JoVE Logo
Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • النتائج
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

نصف البروتوكولات التفصيلية لاستخدام العضيات المشتقة من المريض لفحوصات حساسية العلاج متوسطة الإنتاجية. تشمل العلاجات التي تم اختبارها العلاج الكيميائي والعلاج الإشعاعي والعلاج الكيميائي الإشعاعي. تستخدم مستويات أدينوسين ثلاثي الفوسفات كقراءة وظيفية.

Abstract

تسمح النماذج العضوية المشتقة من المريض (PDO) بالتوسع على المدى الطويل والحفاظ على الخلايا الظهارية الأولية المزروعة في ثلاثة أبعاد وحالة شبه أصلية. عندما تكون مشتقة من أنسجة الورم المقطوعة أو المأخوذة من خزعة ، تلخص العضيات عن كثب مورفولوجيا الورم في الجسم الحي ويمكن استخدامها لدراسة استجابة العلاج في المختبر. تعكس البنوك الحيوية للعضيات السرطانية مجموعة متنوعة من الأورام السريرية والمرضى ، وبالتالي فهي تبشر بنتائج كبيرة للتطبيقات قبل السريرية والسريرية. تقدم هذه الورقة طريقة لفحص الأدوية متوسطة الإنتاجية باستخدام سرطان الخلايا الحرشفية في الرأس والرقبة وسرطان القولون والمستقيم الغدي. يمكن اعتماد هذا النهج بسهولة للاستخدام مع أي نموذج عضوي مشتق من الأنسجة ، سواء كان طبيعيا أو مريضا. يتم وصف طرق التعرض في المختبر للعضيات للعلاج الكيميائي والإشعاعي (إما كطريقة علاج أحادية أو مجتمعة). يتم تقييم بقاء الخلية بعد 5 أيام من التعرض للدواء عن طريق قياس مستويات الأدينوسين ثلاثي الفوسفات (ATP). تقاس حساسية الدواء بمقاييس التركيز المثبط نصف الحد الأقصى (IC50) ، والمساحة تحت المنحنى (AUC) ، ومقاييس معدل النمو (GR). يمكن أن توفر هذه المعلمات نظرة ثاقبة حول ما إذا كانت الثقافة العضوية تعتبر حساسة أو مقاومة لعلاج معين.

Introduction

تكتسب النماذج العضوية التي تم إنشاؤها من الخلايا الجذعية البالغة ونمت في مصفوفة ثلاثية الأبعاد (3D) خارج الخلية (ECM) ومزيج عامل نمو محدد (المعروف أيضا باسم HUB Organoids) زخما كمنصات فحص الأورام قبل السريرية. يمكن إنشاء الثقافات العضوية المشتقة من المريض (PDO) من خزعات الأنسجة الطبيعية والمريضة في غضون 1-2 أسابيع ويمكن توسيعها لمدة لا تقل عن 1-2 أشهر حتى فترات زمنية غير محدودة. يسمح الحفظ بالتبريد بالاستخدام طويل الأمد للثقافات ذات الخصائص الجيدة. على عكس نماذج خط الخلايا التقليدية ثنائية الأبعاد المشتقة من نسيل ، تلخص نماذج PDO عن كثب أنسجة الورم الأصلية ، سواء ظاهريا أو وراثيا ، وتحافظ على عدم تجانس الورم. توفر شاشات الأدوية متوسطة الإنتاجية على PDOs ، والتي تختبر مجموعة واسعة من العلاجات ، منصة فريدة للطب الشخصي.

وصفت الدراسات السابقة استخدام النماذج العضوية لفحص العلاج ، وتحديدا الأدوية والعلاج الإشعاعي ، في النماذج التي تم إنشاؤها من أنواع مختلفة من الأورام وتظهر الإمكانات التنبؤية للعضيات لتوجيه عملية صنع القرار السريري1،2،3،4،5،6،7،8،9،10،11. تصف هذه الورقة طرق فحص علاج الأورام باستخدام PDOs بسعة متوسطة الإنتاجية (الشكل 1 أ). تم إعداد هذا البروتوكول في شكل لوحة 384 بئرا مع شبه أتمتة ، مما يسمح باختبار العلاج لما يصل إلى ثمانية نماذج عضية و 16 مركبا وما يصل إلى ثماني ألواح 384 بئرا. إلى جانب شاشات الأدوية المركبة ، تصف هذه الورقة أيضا طرق فحص حساسية العلاج الإشعاعي والتحسيس. علاوة على ذلك ، تتم مناقشة استخدام الروبوتات عالية الإنتاجية لترقية شاشة الدواء إلى الأتمتة الكاملة. الأهم من ذلك ، قد تتطلب العضيات من الأنسجة المختلفة وسائط مختلفة ومعالجة مختلفة.

هنا ، يتم وصف بروتوكول فحص فحص الأدوية العام ، والذي قد يحتاج إلى تكييف اعتمادا على العضوية ذات الاهتمام. يتم تضمين نقاط البداية والاقتراحات للتحسين في المناقشة ، بالإضافة إلى توصيات عامة بشأن الإعداد التجريبي والممارسة العضوية. يتم إعطاء أمثلة باستخدام عضيات سرطان الخلايا الحرشفية في الرأس والرقبة (HNSCC) ، والتي عادة ما يكون لها مورفولوجيا كثيفة ، وعضويات سرطان القولون والمستقيم (CRC) التي يمكن أن يكون لها مورفولوجيا كيسية أو كثيفة. يرجى ملاحظة أن طرق إنشاء وتوسيع العضوية الأولية غير مشمولة في هذا البروتوكول. بالنسبة للتقنيات العضوية الأساسية ، يجب على القارئ الرجوع إلى بروتوكولات أخرى (على سبيل المثال ، 12). سيوفر هذا البروتوكول المرئي نظرة ثاقبة لعملية فحص الأدوية متوسطة الإنتاجية باستخدام النماذج العضوية.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

ملاحظة: قبل استخدام هذا البروتوكول ، يرجى التأكد من اتباع إرشادات لجنة أخلاقيات البحث البشري في المؤسسة. تم جمع أنسجة المريض والبيانات الموضحة في هذا البروتوكول وفقا لإرشادات EUREC ووفقا للقانون الأوروبي والوطني والمحلي. تم اشتقاق جميع العضيات من المرضى الموافقين ، ويمكن سحب الموافقة في أي وقت.

1. قبل الفحص

  1. تأكيد هوية النماذج التي تم إنشاؤها حديثا (على سبيل المثال ، عن طريق الأنسجة و / أو تسلسل الحمض النووي1،2،3،4،5،6،7،8،9،10،11) لاستبعاد إمكانية فرط نمو الخلايا الطبيعي ، والتأكد من إجراء فحص الدواء على المزارع العضوية للورم (انظر المثال في الشكل 2 د).
  2. صمم إعداد اللوحة التجريبية ، مع الاستفادة من التوصيات العامة الواردة في قسم المناقشة (انظر المثال في الشكل التكميلي S1).
  3. احسب العدد المطلوب من العضيات ، وقم بإعداد ما يكفي من العضيات الجاهزة للتقسيم في اليوم 0 (استخدم الجدول 1 كمرجع).
    ملاحظة: اعتمادا على GR من النوع العضوي وطرازه ، يلزم وجود ما يقرب من 1-2 ألواح كاملة من 6 آبار لكل لوحة غربلة كاملة 384 بئرا. كمبدأ توجيهي ، تحتوي بئر واحدة كاملة من صفيحة مكونة من 6 آبار على ±20,000 من العضيات الكيسية أو ما يصل إلى 50,000 من العضيات الكثيفة / الشبيهة بالعنب.
  4. تحقق مما إذا كان موزع الخلايا قد تمت معايرته باستخدام صبغة مراسل ، وقم بالمعايرة وفقا لبروتوكول الشركة المصنعة إذا لزم الأمر.

2. إعداد الكاشف

  1. تحضير الوسيط الأساسي: DMEM / F12 +++ المتقدم (aDF +++). أضف 5 مل لكل من 1x بديل L-glutamine (v/v) ، و 1 M 4- (2-hydroxyethyl) -1-piperazine ethanesulfonic acid (HEPES) ، و 100 U / مل بنسلين / ستربتومايسين إلى زجاجة 500 مل من DMEM / F12 المتقدم. احتفظ ب aDF +++ عند 4 درجات مئوية لمدة تصل إلى شهر واحد.
  2. قم بإعداد وسط التمدد العضوي المناسب (أي النمو) لنوع العضوية المستخدمة9،10.
  3. قم بإعداد وسيط الغربلة ، والذي يمكن أن يكون مختلفا عن وسيط التمدد اعتمادا على الإعداد التجريبي. للمساعدة في التعافي بعد توزيع العضيات ، أضف 5 ميكرومتر من مثبط Rho kinase (ROCK) (Y-27632) إلى وسط الفحص.
  4. قم بإعداد محلول 100 مجم / مل من Dispase II في aDF +++.
    ملاحظة: محلول 100x من التباين مستقر عند -20 درجة مئوية لمدة شهرين.

3. اليوم 0: تحضير العضيات

ملاحظة: تبدأ الأحجام الموضحة أدناه من صفيحة كاملة مكونة من 6 آبار من العضيات ، أي ما يعادل 1200 ميكرولتر من العضيات / ECM (200 ميكرولتر من العضيات / ECM لكل بئر).

  1. فحص العضيات باستخدام مجهر المجال الساطع بحثا عن العدوى المحتملة والكثافة والمظهر العام ؛ التقط صورا لجميع النماذج للرجوع إليها قبل المرور.
  2. تمرير العضيات والبذور وفقا للخطوات التالية. قم بتنفيذ هذه الخطوات في درجة حرارة الغرفة لتقليل تقلبات درجات الحرارة العضوية. عند التعامل مع المعلقات العضوية ، استخدم أطراف منخفضة الاحتفاظ أو ماصات وبلاستيك مبللة مسبقا لمنع فقدان العضيات.
    1. عند استخدام كميات أكبر من ECM / العضيات (>1200 ميكرولتر من ECM) ، ضع في اعتبارك هضم ECM مع التباين على النحو التالي للمساعدة في إزالة العضوية من ECM.
      ملاحظة: يؤدي Dispase إلى تفكيك ECM ، ولكنه لا يؤثر على العضيات.
      1. اختياري: أضف 1 مجم / مل إلى كل بئر ، واحتضن العضيات في حاضنة 37 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة قبل المرور كالمعتاد.
        ملاحظة: نظرا لأن التباعد لا يتم تعطيله بواسطة المكونات الوسيطة ، فقم بغسله بعيدا (باستخدام aDF +++) مع إضافة 20 ضعف حجم التباعد على الأقل.
    2. اجمع العضيات في ثلاثة أنابيب سعة 15 مل (حتى 400 ميكرولتر من ECM لكل أنبوب). قم بتعبئة ما يصل إلى 12 مل باستخدام aDF +++ ، وجهاز طرد مركزي لمدة 5 دقائق عند RT عند 85 × جم. إذا تم تكويرها بشكل صحيح ، فقم بشفط المادة الطافية. إذا لم تكن العضيات قد تم تكويرها بشكل واضح ، فقم بجهاز الطرد المركزي بسرعة أعلى (تصل إلى 450 × جم ؛ اعتمادا على نوع العضوية وحجمها) لمدة 5 دقائق إضافية. أعد تعليق الحبيبات وكرر الغسيل.
      ملاحظة: تشير الطبقة الشبيهة بالزجاج فوق الحبيبات إلى وجود ECM. تأكد من عدم وجود عضيات محاصرة في ECM باستخدام مجهر المجال الساطع (قد يكون العدد المنخفض من العضيات المحاصرة مقبولا) ، وقم بإزالة ECM المتبقية بعناية باستخدام ماصة p1000. إذا كان هناك (أيضا) العديد من العضيات في ECM ، كرر خطوة التفكك المتباين ، أو اغسل الحبيبات وتدور بسرعة أعلى (بحد أقصى 450 × جم).
    3. لكل أنبوب سعة 15 مل ، أعد تعليق الحبيبات العضوية في 1 مل من aDF +++ ، وقم بفصل العضيات بعناية حتى تصل إلى الحجم الصحيح. استخدم طريقة التفكك المستخدمة للتقسيم المنتظم ، اعتمادا على النوع / التشكل (الجدول 1).
      1. في حالة العضيات الكيسية والعنب ، قم بتعطيلها ميكانيكيا ، وقصها إلى أجزاء صغيرة (<100 ميكرومتر) عن طريق سحب العينة لأعلى ولأسفل باستخدام p1000 مع طرف p2 في الأعلى ، أو باستخدام ماصة باستور مبللة مسبقا تم تضييق طرفها في اللهب.
        ملاحظة: تأكد من حدوث اضطراب عضوي باستخدام مجهر المجال الساطع بعد سحب العينات لأعلى ولأسفل كل 5 مرات، بهدف جعل العضيات أقل من أو ضمن نطاق حجم الشاشة (الجدول 1).
      2. بالنسبة للعضيات الكثيفة ، أضف 1 مل من محلول 50٪ v / v من TrypLE في aDF +++ لإعادة تعليق حبيبات الخلية ، واحتضانها لمدة لا تقل عن 2 دقيقة عند 37 درجة مئوية. بعد ذلك ، قم بهز الأنبوب بقوة لأعلى ولأسفل وتحقق من مجهر المجال الساطع. باستخدام نفس النهج المذكور أعلاه ، قم بتعطيل العضيات ميكانيكيا باستخدام ماصة ، والتحقق من المجهر باستمرار طوال العملية. بالنسبة للعضيات HNSCC ، احتضن في محلول 100٪ من TrypLE لمدة 5 دقائق.
        ملاحظة: اعتمادا على نوع الثقافة ، تهدف إلى أن ينتهي بك الأمر بمجموعات صغيرة من الخلايا (على سبيل المثال ، عضيات CRC ، >20 ميكرومتر) أو خلايا مفردة (على سبيل المثال ، عضيات HNSCC). تأكد من أن حضانة المحلل للبروتين لا تتجاوز 15 دقيقة لأن ذلك قد يؤثر على بقاء العضوية.
    4. اغسل العضيات ب 10 مل من aDF +++. قم بتدوير العضيات في 85 × جم لمدة 5 دقائق ؛ شفط المادة الطافية إذا تم تكويبها بشكل صحيح. بدلا من ذلك ، إذا كان من الصعب حبيبات العضيات ، فقم بالطرد المركزي حتى 450 × جم لمدة 5 دقائق.
    5. عضيات البذور بكثافة عالية في وسط تمدد بنسبة 50٪ / 50٪ ECM (مما يسمح بإزالتها بسهولة من ECM في القسم 4). استهدف كثافة مضاعفة تقريبا مقارنة بالانقسام العادي ، مما يؤدي غالبا إلى انقسام 1: 1 (انظر الأمثلة في الشكل 1). عضيات البذور في قطرات 10 ميكرولتر (إجمالي 200 ميكرولتر لكل بئر) من صفيحة مكونة من 6 آبار مسخنة مسبقا.
      ملاحظة: احتفظ بالأطباق المسخنة مسبقا في حاضنة عند 37 درجة مئوية طوال الليل أو في فرن 60 درجة مئوية لمدة ساعة واحدة على الأقل لضمان التصلب السريع ل ECM ، ومنع انتشار ECM وبالتالي ضمان تكوين قبة نصف الكرة الأرضية بشكل صحيح.
    6. اقلب اللوحة وأعدها إلى حاضنة 37 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة للسماح بها
      7. ECM المراد تعيينه. بعد 30-60 دقيقة ، أضف وسط التمدد برفق (درجة حرارة الغرفة) إلى الآبار.

4. اليوم 2 (النطاق: الأيام 1 - 3): الاستغناء عن العضويات

ملاحظة: اعتمادا على الموارد الطبيعية العضوية، يمكن أن يحدث هذا أيضا في اليوم 1 أو 3. في جميع أنحاء فحص المخدرات ، يتم الاحتفاظ بالعضيات في حالة تعليق. لهذا الغرض ، يتم الاستغناء عنها بتركيز منخفض من ECM (5-10٪) حيث يتم الحفاظ على نمو العضوية ، ولكن في حالة عدم حدوث تصلب في ECM. يسمح هذا بالتوزيع الآلي ، والتفاعل الأمثل بين المركبات العضوية ، وتحلل الخلايا القابل للتكرار ، ولكنه يحد أيضا من فرصة تغيير الوسيط.

  1. احسب تركيز وكمية التعليق العضوي المطلوب لفحص الدواء.
    1. اعتمادا على موزع الخلية المستخدم ، ضع في اعتبارك الحجم الميت أثناء الحساب.
      ملاحظة: عند الاستغناء عن 40 ميكرولتر من التعليق العضوي لكل بئر ، تتطلب لوحة واحدة مكونة من 384 حجما إجماليا قدره 15.4 مل. في المتوسط ، يحتوي كل أنبوب توزيع خلية Multidrop على حجم ميت يبلغ ~ 1 مل ، مما ينتج عنه 8 مل من الحجم الميت عند استخدام جميع الفوهات. ينتج عن هذا إجمالي 23.4 مل لكل نموذج عضوي للوحة كاملة مكونة من 384 بئرا. وبالتالي ، فإن تحضير 25 مل من المعلق العضوي يضمن عضيات كافية للاستغناء عنها بالإضافة إلى المتابعة الاختيارية (تعدد أشكال النوكليوتيدات المفردة ، SNP) (انظر 4.4.7).
  2. التحضير لجمع العضوية
    1. لتحضير مخزن الغسيل ، أضف مثبط ROCK (Y-27632) إلى aDF +++ إلى تركيز نهائي يبلغ 10 ميكرومتر. (مطلوب ±100 مل لكل مزرعة عضوية سيتم فحصها).
    2. افحص العضيات في جميع الآبار باستخدام مجهر ساطع لتقييم التعافي العضوي بعد المرور واستبعاد الالتهابات المحتملة. تحقق مما إذا كانت العضيات بالحجم الصحيح عن طريق التقاط صورة مجهرية وقياس العضيات باستخدام شريط مقياس رقمي (الجدول 1).
      ملاحظة: إذا لم تكن العضيات بالحجم الصحيح (كبيرة جدا أو صغيرة جدا) ، فسوف تضيع في عملية الترشيح ، وقد لا تكون هناك مواد كافية لإجراء فحص الدواء. إذا كان هذا هو الحال ، ينصح بتأجيل فحص الدواء.
    3. أضف 1 مجم / مل إلى كل بئر ، واحتضن في 37 درجة مئوية في الحاضنة لمدة 30-60 دقيقة (حتى 120 دقيقة كحد أقصى) لهضم ECM. تحقق من تقدم تفكك ECM تحت المجهر لمعرفة ما إذا كانت قطرات ECM تطفو. إذا لم يكن الأمر كذلك ، فقم بسحب محتويات البئر فوق قطرات ECM ، والتي يجب أن تؤتي ثمارها بسهولة عند اكتمال عملية الهضم.
  3. جهز العضيات للتوزيع في طبق 384 بئرا وفقا للخطوات التالية. قم بتنفيذ هذه الخطوات في درجة حرارة الغرفة (بما في ذلك الطرد المركزي) لتقليل تقلبات درجات الحرارة العضوية.
    1. اجمع المعلق العضوي من لوحة الثقافة باستخدام ماصة p1000.
    2. اعتمادا على خطوات التصفية المطلوبة (اعتمادا على النوع العضوي ، انظر الجدول 1) ، اتبع الخطوة المقابلة.
      ملاحظة: يعد الترطيب المسبق للمرشحات مع عازلة الغسيل أمرا ضروريا لمنع العضيات من الالتصاق بالفلتر.
      1. قم بإجراء تصفية واحدة عند تضمين جميع الأجزاء الصغيرة والخلايا المفردة ، على سبيل المثال ، بالنسبة للعضيات الورمية HNSCC ، وتصفية العضيات < 70 ميكرومتر. اجمع العضيات المحصودة في أنبوب سعة 15 مل واغسلها مرتين باستخدام 12 مل من محلول الغسيل. قم بتصفية العضيات فوق مرشح مبلل مسبقا 70 ميكرومتر في أنبوب سعة 50 مل ، واغسل الفلتر ب 3 × 4 مل من aDF +++ ، وانقلها إلى أنبوب سعة 15 مل. إذا كان الحجم مرتفعا جدا ، فقم بالدوران عند 85 × جم لمدة 5 دقائق ، وانقل الحبيبات في 12 مل من aDF +++ إلى أنبوب 15 مل ؛ انتقل إلى 4.3.3.
      2. قم بإجراء ترشيح مزدوج لإزالة الحطام والعضيات الكبيرة ، على سبيل المثال ، بالنسبة للعضيات الورمية CRC ، وتصفية العضيات >100 ميكرومتر و <20 ميكرومتر. قم بتصفية العضيات المحصودة على الفور فوق مرشح 100/70/40 ميكرومتر مبلل مسبقا (الجدول 1) في أنبوب سعة 50 مل ، واغسل الفلتر ب 2 × 10 مل من محلول الغسيل. استخدم مرشحا واحدا مبلل مسبقا 20 ميكرومتر لكل ثلاثة آبار من صفيحة 6 آبار من العضيات. قم بتصفية العضيات <100 ميكرومتر فوق المرشحات 20 ميكرومتر ، واغسل الفلتر ب 2 × 10 مل من محلول الغسيل. استرجع العضيات من الفلتر عن طريق قلبها فوق أنبوب نظيف سعة 50 مل وغسلها ب 3 × 4 مل من aDF +++. نقل التعليق العضوي إلى أنبوب 15 مل ؛ إذا كان الحجم >15 مل (حيث قد تكون هناك حاجة إلى مزيد من غسل الفلتر) ، فقم بالدوران عند 85 × جم لمدة 5 دقائق ، وانقل الحبيبات في 12 مل aDF +++ إلى أنبوب 15 مل.
        ملاحظة: يمكن استعادة العضيات التي يتم احتجازها في المرشح لاستخدامها لاحقا (المرور) ؛ يتم استخدام العضيات < 100 ميكرومتر في الخطوة التالية. سيتم التخلص من الخلايا والحطام الذي مر عبر المرشح ، وتستخدم العضيات التي تم التقاطها في المرشح (>20 ميكرومتر ، <100 ميكرومتر) للفحص.
    3. جهاز طرد مركزي عند 450 × جم لمدة 3 دقائق ، وشفط المادة الطافية بعناية. أعد تعليق الحبيبات بعناية في 1 مل من وسط الغربلة ، وقم بتعبئة 1-9 مل أخرى بوسط (اعتمادا على حجم الحبيبات ؛ تهدف إلى الحصول على ~ 75-150 عضوية / 10 ميكرولتر) ، وأعد تعليقها عن طريق سحب العينات لأعلى ولأسفل باستخدام ماصة مصلية مبللة مسبقا.
      ملاحظة: يوصى بإضافة 5 ميكرومتر من مثبطات ROCK إلى وسط الفحص.
    4. قم بخلط المعلق العضوي جيدا عن طريق سحب العينات لأعلى ولأسفل باستخدام ماصة مصلية مبللة مسبقا 5 أضعاف، واحسب عدد العضيات في 10 ميكرولتر من التعليق عن طريق سحب خط في طبق بتري وعدها تحت المجهر. بالنسبة للعضيات الأصغر (<70 ميكرومتر) ، أضف 10 ميكرولتر من التعليق العضوي إلى شريحة مكونة من 10 غرف مع شبكة مقياس الدم ، واحسب عدد العضيات. احسب عدد العضيات / مل باتباع تعليمات الشركة المصنعة.
    5. قم بإعداد الكمية المطلوبة من وسيط الاستغناء عن طريق إضافة 5٪ (حجم / حجم) ECM إلى وسط الغربلة المثلجة (على سبيل المثال ، بالنسبة ل 25 مل من وسط الاستغناء ، أضف 1.25 مل من ECM إلى 23.75 مل من وسط الغربلة المثلجة). أضف ECM فقط إلى الوسط المثلج لمنع ECM من التصلب. عند فحص نماذج عضوية متعددة ، قم بإعداد وسيط الاستغناء بكميات كبيرة لضمان اتساق النسبة المئوية ل ECM عبر جميع الطرازات.
    6. أضف العدد المطلوب من العضيات (انظر الجدول 1 للحصول على إرشادات ومناقشة للملاحظات) إلى أنبوب جديد سعة 15 مل ، وجهاز طرد مركزي عند 450 × جم لمدة 3 دقائق. قم بالشفيق بعناية دون إزعاج الحبيبات ، وأعد تعليق الحبيبات تماما في 100 ميكرولتر من وسط الغربلة باستخدام ماصة p200. تأكد من أن الحبيبات متجانسة ومعاد تعليقها تماما دون أي كتل عضوية. بعد ذلك ، قم بتعبئة التعليق بالكمية المطلوبة من وسيط الاستغناء عن الجليد ، واحتفظ بالتعليق العضوي على الجليد من الآن فصاعدا.
  4. قم بتوزيع العضيات في 384 لوحا بئرا باستخدام موزع الخلايا (على سبيل المثال ، Multidrop).
    1. قم بإعداد موزع الخلية لتوزيع 40 ميكرولتر من تعليق الخلية لكل بئر.
      1. القائمة الرئيسية | حدد نوع اللوحة | حسنا | 384 قياسي | موافق
      2. كاسيت أنبوبي قياسي من نوع العلبة (الجانب الأيمن) | حدد مستوى الصوت باستخدام السهمين لأعلى ولأسفل (40 ميكرولتر).
      3. حدد لوحة كاملة أو أعمدة، بناء على تخطيط اللوحة.
    2. اغسل الأنبوب بنسبة 70٪ من الإيثانول (EtOH) ، متبوعا بمحلول ملحي معقم مخزن بالفوسفات (PBS) ؛ استخدم >15 مل لكل غسلة. اسمح ببعض الهواء بين كل سائل لتصور بداية ونهاية كل غسلة. تحقق مما إذا كانت جميع رؤوس التوزيع يتم توزيعها "بشكل مستقيم" ، واغسلها مرة أخرى عندما لا يكون الأمر كذلك.
    3. في قائمة الإعدادات ، حدد التوزيع المسبق ، واضبطه على 60 ميكرولتر للتوزيع المسبق للتعليق العضوي بعد الإعداد الأولي وقبل الاستغناء عنه.
    4. قم بتجهيز الموزع بنظام التعليق العضوي مع الحفاظ على التعليق على الجليد. قم بالتعليق عن طريق سحب العينة باستمرار باستخدام ماصة p1000. احرص على تجنب توليد فقاعات الهواء في المحلول. بمجرد تحضيرها وتكون اللوحة في موضعها ، قم بتوزيع العضيات بالضغط على ابدأ.
      ملاحظة: هذه الخطوة أسهل مع شخصين: أحدهما يقوم بالتعليق والآخر يقوم بتشغيل الموزع.
    5. إذا لزم الأمر ، لكل نموذج عضوي مدرج في الشاشة ، قم بتوزيع ما لا يقل عن 5 آبار أخرى في لوحة غربلة إضافية.
      ملاحظة: سيسمح هذا بقراءة T = 0 في وقت لاحق من هذا اليوم (انظر القسم 7 والمناقشة). يمكن أيضا إجراء هذا الاستغناء يدويا إذا كنت تفضل ذلك.
    6. استبدل الغطاء الموجود على اللوحة على الفور لتجنب تلوث الآبار. تأكد تحت المجهر من أن جميع الآبار ممتلئة بشكل صحيح ، وما إذا كانت العضيات موزعة بالتساوي في جميع أنحاء اللوحة.
    7. إذا لزم الأمر ، بمجرد الانتهاء من الطلاء ، استرجع التعليق العضوي من الأنبوب (انقر فوق فارغ) ، وقم بتدوير العضيات المتبقية لأسفل. انقله إلى أنبوب سعة 1.5 مل ، ثم قم بالتجميد المفاجئ لتحليل SNP لاحقا.
      ملاحظة: إذا دخل الهواء إلى الأنبوب أثناء الاستغناء ، ولم يتم ملء بعض الآبار بشكل صحيح ، فاملأ الآبار يدويا بإضافة 40 ميكرولتر لكل بئر.
    8. إذا تم الاستغناء عن نماذج عضوية متعددة ، اشطف الأنبوب باستخدام PBS و EtOH و PBS ، وكرر الخطوات 4.4.4-4.4.8 لكل طراز.
    9. انقل الألواح إلى جو 5٪ من ثاني أكسيد الكربون2 في حاضنة 37 درجة مئوية حتى تصبح جاهزة لصرف الأدوية. للتخلص من الاختلافات في تبادل الهواء بين الألواح المختلفة ، تجنب تكديس الألواح في الحاضنة.
    10. قم بتنظيف الأنبوب في أسرع وقت ممكن باستخدام PBS ثم EtOH. تأكد من تجفيف الأنبوب تماما عن طريق تشغيل الهواء عبر النظام.

5. اليوم 2 (النطاق: الأيام 1 - 3): صرف الأدوية باستخدام موزع الأدوية (على سبيل المثال ، D300e)

ملاحظه:. اعتمادا على سؤال البحث ، يمكن أيضا إجراء طباعة الدواء بعد يوم واحد من البذر.

  1. قم بإعداد موزع الأدوية
    1. ابدأ تشغيل برنامج الموزع ، وحدد تنسيق اللوحة المطلوب المستخدم للشاشة عن طريق تمييز اللوحة 1 وتحديد أداة القلم الرصاص لإظهار محرر اللوحة.
    2. حدد نوع اللوحة واضبط حجما إضافيا لكل بئر (حجم السائل (التعليق العضوي) الموجود بالفعل في اللوحة). للحصول على تنسيق 384 بئر ، استخدم 40 ميكرولتر / بئر.
    3. في الشريط الأيسر ، استخدم الرمز + لإضافة كل محلول دوائي سيتم استخدامه في الشاشة.
    4. قم بتحرير كل سائل عن طريق تحديد أداة القلم الرصاص . قم بتحرير اسم الدواء وفئة الدواء (على سبيل المثال ، المستند إلى DMSO أو المائي (على سبيل المثال ، الماء ، PBS)) ، وتركيز مخزون الدواء.
      ملاحظة: لا تتجاوز تركيز مخزون 10 ملي مولار لكل دواء. من الناحية المثالية ، يجب أن يكون الحد الأقصى لتركيز المذيب 0.8٪ ل DMSO و 3٪ لمنظف PBS / 0.3٪ (على سبيل المثال ، Tween) (انظر التطبيع أدناه والمناقشة).
    5. بمجرد إضافة جميع الأدوية في البرنامج ، حدد الآبار لإضافة الأدوية عن طريق تسليط الضوء على بئر على تخطيط اللوحة وسحبها عبرها. انقر بزر الماوس الأيمن على الآبار المحددة ، وأضف التركيز.
      1. اضبط القيمة لتحديد التركيز المطلوب لكل دواء (ميكرومتر).
      2. بالنسبة للمعايرة بالتحليل الحجمي، حدد أعلى وأدنى تركيز مطلوب لكل دواء (ميكرومتر)، والتوزيع (لوغاريتمي أو خطي)، والتكرارات لكل مستوى (على سبيل المثال، 3)، ونمط المعايرة بالتحليل الحجمي.
      3. بالنسبة للمعايرة بالتحليل الحجمي المستهدف، حدد أعلى وأدنى تركيز لكل دواء، والتوزيع (لوغاريتمي أو خطي)، والتركيز المستهدف (ميكرومتر)، والمنطقة المستهدفة (المستويات)، والمدى المستهدف (السجل)، والتكرارات لكل مستوى (على سبيل المثال، 3)، ومنمط المعايرة بالتحليل الحجمي.
    6. تطبيع جميع آبار الدواء إلى المذيب المناسب لها (على سبيل المثال ، DMSO أو مائي + Tween-20). بالنسبة للأدوية المذابة في المحاليل المائية ، أضف Tween-20 (التركيز النهائي 0.3٪ في مخزون الأدوية) لضمان التوتر السطحي المناسب لمحلول الدواء للصرف باستخدام D300e (انظر 5.2.6). حدد جميع الآبار ، بما في ذلك تلك التي لا تحتوي على دواء (عناصر تحكم سلبية) ، وانقر بزر الماوس الأيمن ، وحدد التطبيع ، ثم تطبيع. حدد المذيب المناسب ، وحدد تطبيع إلى أعلى حجم من الفئة للتطبيع إلى أعلى تركيز للدواء المحدد.
      ملاحظة: تظهر المثلثات السوداء الآن في الزاوية اليسرى السفلية من كل بئر لتأكيد التطبيع. تهدف إلى الحصول على ما لا يقل عن 6 (من الناحية المثالية >9) آبار تحكم سلبية لكل مذيب دواء مستخدم.
    7. حدد ما لا يقل عن 3 آبار (من الناحية المثالية >6) لاستخدام الكواشف السامة للخلايا المعروفة مثل staurosporine كضوابط إيجابية (1-5 ميكرومتر) اعتمادا على الثقافات. إذا كان التركيز السام للخلايا للتحكم الإيجابي غير معروف ، فاختر تركيزا عاليا لقتل جميع العضيات في آبار التحكم الإيجابية.
      ملاحظة: بدلا من ذلك ، يمكن استخدام Navitoclax (20 ميكرومتر) لضمان الموت العضوي أثناء فحص الدواء.
    8. بمجرد اكتمال تخطيط اللوحة، حدد تشغيل (إذا كان الجهاز قيد التشغيل) في الزاوية العلوية اليسرى. احفظ البروتوكول للمتابعة.
      ملاحظة: قام البرنامج الآن بحساب الحجم المطلوب لكل دواء للصرف. نظرا لأن هذا يشمل خطأ في سحب العينة ، فهذه هي الكمية الدقيقة من الدواء المطلوبة للبروتوكول بأكمله. اختياري: سيؤدي تحديد المحاكاة إلى محاكاة البروتوكول بأكمله (بدون إضافة أدوية) لمراقبة كيفية تشغيل البروتوكول. في كل من وضعي التشغيل والمحاكاة ، يتم إنشاء تقرير يوثق وقت وترتيب وأحجام الأدوية المضافة إلى كل بئر. يمكن أن يكون هذا مفيدا للتأكد من صحة البروتوكول وتحديد الحجم الدقيق وعدد الكاسيتات المطلوبة قبل متابعة التجربة.
  2. تحضير الأدوية وطباعتها
    1. أضف 0.3٪ (حجم / حجم) Tween-20 إلى مخزونات الأدوية المائية (على سبيل المثال ، الماء أو PBS) لضمان التوتر السطحي المناسب لمحلول الدواء للصرفه باستخدام D300e. تأكد من أن تركيز Tween-20 لا يتجاوز 3٪ PBS / 0.3٪ Tween-20 (v / v) ، وحافظ على التركيز النهائي ل Tween-20 أقل من 0.01٪.
      ملاحظة: أضف Tween-20 فقط إلى مخزون الأدوية مباشرة قبل إضافته إلى كاسيت طابعة الأدوية ، حيث أن التركيز العالي ل Tween-20 في المخزون يحتمل أن يؤدي إلى تعطيل الأدوية (القائمة على البروتين) (على سبيل المثال ، الأدوية القائمة على الأجسام المضادة). هذه الخطوة غير مطلوبة للأدوية المذابة في DMSO. ومع ذلك ، تأكد من أن النسبة النهائية ل DMSO في كل بئر لا تتجاوز 0.8-1٪.
    2. جهز كلا من الكاسيتات منخفضة الحجم D8+ وD4+ كبيرة الحجم. تحقق من استخدام أشرطة كبيرة الحجم في البرنامج عند استخدام كميات كبيرة من سائل التطبيع.
    3. قم بتشغيل البروتوكول لبدء صرف الأدوية.
      ملاحظة: سيقوم البرنامج بتشغيل البروتوكول خطوة بخطوة ويشير إلى متى وكم من كل مركب يجب إضافته. استخدم نصائح المرشح للتعامل مع تركيزات عالية من الأدوية. احرص على التخلص من النفايات الكيميائية والنصائح المستخدمة باتباع إرشادات السلامة البيولوجية.
    4. بمجرد انتهاء البروتوكول ، استخدم أختام لاصقة نفاذية للهواء والسائل (على سبيل المثال ، أختام الألواح الطبية المصنوعة من البولي يوريثين. جدول المواد) لتغطية الألواح ، وإعادة الألواح إلى 37 درجة مئوية ، 5٪ ثاني أكسيدالكربون 2.
      ملاحظة: استخدام هذه الأختام يمنع التبخر "تأثير الحافة" (انظر المناقشة). إذا لم تستخدم الأختام ، فتأكد من عدم استخدام الحواف الخارجية للوحة في شاشة الدواء. لا تقم بتكديس الألواح فوق بعضها البعض ، وتأكد من إبقاء الألواح في الجزء الخلفي من الحاضنة ، أو استخدم حاضنة غير مفتوحة (بشكل متكرر) لتجنب تقلبات درجات الحرارة.
    5. إذا تم الجمع بين العلاج الإشعاعي والأدوية المطبوعة، فانتقل إلى القسم 6. إذا لم يكن كذلك ، اترك الأطباق في الحاضنة لمدة 5 أيام.
      ملاحظة: اعتمادا على نوع العضوية ونوع الدواء ، قد تستغرق بعض التجارب أكثر من 5 أيام. بالنسبة للتجارب التي تستمر >7 أيام ، قم بتغيير الوسط والمركبات بعناية في منتصف الطريق من خلال الإجراء التجريبي (على سبيل المثال ، عن طريق استبدال 50٪ من الوسط بوسط فحص جديد) لتجنب موت الخلايا على نطاق واسع في آبار التحكم السلبية.

6. اليوم 2 (النطاق: الأيام 2 - 4): معالجة العضيات باستخدام إشعاع شعاع الفوتون

ملاحظة: تصف الخطوات التالية تشعيع العضيات. لتقييم التأثيرات الحساسة للإشعاع لمركبات الأدوية ، يتم التشعيع بعد 24 ساعة من تعرض العضيات للعلاج الكيميائي. يستخدم نفس البروتوكول لتقييم آثار التشعيع وحده ، حيث يتم زرع العضيات وتعريضها للإشعاع بعد 24 ساعة من البذر. قد يتطلب هذا بعض التحسين اعتمادا على الفرضية والثقافات العضوية. تصف الخطوات التالية العملية المستخدمة لإشعاع العضيات باستخدام حزم فوتون 6 ميجافولت تم إنشاؤها على وجه التحديد (جدول المواد). تم تحسين هذه الآلة للتطبيقات السريرية وبالتالي تعكس الممارسة السريرية الحقيقية. قد تتطلب الآلات المختلفة إعدادا مختلفا وقد تتطلب أيضا تحسينا للجرعات حيث قد تختلف الجرعة الفعالة عن تلك المختارة.

  1. قم بإزالة الألواح من الحاضنة 37 درجة مئوية ، وأعد الأغطية إلى كل لوحة أعلى الأختام ؛ لا تقم بإزالة الأختام. خذ لوحة 0 Gy معك في هذه العملية للتأكد من أن لوحة التحكم قد تعرضت لظروف متطابقة.
  2. انقل العضيات إلى المشعع. قم بإعداد جهاز التشعيع عن طريق ملء صندوق بلاستيكي بماء الصنبور الفاتر ، وثبته في حامل اللوحة لمنع اللوحة من الطفو.
  3. اغمر اللوحة في الماء بحيث يكون الماء مستويا مع السطح العلوي للوحة. ثبت اللوحة في موضعها باستخدام جهاز لا يسمح للوحة بالطفو (كما هو موضح في الفيديو). اترك الغرفة ، وقم بإشعاع الألواح بجرعات متزايدة (على سبيل المثال ، 1 و 2 و 4 و 6 و 8 و 10 جراي). قم بإشعاع لوحة واحدة فقط في كل مرة ، لأن كومة من الألواح لا تسمح بتشتت الإشعاع بشكل متساو.
    ملاحظة: تأكد من اختيار جرعات التشعيع المناسبة لتحقيق منحنى استجابة الجرعة.
  4. جفف الألواح جيدا بعد التشعيع بالمناديل ، واستبدل الغطاء الصلب. انقل الأطباق مرة أخرى إلى غرفة الثقافة. قم بإزالة الغطاء الصلب وامسح الجزء الخارجي من كل لوحة بمناديل EtOH مرشوشة برفق. لا تقم بإزالة الأختام القابلة للتنفس.
  5. ضع الألواح في الجزء الخلفي من الحاضنة لتجنب تقلبات درجات الحرارة بسبب فتح الباب ؛ لا تكدس اللوحات.

7. اليوم 2. اختياري: لوحة قياس مقايسة قابلية الخلية ثلاثية الأبعاد (CTG) CellTiter-Glo T = 0 (مطلوبة لتحليل الموارد الوراثية)

  1. إذا كنت تهدف إلى حساب مقاييس الموارد الوراثية (انظر 11.3.5 والمناقشة)، قم بقياس قيم CTG في لوحة T=0 باتباع الخطوات 9.1-10.4.

8. قبل يوم واحد من قراءة فحص المخدرات: التحضير

  1. احسب الحجم الإجمالي ل CTG المطلوب. بالنسبة للوحة 384 بئرا ، استخدم 40 ميكرولتر من CTG لكل بئر (أضف CTG 1: 1 وفقا لتوصية الشركة المصنعة). خذ الحجم الميت للتوزيع متعدد القطرات (1 مل لكل أنبوب) في الاعتبار. قم بإذابة CTG طوال الليل عند 4 درجات مئوية ، محمية من الضوء.
  2. اختبر ما إذا كان الموزع يتطلب معايرة.

9. اليوم 7 (النطاق: الأيام 7 - 14): قراءة فحص المخدرات: فحص CTG

  1. اسمح ل CTG بالوصول إلى درجة حرارة الغرفة. افحص بصريا جميع آبار اللوحة المكونة من 384 بئرا قبل القراءة ، وسجل ما إذا كانت هناك أي إصابات.
  2. صور الآبار ذات الصلة تحت مجهر المجال الساطع. قم بتضمين الضوابط الإيجابية (staurosporine) ، والضوابط السلبية (آبار التطبيع) ، وأعلى تركيز لكل دواء.
  3. اغسل الماكينة متعددة القطرات وقم بتجهيزها وفقا للخطوات الموضحة في القسم 4.4. قم بتوزيع 40 ميكرولتر من CTG على كل بئر ، وفقا لإعداد اللوحة. رج العبوة باستخدام شاكر الألواح في موزع القطرات المتعددة (رج) لمدة 5 دقائق ، واحتضنه في درجة حرارة الغرفة ، محميا من الضوء لمدة 25 دقيقة.
    ملاحظة: تفاعل CTG هو تفاعل إنزيمي وبالتالي يتأثر بدرجة الحرارة ووقت الحضانة. من المفترض أن تكون الإشارة مستقرة لمدة 30-60 دقيقة. ومع ذلك ، فإن استخدام نفس وقت الحضانة لجميع اللوحات ، خاصة عند حساب مقاييس الموارد الوراثية ، يزيد من الدقة.

10. قياسات التلألؤ البيولوجي CTG

  1. قم بتشغيل قارئ لوحة التلألؤ الحيوي بسعة 384 بئر والكمبيوتر. هنا ، تم استخدام قارئ لوحة Spark.
  2. افتح برنامج محرر أسلوب Spark (انظر جدول المواد). حدد تنسيق اللوحة: COS384fb-Corning 384 أسود مسطح | بدون غطاء | لا يوجد كاسيت للرطوبة ؛ حدد الآبار التي تحتاج إلى قياس.
  3. في القائمة السفلية اليمنى، حدد اكتشاف | تلألؤ ، واسحب أسفل اللوحة. النوع: توهين ، القائمة الثانية: لا شيء. قم بتعيين وقت التكامل [مللي ثانية]: 500.
  4. ضع اللوحة وحددها وقم بتشغيل الطريقة بالنقر فوق ابدأ. احفظ جدول البيانات الذي تم تصديره.

11. تحليل البيانات

  1. احسب عامل Z (Z') لتقييم جودة الشاشة.
    1. احسب متوسط (Av) والانحرافات المعيارية (SDs) لكل من عناصر التحكم السلبية (Ctrlneg ، على سبيل المثال ، DMSO) والإيجابية (Ctrlpos ، على سبيل المثال ، Staurosporine).
    2. احسب عامل Z = 1 - (3 × SD [Ctnlneg] + 3 × SD [Ctrlpos] / mean [Ctrlneg] -mean [Ctrlpos]).
      ملاحظة: يعبر Z عن التباين داخل ومساحة النسبة بين عناصر التحكم الموجبة والسالبة ، وبالتالي فهو مقياس للنطاق الديناميكي للمقايسة13. استبعاد نتائج فحص المخدرات ب Z 'أقل من 0.3; يوصى باستخدام البيانات ذات > Z '0.5. يتراوح متوسط Z بشكل عام بين 0.5 و 0.7 (اعتمادا على النماذج العضوية المستخدمة). لكي تكون Z مفيدة ، يجب أن تكون جميع العضيات في آبار التحكم الإيجابية قد ماتت.
  2. احسب الجدوى العضوية النسبية لكل بئر عن طريق تعيين Ctrlneg إلى 100٪ و Ctrlpos إلى 0٪ الجدوى.
    1. استخدم هذه الصيغة لحساب صلاحية العضوية.
      الجدوى العضوية = 100٪ × (قيمة البئر التجريبية - Av Ctrlpos) / (Av Ctrlneg - Av Ctrlpos)
      1. بالنسبة للعضيات المشععة ، احسب قيمة النسبة المئوية.
        النسبة المئوية للبقاء العضوية = 100٪ × (قيمة البئر التجريبية x GY) / (Av Ctrlneg قيمة البئر 0 GY)
    2. تصور البيانات في برنامج تحليل البيانات عن طريق نسخ بيانات الجدوى إلى جدول xy ، وتحديد العدد المناسب من قيم النسخ المتماثل لكل تركيز.
    3. بالنسبة لتركيزات الأدوية اللوغاريتمية ، قم بتحويل تركيزات الدواء ، وانسخ هذه القيم في العمود الأول من الجدول.
    4. لتنسيق الرسم البياني، حدد نوع الرسم البياني (XY)، وحدد الخطأ القياسي للمتوسط (SEM)، واضبط الأصل على أسفل اليسار.
  3. تحديد IC50 النسبي ، والمساحة تحت المنحنى (AUC) ، ومقاييس GR.
    1. بالنسبة للانحدار غير الخطي، في علامة التبويب تحليل ، حدد ملاءمة منحنى مع انحدار غير خطي. اختر سجل الخيارات (المثبط) مقابل الاستجابة الطبيعية - المنحدر المتغير لإنشاء منحنى قتل.
    2. انقر فوق علامة التبويب "النتائج" لعرض IC50 النسبي لكل دواء.
      ملاحظة: هذا هو تركيز الدواء الذي يعطي استجابة في منتصف الطريق بين الجزء السفلي والعلوي من المنحنى. الجزء السفلي والأعلى عبارة عن هضاب في وحدات المحور y.
    3. بالنسبة للمنطقة الواقعة أسفل المنحنى (AUC)، ضمن علامة التبويب تحليل ، حدد المنطقة تحت المنحنى، واستخدم الإعدادات المحددة مسبقا، وحدد موافق.
    4. انقر فوق علامة التبويب النتائج لعرض AUC (المساحة الإجمالية) لكل دواء.
      ملاحظة: AUC هو قياس متكامل لتأثير قابل للقياس ، والذي يستخدم كقياس تراكمي لتأثير الدواء. مع بعض الجزيئات ، مثل الأجسام المضادة ، لا يكون منحنى استجابة الجرعة على شكل سيني ، ويصعب تفسير قيم IC50 . في مثل هذه الحالة ، قد توفر قيم AUC مزيدا من المعلومات كمقياس لمقارنة الاختلافات بين الخطوط العضوية.
    5. وبدلا من ذلك، إذا أجريت قياسات CTG في اليوم 2 (الخطوتان الاختياريتان 4-4-5 والقسم 7)، فحسب مقاييس الموارد الوراثية. تحليل مقاييس الموارد الوراثية باستخدام حاسبة المواردالوراثية 14 على الإنترنت، مع مراعاة الاختلافات في معدل الانتشار بين النماذج العضوية في جميع أنحاء شاشة الدواء لضمان قياسات أكثر قابلية للتكرار والحساسية.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

النتائج

كان الهدف من هذه التجربة هو فحص حساسية عضيات HNSCC للعلاج الكيميائي والعلاج الإشعاعي كعوامل مفردة. اختبرنا أيضا قابلية تكرار النتائج عن طريق تنفيذ التجربة عدة مرات بفاصل أسبوع ، مما أدى إلى العديد من التكرارات البيولوجية (التجارب 1-3) (الشكل 2). باتباع البروت?...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

يصف هذا المقال والفيديو كيفية إجراء فحص الأدوية متوسط الإنتاجية باستخدام PDOs. يمكن اعتماد هذا البروتوكول ، مع التحسين ، لفحص العضيات المشتقة من أنواع مختلفة من الأنسجة من تلك الموضحة هنا. يعد تحديد الإطار الزمني المثالي للمرور قبل الشاشة أمرا مهما لأن هذا سيختلف باختلاف ...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

MP و QXL موظفان بدوام كامل في Crown Bioscience. RO و SB موظفان بدوام كامل في Hubrecht Organoid Technology (HUB). HC هو مخترع في العديد من براءات الاختراع المتعلقة بالتكنولوجيا العضوية. يتم تقديم إفصاحه الكامل في https://www.uu.nl/staff/JCClevers/. ED هو مخترع على براءة اختراع تتعلق بتقنية HN العضوية. HC هو مؤسس OrganoidZ ، التي تستخدم العضيات لتطوير الأدوية.

Acknowledgements

نشكر Annemarie Buijs و Xiaoxi Xu و Federica Parisi على المناقشات والمدخلات القيمة ، ونشكر Ingrid Boots و Marjolijn Gross على المساعدة الفنية.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
Required equipment
384-well bioluminescence platereader; e.g. Tecan Spark 10M plate readerTecan
Brightfield microscope with large field of view lens (2.5x)
Digital dispenser; e.g. Tecan D300eTecanDrug dispensing
6 MV photon beam irradiatorElekta model Synergy, Elekta Sweden
Liquid handler with large nozzle (“standard tube”) cassettes; 
e.g. Multidrop Combi Reagent DispenserThermo Scientific
Plastic container with plate holder insert for radiotherapyHome-made
Spark control method editor software
Standard tissue culturing equipment (LAF cabinet, incubator, centrifuge, waterbath, etc)
Required materials
1.5 mL plastic tubes
15- and 50-mL plastic tubes
5, 10- and 25-mL sterile plastic pipets
6-well cell culture plates
Black 384-well ultra-low-attachment clear-bottom plate; e.g.. Corning 384 flat blackCorning4588
Breathe-Easy sealing membraneMerckpre-cut polyurethane medical-grade membrane with acrylic adhesive
Glasstic slide10-chambered slide with hemocytometer grid
Multidrop Combi Reagent Dispenser standard tube dispensing cassetteThermo Scientific
Plugged Pasteur’s pipet of which the tip has been tightened in a flame
Reversible 20/40/70/100 µm filters: PluriStrainerPluriselecte.g. 43-50020-03
Sterile P1000, P200, P20 and P2 pipet tips and low-retention filter tips ( e.g. Sapphire tips)Greiner750266
T8 Plus and D4 Plus casettesHP/Tecan
Required reagents
100 x GlutamaxL-glutamine substitute
1 M HEPES
30% (v/v) Tween-20 diluted in PBS
70% EtOH
Advanced-DMEM/F12Thermo Scientific12634-010
CellTiter-Glo 3D cell viability assayPromegaG9681
Compounds to test screen, including Staurosporin or other positive control
Dispase IISigma-AldrichD4693
DMSO
ECM for CRC: growth-factor reduced Matrigel, phenol-freeCorning356231
ECM for HNSCC PDOs: BME, Cultrex RGF Basement membrane extract, Type R1R&D Systems3433-005-R1
Expansion growth medium (specific for each organoid type)
Organoid growth factors (specific for each organoid type)
PBS
Pen/Strep (100 U/mL)
ROCK inhibitor: Y-27632AbmoleM1817
TrypLE
Required Software Packages:
GraphPad Prism
Microsoft Excel

References

  1. Tiriac, H., et al. Organoid profiling identifies common responders to chemotherapy in pancreatic cancer. Cancer Discovery. 8 (9), 1112-1129 (2018).
  2. Sachs, N., et al. A Living biobank of breast cancer organoids captures disease heterogeneity. Cell. 172 (1-2), 373-386 (2018).
  3. Yan, H. H. N., et al. A comprehensive human gastric cancer organoid biobank captures tumor subtype heterogeneity and enables therapeutic screening. Cell Stem Cell. 23 (6), 882-897 (2018).
  4. Ganesh, K., et al. A rectal cancer organoid platform to study individual responses to chemoradiation. Nature Medicine. 25 (10), 1607-1614 (2019).
  5. Ooft, S. N., et al. Patient-derived organoids can predict response to chemotherapy in metastatic colorectal cancer patients. Science Translational Medicine. 11 (513), (2019).
  6. Vlachogiannis, G., et al. Patient-derived organoids model treatment response of metastatic gastrointestinal cancers. Science. 359 (6378), 920-926 (2018).
  7. Yao, Y., et al. Patient-derived organoids predict chemoradiation responses of locally advanced rectal cancer. Cell Stem Cell. 26 (1), 17-26 (2019).
  8. de Witte, C. J., et al. Patient-derived ovarian cancer organoids mimic clinical response and exhibit heterogeneous inter- and intrapatient drug responses. Cell Reports. 31 (11), 107762(2020).
  9. van de Wetering, M., et al. Prospective derivation of a living organoid biobank of colorectal cancer patients. Cell. 161 (4), 933-945 (2015).
  10. Driehuis, E., et al. Oral mucosal organoids as a potential platform for personalized cancer therapy. Cancer Discovery. 9 (7), 852-871 (2019).
  11. Sachs, N., et al. Long-term expanding human airway organoids for disease modeling. The EMBO Journal. 38 (4), 100300(2019).
  12. Driehuis, E., Kretzschmar, K., Clevers, H. Establishment of patient-derived cancer organoids for drug-screening applications. Nature Protocols. 15 (10), 3380-3409 (2020).
  13. Zhang, J. -H., Chung, T. D. Y., Oldenburg, K. R. A simple statistical parameter for use in evaluation and validation of high throughput screening assays. Journal of Biomolecular Screening. 4 (2), 67-73 (1999).
  14. Hafner, M., Niepel, M., Chung, M., Sorger, P. K. Growth rate inhibition metrics correct for confounders in measuring sensitivity to cancer drugs. Nature Methods. 13 (6), 521-527 (2016).
  15. Chen, X., Qian, W., Song, Z., Li, Q. -X., Guo, S. Authentication, characterization and contamination detection of cell lines, xenografts and organoids by barcode deep NGS sequencing. NAR Genomics and Bioinformatics. 2 (3), (2020).
  16. Driehuis, E., et al. Patient-derived head and neck cancer organoids recapitulate EGFR expression levels of respective tissues and are responsive to EGFR-targeted photodynamic therapy. Journal of Clinical Medicine. 8 (11), 1880(2019).
  17. Sebaugh, J. L. Guidelines for accurate EC50/IC50 estimation. Pharmaceutical Statistics. 10 (2), 128-134 (2011).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

PDO ATP IC50 AUC GR

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved