirin: şişkin kağıt, nitroselüloz membran, SDS-PAGE jeli, şişkin kağıt.
    5. Sandviç katmanları arasına sıkışmış olabilecek hava kabarcıklarını çıkarın. Bu amaçla, sandviçi birkaç kez dikkatlice yuvarlamak için bir silindir kullanın.
    6. Hazneyi kapatın ve fazla blot tamponunun boşalmasına izin verin.
    7. Odayı ilgili blotting cihazına yerleştirin ve semidry blotting için aşağıdaki programı kullanın: 25 V, 1.0 A, 30 dk.
    8. Şişirilmiş membranı blokaj çözeltisi ile dolu plastik bir kaba aktarın ve RT'de 30 dakika kuluçkaya yatırın.
    9. Antikoru bloke edici reaktif içeren 10 mL PBS-T'ye ekleyerek birincil antikor çözeltisini hazırlayın (bkz. Malzeme Tablosu).
      NOT: Antikorun çalışma konsantrasyonu antikora özgüdür. Bu durumda, 1:5.000 seyreltmede monoklonal fare anti-ubiquitin antikoru kullanıldı. İkinci jel için PBS-T/blokaj reaktifinde 1:5.000'de monoklonal tavşan anti-CHIP antikoru kullanıldı.
    10. Bloklama solüsyonını birincil antikor çözeltisi ile değiştirin ve bir rocker üzerinde 4 °C'de gece boyunca kuluçkaya yatırın.
    11. Membranı PBS-T ile 10 dakika boyunca üç kez yıkayın.
    12. İlgili antikor 10 mL PBS-T'ye ekleyerek ikincil antikor çözeltisini hazırlayın.
      NOT: Burada, keçi anti-fare ve fare anti-tavşan antikorları 1:10.000 seyreltmede kullanılır.
    13. Membranı bir rocker üzerinde RT'de 1 saat boyunca ikincil antikorla kuluçkaya yatırın.
    14. Membranı PBS-T ile 5 dakika boyunca üç kez yıkayın.
  3. Veri analizi
    1. Üreticinin talimatlarına göre yıkanmış zara yaban turpu peroksidaz (HRP) konjuge antikorları için batı leke algılama reaktifleri ekleyin ve X-ray filmleri veya şarj bağlantılı bir cihaz kamerası kullanarak HRP sinyalini yakalayın (Şekil 1).

3. In vitro substrat ubiquitylation tahlil

  1. Tahlil hazırlama ve yürütme
    1. Proteinlerin verilen azı dişlerine ve protein çözeltilerinin protein konsantrasyonlarına bağlı olarak reaksiyon başına gereken her reaktifin hacmini hesaplayın. Substrat her yerde bulunma reaksiyoni başına 100 nM E1, 1 μM E2, 1 μM E3, 1 μM substrat ve 50 μM Ub kullanın. 1x'te 10x ATP çözeltisi ve 10x her yerde bulunan tampon kullanın. Substrat her yerde bulunma reaksiyonunun hacmini ddH 2 O ile20 μL'ye ayarlayın.
    2. Tüm reaksiyonlar için bir pipetleme şeması hazırlayın. Substrat ubiquitylation'ın E3'e özgü olduğunu doğrulayan uygun kontrol reaksiyonlarını ekleyin. UNC-45B proteinini CHIP'in temsili bir alt tabakası ve kontrol olarak katalitik olarak inaktif chip mutant (H260Q) olarak kullanın. Aşağıdaki reaksiyonları hazırlayın: E1, E2, Ub karışımı (Ub, ATP, her yerde bulunan tampon dahil); E1, E2, Ub karışımı, UNC-45B; E1, E2, Ub karışımı, CHIP (H260Q), UNC-45B; ve E1, E2, Ub karışımı, CHIP, UNC-45B.
    3. Pipetleme hatalarını önlemek için, tüm reaksiyonlar için gereken hacmi ve bir ekstra reaksiyon içeren buz üzerinde bir ana karışım hazırlayın. Reaksiyon başına gereken ana karışımın hacmini hesaplayın.
      NOT: Bu test için ana karışım bileşenleri E1, E2, Ub, ATP ve her yerde bulunan tamponu içerir.
    4. Reaksiyon bileşenlerini aşağıdaki sırayla ekleyin: ddH2O, substrat, E3 ligase.
    5. Ana karışımı ekleyerek her yerde bulunan reaksiyona başlamadan önce, aşağıdaki programla bir PCR termal çevrimci kurun: 2 saat, 37 °C ve ardından 4 °C, sonsuz.
    6. Ana karışımı her tüpe ekleyin ve pcr termal çevriminde belirtilen süre boyunca numuneleri kuluçkaya yatırın.
    7. 2 saat sonra, her reaksiyona 2x SDS örnek arabelleği ekleyin ve birkaç kez yukarı ve aşağı pipetleme yaparak karıştırın.
    8. Çalıştırdıktan sonra, numuneleri 95 °C'de 5 dakika kaynatın ve PAGE ile devam edin. Alternatif olarak, denatüre proteinleri -20 ° C'de saklayın.
  2. Jel elektroforezi ve batı lekesi
    1. Bölüm 2.2'de açıklandığı gibi jel elektroforezi ve batı lekesi gerçekleştirin. Sırasıyla substratın ve E3 ligasenin tespiti için spesifik antikorlar kullanın.
      NOT: Burada UNC-45B, monoklonal fare anti-MYC antikorunun kullanılmasına izin veren c-myc gen ürününden elde edilen bir polipeptid protein etiketi ile kaynaştırır. Anti-MYC 1:10.000'de kullanılır.
  3. Veri analizi
    1. Bölüm 2.3'te açıklandığı gibi veri analizi yapın (Şekil 2).

4. Lizin deşarjı tahlil

  1. Tahlil hazırlama ve yürütme
    1. E2 enziminin E1 tarafından Ub ile şarjı
      1. Proteinlerin verilen azı dişlerine ve protein çözeltilerinin protein konsantrasyonlarına bağlı olarak reaksiyon başına gereken her reaktifin hacmini hesaplayın. Şarj reaksiyoni başına 2 μM E1, 4 μM E2 ve 4 μM lizin içermeyen ubiquitin (Ub K0) kullanın. 1x'te 10x ATP ve 10x her yerde bulunan tampon kullanın. DDH 2 0 ile şarj reaksiyonunun hacmini20μL'ye ayarlayın.
        NOT: Lizin içermeyen Ub K0 mutant, mono-her yerde bulunan E2'nin özel üretimini uygulamak için kullanılır. Vahşi tip Ub de kullanılabilir; ancak, bu, analiz etmesi daha zor olan çeşitli E2 ~ Ub değişikliklerine(örneğin,E2'nin poli-her yerde bulunmasına) yol açabilir. İlk kez kullanım için veya yeni bir E2 enzimi kullanırken, E2'de E1 ile elde edilebilen Ub şarj seviyesini belirleyin. Şarj verimini belirlemek için Coomassie boyama ile şarj edilmemiş ve şarjlı E2'yi görselleştirin. Burada, UBE2D2 ve Ub K0(Ek Şekil S2A)at oranları kullanılırken Ub K0'ın yaklaşık yarısı güvenilir bir şekilde UBE2D2 ~ Ub'a dönüştürüldü.
      2. Şarj reaksiyoni için bir pipetleme şeması hazırlayın. Şarj reaksiyonunun hacmini,örneğin, bireysel deşarj reaksiyonlarında CHIP ve CHIP (H260Q) kullanın. Böylece, bir şarj reaksiyonunun hacmini iki katına hazırlayın.
        NOT: İlk kullanım için, en uygun deşarj koşullarını izlemek için tercih edilen E3 ligasesinin farklı konsantrasyonlarını test edin ve bunları batı şişkinliği ile analiz edin. İdeal bir durumda, Ub'nin E2'den deşarjı, ilgili E2 ~ Ub protein bandı kaybolana kadar zamanla artacaktır.
      3. Şarj reaksiyonlarını 37 °C'de 15 dakika kuluçkaya yaslanın.
    2. Şarj reaksiyonunun sona erdirilmesi
      1. 1,8 U/mL'lik son konsantrasyonda apyrase ilave larak şarj reaksiyonu durdurulur. Rt'de 5 dakika boyunca apyrase ile inkübasyonu gerçekleştirin, ardından 30 mM'lik son konsantrasyonda EDTA'nın eklenmesi. DDH2O ile şarj reaksiyonunun hacmini 30 μL'ye ayarlayın.
        NOT: Apyrase, ATP moleküllerini ADP (adenozin difosfat) moleküllerine dönüştürmek için kullanılır. E1 enziminin aktivitesi ATP'ye bağlı olduğundan, E1 artık E2'yi şarj edebilir. EDTA ayrıca E1 için gerekli ortak faktörler olan Mg2+ iyonlarını söndürerek E1'in inhibe olmasını sağlamak için kullanılır. Reaksiyonu durdurmak için gereken apyrase hacmi tahlil koşulları arasında değişebilir. Sadece apyrase mevcut ATP moleküllerini zaten sorgulasa da, apyrase ve EDTA kombinasyonu E1-UBE2D2 çifti için şarj reaksiyonunun durdurulmasında daha etkili oldu. Reaksiyonun durdurulması tekrarlanabilirliği test için kritik bir faktör olduğundan, yeni E1-E2 çiftleri için verimli durdurma test edilmelidir. Bu amaçla, bir şarj reaksiyoni ayarlayın, durdurun ve örnekleri 2,5, 10 ve 15 dakika sonra belirli zaman noktalarında toplayın. Değişmeyen E2 ~ Ub seviyeleri reaksiyonun durduğunu ve tiyoesterin bu süre zarfında stabil olduğunu gösterir(Ek Şekil S2B).
    3. E2 ~ Ub'nin E3 tarafından boşaltı
      1. Farklı zaman noktalarına karşılık gelen dört tüp hazırlayın (t0, t1, t2, t3); her tüpe azaltıcı olmayan numune tamponu (6,7 μL 4x lityum dodecyl sülfat (LDS) tamponu) ekleyin.
        NOT: Örnek arabellekte azaltıcı madde kullanmayın.
      2. T0için durdurulan şarj reaksiyonundan 6 μL çıkarın ve sesi ddH 2 O ile20μL'ye ayarlayın.
      3. T 0 örneğini70 °C'de 10 dakika kuluçkaya yatırın.
        NOT: Tiyoesterler daha yüksek sıcaklıklarda labile olduğu için kuluçka süresini uzatarak numuneyi kaynatmayın.
      4. Deşarj reaksiyoni başına gereken her reaktifin hacmini hesaplayın. Şarjlı E2'nin kalan 24 μL'sini kullanın ve E3 ligase'in 10 mM L-lizin, 1 mg/ml BSA ve 500 nM'lik kısmını ekleyin. Her yerde bulunan tamponu 1x'te kullanın ve sesi ddH2O ile 80 μL'ye ayarlayın.
      5. Tüm deşarj reaksiyonları için bir pipetleme şeması hazırlayın ve CHIP(WT) ile birlikte kontrol olarak CHIP(H260Q) kullanın.
      6. Gerekli bileşenleri aşağıdaki sırayla ekleyerek buz üzerinde deşarj reaksiyonları ayarlayın: ddH2O, her yerde bulunan tampon, BSA, lizin, E3 ligaz ve reaksiyonu başlatmak için yüklü E2.
      7. RT'de deşarj reaksiyonlarını kuluçkaya yatırın.
      8. Deşarj reaksiyonunun 20 μL'lik kısmını ilgili numune tüplerine aktararak 5, 30 ve 60 dk'dan sonra numune alın.
        NOT: Deşarjın doğru izlenmesini sağlayan uygun zaman noktaları E2-E3 çiftleri arasında değişebilir.
      9. Örneği hemen vorteks edin ve 70 °C'de 10 dakika kuluçkaya yatırın.
      10. Doğrudan PAGE ile devam edin.
        NOT: E2 ~ Ub thioesters numune tamponunda denatüre olduktan sonra bile labile olabilir. Bu nedenle jel elektroforezi test yapıldıktan sonra doğrudan yapılmalıdır.
  2. Jel elektroforezi ve batı lekesi
    1. Jel elektroforezi ve batı şişkinliğini bölüm 2.2'de açıklandığı gibi gerçekleştirin. Ub'e özgü bir antikor kullanın ve varsa, Ub ve E3 ligase sinyalinin aynı anda algılanmasını sağlayan farklı bir türde yetiştirilen E3'e özgü bir antikor kullanın.
  3. Veri analizi
    1. Bölüm 2.3'te açıklandığı gibi veri analizi yapın (Şekil 3).

Sonuçlar

Ubiquitin ligase CHIP ile işbirliği yapan E2 enzimlerini tanımlamak için, bir dizi E2 adayı bireysel in vitro her yerde ortaya çıkan reaksiyonlarda test edildi. İşbirliği yapan E2-E3 çiftleri, E3 bağımlı her yerde bulunan ürünlerin oluşumu, yaniE3 ligazının otomatik olarak her yerde bulunması ve serbest Ub polimerlerinin oluşumu ile izlendi. Her yerde bulunan ürünler batı şişkinliği ile analiz edildi. Veri yorumlama, elde edilen protein bantlarının moleküler ağırlık beli...

Tartışmalar

Bu makalede E3 ligaz fonksiyonunun analizi için temel in vitro her yerde bulunma yöntemleri açıklanmaktadır. In vitro her yerde tahlili tahlilleri yapılırken, bazı E2 enzimlerinin aktif sitsteinlerinin aktif bölgeye yakın bulunan kendi lizin kalıntılarına saldırması nedeniyle otomatik her yerde bulunma gerçekleştirebileceği düşünülmelidir30. Bu sorunu atlatmak için, ilgili lizin kalıntısının arginin ile değiştirildiği bir E2 mutantının kullanılmas...

Açıklamalar

Yazarların çıkar çatışması yoktur.

Teşekkürler

Laboratuvarımız üyelerine makale hakkında eleştirel tartışmalar ve yararlı tavsiyeler için teşekkür ederiz. Boyut sınırlaması nedeniyle değerli katkıları belirtmediğimiz için özür dileyeceğiz. Bu çalışma Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG, Alman Araştırma Vakfı) - SFB 1218 - Projektnumber 269925409 ve Mükemmellik Kümesi EXC 229/ CECAD to TH tarafından desteklenmektedir. Bu çalışma Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG, Alman Araştırma Vakfı) tarafından Almanya'nın Mükemmellik Stratejisi - EXC 2030 - 390661388 ve - SFB 1218 - Projektnumber 269925409 to T.H. Diese Arbeit wurde von der Deutschen Forschungsgemeinschaft (DFG) im Rahmen der deutschen Exzellenzstrategie - EXC 2030 - 390661388 und - SFB 1218 - Projektnummer: 269925409 bir T.H. gefördert.

Malzemeler

NameCompanyCatalog NumberComments
Amershan Protran 0.1 µm NCGE Healthcare10600000nitrocellulose membrane
Anti-CHIPCell Signaling2080Monoclonal rabbit anti-CHIP antibody, clone C3B6
Anti-MYCRocheOP10Monoclonal mouse anti-MYC antibody, clone 9E10
Anti-ubiquitinUpstate05-944Monoclonal mouse anti-Ub antibody, clone P4D1-A11
ApyraseSigmaA6535-100UN
ATP (10x)Enzo12091903
BSASigmaA6003-10G
EDTARoth8043.2
KClRoth6781.1
K2HPO4RothP749.2
KH2PO4Roth3904.1
LDS sample buffer (4x)novexB0007
L-LysineSigmaL5501-5G
MESRoth4256.4
MeOHVWR Chemicals2,08,47,307100%
MilchpulverRothT145.3
NaClRothP029.3
NuPAGE AntioxidantinvitrogenNP0005
NuPAGE Transfer buffer (20x)novexNP0006-1
Page ruler plusThermo Fisher26619Protein ladder
RotiBlockRothA151.1Blocking reagent
SDS (20%)Roth1057.1
S1000 Thermal CyclerBio Rad1852196
Trans-Blot TurboBio Rad1704150EDUTransfer system
Tris baseRoth4855.3
Tween 20Roth9127.2
UbcH Enzyme SetBostonBiochemK-980BE2 enzymes
UbiquitinBostonBiochemU-100H
Ubiquitin-activating enzyme E1EnzoBML-UW941U-0050
Ubiquitylation buffer (10x)EnzoBML-KW9885-001
Whatman blotting paperBio Rad1703969Extra thick filter paper

Referanslar

  1. Kuhlbrodt, K., Mouysset, J., Hoppe, T. Orchestra for assembly and fate of polyubiquitin chains. Essays in Biochemistry. 41, 1-14 (2005).
  2. Pickart, C. M., Eddins, M. J. Ubiquitin: structures, functions, mechanisms. Biochimica et Biophysica Acta. 1695 (1-3), 55-72 (2004).
  3. Dye, B. T., Schulman, B. A. Structural mechanisms underlying posttranslational modification by ubiquitin-like proteins. Annual Review of Biophysics and Biomolecular Structure. 36, 131-150 (2007).
  4. Koegl, M., et al. A novel ubiquitination factor, E4, is involved in multiubiquitin chain assembly. Cell. 96 (5), 635-644 (1999).
  5. Hoppe, T. Multiubiquitylation by E4 enzymes: 'one size' doesn't fit all. Trends in Biochemical Sciences. 30 (4), 183-187 (2005).
  6. Stewart, M. D., Ritterhoff, T., Klevit, R. E., Brzovic, P. S. E2 enzymes: more than just the middle men. Cell Research. 26 (4), 423-440 (2016).
  7. Clague, M. J., Heride, C., Urbé, S. The demographics of the ubiquitin system. Trends in Cell Biology. 25 (7), 417-426 (2015).
  8. Buetow, L., Huang, D. T. Structural insights into the catalysis and regulation of E3 ubiquitin ligases. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 17 (10), 626-642 (2016).
  9. French, M. E., Koehler, C. F., Hunter, T. Emerging functions of branched ubiquitin chains. Cell Discovery. 7, 6 (2021).
  10. Hatakeyama, S., Yada, M., Matsumoto, M., Ishida, N., Nakayama, K. I. U box proteins as a new family of ubiquitin-protein ligases. Journal of Biological Chemistry. 276 (35), 33111-33120 (2001).
  11. Herhaus, L., Dikic, I. Expanding the ubiquitin code through post-translational modification. EMBO Reports. 16 (9), 1071-1083 (2015).
  12. Deshaies, R. J., Joazeiro, C. A. RING domain E3 ubiquitin ligases. Annual Review of Biochemistry. 78, 399-434 (2009).
  13. Hochstrasser, M. Lingering mysteries of ubiquitin-chain assembly. Cell. 124 (1), 27-34 (2006).
  14. Hoppe, T., Cohen, E. Organismal protein homeostasis mechanisms. Genetics. 215 (4), 889-901 (2020).
  15. Okiyoneda, T., et al. Peripheral protein quality control removes unfolded CFTR from the plasma membrane. Science. 329 (5993), 805-810 (1997).
  16. Tawo, R., et al. The Ubiquitin ligase CHIP integrates proteostasis and aging by regulation of insulin receptor turnover. Cell. 169 (3), 470-482 (2017).
  17. Albert, M. C., et al. CHIP ubiquitylates NOXA and induces its lysosomal degradation in response to DNA damage. Cell Death and Disease. 11 (9), 740 (2020).
  18. Hoppe, T., et al. Regulation of the myosin-directed chaperone UNC-45 by a novel E3/E4-multiubiquitylation complex in C. elegans. Cell. 118 (3), 337-349 (2004).
  19. Kim, J., Löwe, T., Hoppe, T. Protein quality control gets muscle into shape. Trends in Cell Biology. 18 (6), 264-272 (2008).
  20. Janiesch, P. C., et al. The ubiquitin-selective chaperone CDC-48/p97 links myosin assembly to human myopathy. Nature Cell Biology. 9 (4), 379-390 (2007).
  21. Donkervoort, S., et al. Pathogenic variants in the myosin chaperone UNC-45B cause progressive myopathy with eccentric cores. The American Journal of Human Genetics. 107 (6), 1078-1095 (2020).
  22. Murata, S., Minami, Y., Minami, M., Chiba, T., Tanaka, K. CHIP is a chaperone-dependent E3 ligase that ubiquitylates unfolded protein. EMBO Reports. 2 (12), 1133-1138 (2001).
  23. Jiang, J., et al. CHIP is a U-box-dependent E3 ubiquitin ligase: identification of Hsc70 as a target for ubiquitylation. Journal of Biological Chemistry. 276 (64), 42938-42944 (2001).
  24. Yang, Y., Yu, X. Regulation of apoptosis: the ubiquitous way. The FASEB Journal. 17 (8), 790-799 (2003).
  25. Lamothe, B., et al. TRAF6 ubiquitin ligase is essential for RANKL signaling and osteoclast differentiation. Biochemical and Biophysical Research Communication. 359 (4), 1044-1049 (2007).
  26. Amemiya, Y., Azmi, P., Seth, A. Autoubiquitination of BCA2 RING E3 ligase regulates its own stability and affects cell migration. Molecular Cancer Research. 6 (9), 1385 (2008).
  27. Brzovic, P. S., Lissounov, A., Christensen, D. E., Hoyt, D. W., Klevit, R. E. A UbcH5/ubiquitin noncovalent complex is required for processive BRCA1-directed ubiquitination. Molecular Cell. 21 (6), 873-880 (2006).
  28. Sakata, E., et al. Crystal structure of UbcH5b~ubiquitin intermediate: Insight into the formation of the self-assembled E2~Ub conjugates. Structure. 18 (1), 138-147 (2010).
  29. Eddins, M. J., Carlile, C. M., Gomez, K. M., Pickart, C. M., Wolberger, C. Mms2-Ubc13 covalently bound to ubiquitin reveals the structural basis of linkage-specific polyubiquitin chain formation. Nature Structural and Molecular Biology. 13 (10), 915-920 (2006).
  30. Buetow, L., et al. Activation of a primed RING E3-E2 ubiquitin complex by non-covalent ubiquitin. Molecular Cell. 58 (2), 297-310 (2015).
  31. Dou, H., Buetow, L., Sibbet, G. J., Cameron, K., Huang, D. T. BIRC7-E2 ubiquitin conjugate structure reveals the mechanism of ubiquitin transfer by a RING dimer. Nature Structural and Molecular Biology. 19 (9), 876-883 (2012).
  32. McKenna, S., et al. Noncovalent interaction between ubiquitin and the human DNA repair protein Mms2 is required for Ubc13-mediated polyubiquitination. Journal of Biological Chemistry. 276 (43), 40120-40125 (2001).
  33. Plechanovová, A., et al. Mechanism of ubiquitylation by dimeric RING ligase RNF4. Nature Structural Biology. 18 (9), 1052-1059 (2011).
  34. Pierce, N. W., Kleiger, G., Shan, S. O., Deshaies, R. J. Detection of sequential polyubiquitylation on a millisecond timescale. Nature. 462 (7273), 615-619 (2009).
  35. Jain, A. K., Barton, M. C. Regulation of p53: TRIM24 enters the RING. Cell Cycle. 8 (22), 3668-3674 (2009).
  36. Swatek, K. N., Komander, D. Ubiquitin modifications. Cell Research. 26, 399-422 (2016).
  37. Yan, K., et al. The role of K63-linked polyubiquitination in cardiac hypertrophy. Journal of Cellular and Molecular Medicine. 22 (10), 4558-4567 (2018).
  38. Dammer, E. B., et al. Polyubiquitin linkage profiles in three models of proteolytic stress suggest the etiology of Alzheimer disease. Journal of Biological Chemistry. 286 (12), 10457-10465 (2011).

Yeniden Basımlar ve İzinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya resimlerini yeniden kullanma izni talebi

Izin talebi

Daha Fazla Makale Keşfet

BiyolojiSay 171

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Gizlilik

Kullanım Şartları

İlkeler

Bize Ulaşın

KÜTÜPHANEYE TAVSİYE ET

JoVE HABER BÜLTENLERİ

Araştırma

Eğitim

Yazarlar

Kütüphaneciler

JoVE Hakkında

Telif Hakkı © 2020 MyJove Corporation. Tüm hakları saklıdır