Test di screening farmacologico e radioterapico a medio rendimento utilizzando organoidi derivati da pazienti

Riepilogo

Descriviamo protocolli dettagliati per l'utilizzo di organoidi derivati da pazienti per lo screening della sensibilità alla terapia a medio rendimento. Le terapie testate includono la chemioterapia, la radioterapia e la chemio-radioterapia. I livelli di adenosina trifosfato sono utilizzati come lettura funzionale.

Abstract

I modelli di organoidi derivati da pazienti (PDO) consentono l'espansione e il mantenimento a lungo termine di cellule epiteliali primarie cresciute in tre dimensioni e in uno stato quasi nativo. Quando derivati da tessuto tumorale resecato o biopsiato, gli organoidi ricapitolano fedelmente la morfologia tumorale in vivo e possono essere utilizzati per studiare la risposta alla terapia in vitro. Le biobanche di organoidi tumorali riflettono la grande varietà di tumori clinici e pazienti e quindi sono molto promettenti per le applicazioni precliniche e cliniche. Questo articolo presenta un metodo per lo screening farmacologico a medio rendimento utilizzando il carcinoma a cellule squamose della testa e del collo e gli organoidi di adenocarcinoma colorettale. Questo approccio può essere facilmente adottato per l'uso con qualsiasi modello di organoide derivato da tessuti, sia normale che malato. Vengono descritti i metodi per l'esposizione in vitro di organoidi alla chemioterapia e alla radioterapia (sia in modalità di trattamento singolo che in combinazione). La sopravvivenza cellulare dopo 5 giorni di esposizione al farmaco viene valutata misurando i livelli di adenosina trifosfato (ATP). La sensibilità ai farmaci è misurata dalla concentrazione inibitoria semimassima (IC₅₀), dall'area sotto la curva (AUC) e dal tasso di crescita (GR). Questi parametri possono fornire informazioni sul fatto che una coltura di organoidi sia considerata sensibile o resistente a un particolare trattamento.

Introduzione

I modelli di organoidi creati da cellule staminali adulte e cresciuti in una matrice extracellulare (ECM) tridimensionale (3D) e in uno specifico cocktail di fattori di crescita (noti anche come organoidi HUB) stanno guadagnando terreno come piattaforme di screening oncologico preclinico. Le colture di organoidi derivati da pazienti (PDO) possono essere stabilite da biopsie di tessuti normali e malati entro 1-2 settimane e possono essere estese per un minimo di 1-2 mesi fino a periodi di tempo illimitati. La crioconservazione consente l'utilizzo a lungo termine di colture ben caratterizzate. A differenza dei tradizionali modelli di linee cellulari bidimensionali che sono derivati clonalmente, i modelli PDO ricapitolano fedelmente il tessuto tumorale originale, sia fenotipicamente che geneticamente, e preservano l'eterogeneità del tumore. Gli screening farmacologici a medio rendimento sui PDO, che testano un'ampia gamma di terapie, forniscono una piattaforma unica per la medicina personalizzata.

Studi precedenti hanno descritto l'uso di modelli di organoidi per lo screening terapeutico, in particolare farmaci e radioterapia, in modelli stabiliti da diversi tipi di tumori e mostrano il potenziale predittivo degli organoidi per guidare il processo decisionale clinico 1,2,3,4,5,6,7,8,9,10,11 . Questo articolo descrive i metodi di screening della terapia oncologica utilizzando PDO in una capacità di rendimento medio (Figura 1A). Questo protocollo è configurato in un formato di piastra a 384 pozzetti con semi-automazione, che consente di testare la terapia per un massimo di otto modelli di organoidi, 16 composti e fino a otto piastre da 384 pozzetti. Oltre agli screening dei farmaci composti, questo articolo descrive anche i metodi per valutare la sensibilità e la sensibilizzazione alla radioterapia. Inoltre, viene discusso l'uso della robotica ad alto rendimento per l'upscaling dello screening dei farmaci alla completa automazione. È importante sottolineare che organoidi provenienti da tessuti diversi possono richiedere terreni diversi e una manipolazione diversa.

Qui viene descritto un protocollo generale di test di screening dei farmaci, che potrebbe richiedere un adattamento a seconda dell'organoide di interesse. Nella discussione sono inclusi punti di partenza e suggerimenti per l'ottimizzazione, nonché raccomandazioni generali riguardanti l'impostazione sperimentale e la pratica degli organoidi. Esempi sono forniti utilizzando organoidi di carcinoma a cellule squamose della testa e del collo (HNSCC), che tipicamente hanno una morfologia densa, e organoidi di cancro del colon-retto (CRC) che possono avere una morfologia cistica o densa. Si prega di notare che i metodi di insediamento e coltura di espansione degli organoidi primari non sono coperti da questo protocollo; Per le tecniche di base degli organoidi, il lettore dovrebbe fare riferimento ad altri protocolli (ad ^esempio,12). Questo protocollo visivo fornirà informazioni sul processo di screening dei farmaci a medio rendimento utilizzando modelli di organoidi.

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Protocollo

NOTA: Prima di utilizzare questo protocollo, assicurarsi che vengano seguite le linee guida del comitato etico per la ricerca umana dell'istituto. La raccolta dei tessuti dei pazienti e dei dati descritti in questo protocollo è stata eseguita seguendo le linee guida EUREC e seguendo le leggi europee, nazionali e locali. Tutti gli organoidi sono stati derivati da pazienti consenzienti e il consenso può essere revocato in qualsiasi momento.

1. Prima dello screening

1. Confermare l'identità dei modelli di nuova costituzione (ad esempio, mediante istologia e/o sequenziamento del DNA ^{1,2,3,4,5,6,7,8,9,10,11}) per escludere la possibilità di una normale crescita eccessiva delle cellule e garantire che lo screening del farmaco venga eseguito su colture di organoidi tumorali (vedi esempio in Figura 2D).
2. Progettare la configurazione sperimentale della piastra, utilizzando le raccomandazioni generali fornite nella sezione di discussione (vedere l'esempio nella Figura S1 supplementare).
3. Calcolare il numero richiesto di organoidi e preparare un numero sufficiente di organoidi pronti per la scissione al giorno 0 (utilizzare la Tabella 1 come riferimento).
   NOTA: A seconda del GR del tipo e del modello di organoide, sono necessarie circa 1-2 piastre complete a 6 pozzetti per ogni piastra di screening completa a 384 pozzetti. Come linea guida, un pozzetto pieno di una piastra a 6 pozzetti contiene ±20.000 organoidi cistici o fino a 50.000 organoidi densi/simili all'uva.
4. Controllare se l'erogatore di celle è calibrato utilizzando un colorante reporter e, se necessario, calibrare secondo il protocollo del produttore.

2. Preparazione del reagente

1. Preparare il supporto di base: Advanced DMEM/F12+++ (aDF+++). Aggiungere 5 ml ciascuno di 1x sostituto della L-glutammina (v/v), 1 M 4-(2-idrossietil)-1-piperazina etansolfofonico (HEPES) e 100 U/mL di penicillina/streptomicina a un flacone da 500 ml di DMEM/F12 avanzato. Mantenere aDF+++ a 4 °C per un massimo di 1 mese.
2. Preparare il terreno di espansione (cioè di crescita) dell'organoide appropriato per il tipo di organoide in uso ^9,10.
3. Preparare il mezzo di filtraggio, che potrebbe essere diverso dal mezzo di espansione a seconda della configurazione sperimentale. Per favorire il recupero dopo l'erogazione degli organoidi, aggiungere 5 μM di inibitore della Rho chinasi (ROCK) (Y-27632) al terreno di screening.
4. Preparare una soluzione di 100 mg/mL di Dispase II in aDF+++.
   NOTA: Una soluzione 100x della dispasi è stabile a -20 °C per 2 mesi.

3. Giorno 0: Preparazione degli organoidi

NOTA: I volumi indicati di seguito partono da una piastra completa a 6 pozzetti di organoidi, equivalente a 1200 μL di organoidi/ECM (200 μL di organoidi/ECM per pozzetto).

1. Ispezionare gli organoidi utilizzando un microscopio a campo chiaro per possibili infezioni, densità e aspetto generale; Scatta le immagini di tutti i modelli come riferimento prima di passare.
2. Passare gli organoidi e il seme secondo i passaggi seguenti. Eseguire questi passaggi a temperatura ambiente per ridurre le fluttuazioni di temperatura degli organoidi. Ogni volta che si maneggiano sospensioni di organoidi, utilizzare punte a bassa ritenzione o pipette e plastiche pre-bagnate per evitare la perdita di organoidi.
   1. Quando si utilizzano volumi maggiori di ECM/organoidi (>1200 μL di ECM), considerare la digestione ECM con la dispasi come segue per facilitare la rimozione degli organoidi dalla ECM.
      NOTA: La dispasi disintegra l'ECM, ma non influisce sugli organoidi.
      1. Facoltativo: aggiungere 1 mg/mL di dispasi a ciascun pozzetto e incubare gli organoidi in un incubatore a 37 °C per 30 minuti prima di passare come di consueto.
         NOTA: Poiché la dispasi non viene inattivata dai componenti medi, lavarla via (utilizzando aDF+++) con almeno 20 volte il volume della dispasi aggiunta.
   2. Raccogliere gli organoidi in tre provette da 15 mL (fino a 400 μL di ECM per provetta). Rabboccare fino a 12 mL con aDF+++ e centrifugare per 5 minuti a RT a 85 × g. Se adeguatamente pellettato, aspirare il surnatante. Se gli organoidi non sono stati pellettati in modo evidente, centrifugare a una velocità maggiore (fino a 450 × g, a seconda del tipo e delle dimensioni dell'organoide) per altri 5 minuti. Risospendere il pellet e ripetere il lavaggio.
      NOTA: Uno strato simile al vetro sopra il pellet indica la presenza di ECM. Verificare che nessun organoide sia intrappolato nell'ECM utilizzando un microscopio a campo chiaro (un numero basso di organoidi intrappolati può essere accettabile) e rimuovere con cura l'ECM rimanente con una pipetta p1000. Se nell'ECM sono presenti (troppi) organoidi, ripetere la fase di dissociazione della dispasi, oppure lavare il pellet e centrifugare a una velocità maggiore (massimo 450 × g).
   3. Per ogni provetta da 15 mL, risospendere il pellet di organoidi in 1 mL di aDF+++ e dissociare accuratamente gli organoidi fino a quando non hanno raggiunto la giusta dimensione. Utilizzare il metodo di dissociazione utilizzato per la scissione regolare, a seconda del tipo/morfologia (Tabella 1).
      1. Nel caso di organoidi cistici e simili all'uva, disgregarli meccanicamente, tagliandoli in piccoli frammenti (<100 μm) pipettandoli su e giù con un p1000 con una punta p2 sulla parte superiore, o con una pipetta Pasteur pre-bagnata con tappo di vetro la cui punta è stata ristretta in una fiamma.
         NOTA: Confermare l'interruzione degli organoidi utilizzando un microscopio a campo chiaro dopo aver pipettato su e giù ogni 5 volte, con l'obiettivo di far sì che gli organoidi siano inferiori o all'interno dell'intervallo di dimensioni dello schermo (Tabella 1).
      2. Per gli organoidi densi, aggiungere 1 mL di soluzione al 50% v/v di TrypLE in aDF+++ per risospendere il pellet cellulare e incubare per un minimo di 2 minuti a 37 °C. Successivamente, agitare energicamente il tubo su e giù e controllare al microscopio a campo chiaro. Utilizzando lo stesso approccio di cui sopra, disgregare meccanicamente gli organoidi con una pipetta, controllando costantemente al microscopio durante tutto il processo. Per gli organoidi HNSCC, incubare in soluzione al 100% del TrypLE per 5 minuti.
         NOTA: A seconda del tipo di coltura, puntare a ottenere piccoli gruppi di cellule (ad esempio, organoidi CRC, >20 μm) o singole cellule (ad esempio, organoidi HNSCC). Assicurarsi che l'incubazione proteolitica non superi i 15 minuti in quanto ciò potrebbe influire sulla vitalità degli organoidi.
   4. Lavare gli organoidi con 10 mL di aDF+++. Centrifugare gli organoidi a 85 × g per 5 min; Aspirare il surnatante se opportunamente pellettato. In alternativa, se gli organoidi sono difficili da pellettare, centrifugare fino a 450 × g per 5 minuti.
   5. Organoidi di semi ad alta densità in 50% di terreno di espansione/50% ECM (consentendo una facile rimozione dall'ECM nella sezione 4). Puntare a una densità approssimativamente doppia rispetto a una divisione regolare, che spesso si traduce in una divisione 1:1 (vedere gli esempi nella Figura 1). Organoidi di semi in goccioline da 10 μl (per un totale di 200 μl per pozzetto) di una piastra a 6 pozzetti preriscaldata.
      NOTA: Conservare le piastre preriscaldate in un'incubatrice a 37 °C per una notte o in un forno a 60 °C per almeno 1 ora per garantire una rapida solidificazione dell'ECM, prevenendo la diffusione dell'ECM e garantendo così la corretta formazione della cupola dell'emisfero.
   6. Capovolgere la piastra e rimetterla in un'incubatrice a 37 °C per 30 minuti per consentire
   l'ECM da impostare. Dopo 30-60 minuti, aggiungere delicatamente il mezzo di espansione (temperatura ambiente) ai pozzetti.

4. Giorno 2 (intervallo: giorni 1 - 3): Erogazione degli organoidi

NOTA: A seconda dell'organoide GR, questo può verificarsi anche al giorno 1 o 3. Durante lo screening del farmaco, gli organoidi vengono mantenuti in sospensione. A tale scopo, vengono dispensati in una bassa concentrazione di ECM (5-10%) alla quale viene mantenuta la crescita degli organoidi, ma dove non si verifica alcuna solidificazione della ECM. Ciò consente l'erogazione automatizzata, l'interazione ottimale organoide-composto e la lisi cellulare riproducibile, ma limita anche l'opportunità di cambiare il mezzo.

1. Calcolare la concentrazione e la quantità di sospensione di organoidi necessaria per lo screening del farmaco.
   1. A seconda dell'erogatore di celle utilizzato, considerare il volume morto durante il calcolo.
      NOTA: Quando si erogano 40 μL di sospensione di organoidi per pozzetto, una piastra da 384 richiede un volume totale di 15,4 mL. In media, ogni provetta per l'erogazione di celle Multidrop ha un volume morto di ~1 mL, che si traduce in 8 mL di volume morto quando si utilizzano tutti gli ugelli. Ciò si traduce in un totale di 23,4 mL per ogni modello di organoide per un'intera piastra da 384 pozzetti. La preparazione di 25 mL di sospensione di organoidi garantisce quindi organoidi sufficienti per la dispensazione e per l'analisi opzionale di follow-up (polimorfismo a singolo nucleotide, SNP) (vedere 4.4.7).
2. Preparazione per la raccolta degli organoidi
   1. Per preparare il tampone di lavaggio, aggiungere l'inibitore ROCK (Y-27632) ad aDF+++ a una concentrazione finale di 10 μM. (±100 mL sono necessari per ogni coltura di organoidi che verrà sottoposta a screening).
   2. Ispezionare gli organoidi in tutti i pozzetti utilizzando un microscopio a campo chiaro per valutare il recupero degli organoidi dopo il passaggio ed escludere potenziali infezioni. Verificare se gli organoidi sono della dimensione corretta prendendo un'immagine microscopica e misurando gli organoidi utilizzando una barra di scala digitale (Tabella 1).
      NOTA: Se gli organoidi non sono della dimensione corretta (troppo grandi o troppo piccoli), andranno persi nel processo di filtraggio e potrebbe non esserci abbastanza materiale per intraprendere lo screening del farmaco. In questo caso, si consiglia di posticipare lo screening antidroga.
   3. Aggiungere 1 mg/mL di dispasi in ciascun pozzetto e incubare in un incubatore a 37 °C per 30-60 minuti (fino a un massimo di 120 minuti) per digerire l'ECM. Controllare l'andamento della dissociazione della MEC al microscopio per vedere se le gocce della MEC galleggiano. In caso contrario, pipetare il contenuto del pozzetto sulle goccioline di ECM, che dovrebbero staccarsi facilmente quando la digestione è completa.
3. Preparare gli organoidi per l'erogazione in una piastra a 384 pozzetti secondo i seguenti passaggi. Eseguire questi passaggi a temperatura ambiente (compresa la centrifugazione) per ridurre le fluttuazioni di temperatura degli organoidi.
   1. Raccogliere la sospensione di organoidi dalla piastra di coltura utilizzando una pipetta p1000.
   2. A seconda delle fasi di filtrazione richieste (a seconda del tipo di organoide, vedere la Tabella 1), seguire il passaggio corrispondente.
      NOTA: La pre-bagnatura dei filtri con tampone di lavaggio è essenziale per evitare che gli organoidi aderiscano al filtro.
      1. Eseguire il filtraggio singolo includendo tutti i piccoli frammenti e le singole cellule, ad es. per organoidi tumorali HNSCC, filtro per organoidi < 70 μm. Raccogliere gli organoidi raccolti in una provetta da 15 mL e lavarli due volte con 12 mL di tampone di lavaggio. Filtrare gli organoidi su un filtro pre-bagnato da 70 μm in una provetta da 50 mL, lavare il filtro con 3 x 4 mL di aDF+++ e trasferirli in una provetta da 15 mL. Se il volume è troppo alto, centrifugare a 85 × g per 5 minuti e trasferire il pellet in 12 mL di aDF+++ in una provetta da 15 mL; Procedere al punto 4.3.3.
      2. Eseguire un doppio filtraggio per la rimozione di detriti e organoidi di grandi dimensioni, ad es. per gli organoidi tumorali CRC, filtrare gli organoidi da >100 μm e <20 μm. Filtrare immediatamente gli organoidi raccolti su un filtro pre-bagnato da 100/70/40 μm (Tabella 1) in una provetta da 50 mL e lavare il filtro con 2 x 10 mL di tampone di lavaggio. Utilizzare un filtro pre-bagnato da 20 μm per tre pozzetti da una piastra di organoidi a 6 pozzetti. Filtrare gli organoidi da <100 μm sui filtri da 20 μm e lavare il filtro con 2 x 10 mL di tampone di lavaggio. Recuperare gli organoidi dal filtro capovolgendolo sopra una provetta pulita da 50 mL e lavando con 3 x 4 mL di aDF+++. Trasferire la sospensione di organoidi in una provetta da 15 mL; se il volume è >15 mL (poiché potrebbe essere necessario un ulteriore lavaggio del filtro), centrifugare a 85 × g per 5 minuti e trasferire il pellet in 12 mL aDF+++ in una provetta da 15 mL.
         NOTA: Gli organoidi che rimangono intrappolati nel filtro possono essere recuperati per un uso successivo (passaging); Nella fase successiva vengono utilizzati organoidi < 100 μm. Le cellule e i detriti che sono passati attraverso il filtro verranno scartati, gli organoidi catturati nel filtro (>20 μm, <100 μm) verranno utilizzati per lo screening.
   3. Centrifugare a 450 × g per 3 minuti e aspirare con cura il surnatante. Risospendere accuratamente il pellet in 1 mL di terreno di filtraggio, rabboccare con un altro terreno da 1-9 mL (a seconda delle dimensioni del pellet; mirare ad avere ~75-150 organoidi/10 μL) e risospendere pipettando su e giù con una pipetta sierologica pre-bagnata.
      NOTA: Si consiglia di aggiungere 5 μM di inibitore ROCK al terreno di screening.
   4. Miscelare accuratamente la sospensione di organoidi pipettandola su e giù con una pipetta sierologica pre-bagnata 5 volte e contare il numero di organoidi in 10 μl di sospensione pipettando una linea in una piastra di Petri e contandoli al microscopio. Per gli organoidi più piccoli (<70 μm), aggiungere 10 μl della sospensione di organoidi a un vetrino a 10 camere con una griglia emocitometrica e contare il numero di organoidi. Calcolare il numero di organoidi/mL seguendo le istruzioni del produttore.
   5. Preparare la quantità richiesta di terreno di dosaggio aggiungendo il 5% (v/v) di ECM al mezzo di screening ghiacciato (ad esempio, per 25 mL di terreno di dosaggio, aggiungere 1,25 mL di ECM a 23,75 mL di terreno di screening ghiacciato). Aggiungere l'ECM solo al mezzo ghiacciato per evitare che l'ECM si solidifichi. Quando si esaminano più modelli di organoidi, preparare il terreno di dispensazione in blocco per garantire la coerenza della % di ECM in tutti i modelli.
   6. Aggiungere il numero richiesto di organoidi (vedere la Tabella 1 per le linee guida e la discussione per le note) in una nuova provetta da 15 mL e centrifugare a 450 × g per 3 minuti. Aspirare con cura senza disturbare il pellet e risospendere accuratamente il pellet in 100 μl di mezzo di vagliatura con una pipetta p200. Assicurarsi che il pellet sia omogeneo e risospeso completamente senza grumi di organoidi. Successivamente rabboccare la sospensione con la quantità necessaria di mezzo di erogazione ghiacciato e mantenere la sospensione organoide sul ghiaccio d'ora in poi.
4. Erogare gli organoidi in piastre da 384 pozzetti utilizzando un dispenser di celle (ad es. Multidrop).
   1. Impostare l'erogatore di celle in modo che eroghi 40 μL di sospensione cellulare per pozzetto.
      1. Menu principale | Seleziona il tipo di targa | Va bene | 384 standard | OK
      2. Tipo di cassetta cassetta con tubo standard (lato destro) | selezionare il volume utilizzando le frecce su e giù (40 μL).
      3. Selezionare Piastra intera o Colonne, a seconda della disposizione della piastra.
   2. Lavare il tubo con etanolo al 70% (EtOH), seguito da soluzione salina sterile tamponata con fosfato (PBS); utilizzare >15 ml per lavaggio. Lasciare che un po' d'aria tra ogni fluido visualizzi l'inizio e la fine di ogni lavaggio. Controllare se tutte le testine di erogazione erogano "dritto" e lavare di nuovo quando ciò non è il caso.
   3. Nel menu Impostazioni , selezionare la pre-dispensazione e impostarla su 60 μl per pre-erogare la sospensione dell'organoide dopo l'adescamento e prima della dispensazione.
   4. Adescare l'erogatore con la sospensione di organoidi mantenendo la sospensione in ghiaccio. Risospendere mediante pipettaggio continuo con una pipetta p1000. Fare attenzione a evitare la generazione di bolle d'aria nella soluzione. Una volta innescata e la piastra in posizione, erogare gli organoidi premendo Start.
      NOTA: Questo passaggio è più semplice da eseguire con due persone: una persona che ririattiva e l'altra che aziona l'erogatore.
   5. Se necessario, per ogni modello di organoide incluso nella schermata, erogare almeno altri 5 pozzetti in una piastra di vagliatura aggiuntiva.
      NOTA: Ciò consentirà una lettura T=0 più tardi nel corso della giornata (vedere la sezione 7 e la discussione). Questa erogazione può essere eseguita anche manualmente, se si preferisce.
   6. Riposizionare immediatamente il coperchio sulla piastra per evitare la contaminazione dei pozzetti. Verificare al microscopio che tutti i pozzetti siano stati riempiti correttamente e che gli organoidi siano distribuiti uniformemente in tutta la piastra.
   7. Se necessario, una volta terminata la placcatura, recuperare la sospensione di organoidi dal tubo (fare clic su Svuota) e centrifugare gli organoidi rimanenti. Trasferire in una provetta da 1,5 mL e congelare a scatto per una successiva analisi SNP.
      NOTA: Se l'aria è entrata nel tubo durante l'erogazione e alcuni pozzetti non sono stati riempiti correttamente, riempire i pozzetti manualmente aggiungendo 40 μl per pozzetto.
   8. Se vengono erogati più modelli di organoidi, sciacquare il tubo con PBS, EtOH e PBS e ripetere i passaggi 4.4.4-4.4.8 per ciascun modello.
   9. Trasferire le piastre in un'atmosfera di CO₂ al 5% in un incubatore a 37 °C fino al momento della dispensazione del farmaco. Per eliminare le differenze di ricambio d'aria tra le diverse piastre, evitare di impilare le piastre nell'incubatrice.
   10. Pulire il tubo il prima possibile con PBS e poi EtOH. Assicurarsi di asciugare completamente il tubo facendo scorrere l'aria attraverso il sistema.

5. Giorno 2 (intervallo: giorni 1 - 3): Dispensazione di farmaci utilizzando un distributore di farmaci (ad es . D300e)

NOTA:. A seconda della domanda di ricerca, la stampa del farmaco può essere eseguita anche un giorno dopo la semina.

1. Configura il distributore di farmaci
   1. Avviare il software dell'erogatore e selezionare il formato di lastra desiderato utilizzato per lo schermo evidenziando Piastra 1 e selezionando lo strumento matita per visualizzare l'editor di lastre.
   2. Selezionare il tipo di piastra e impostare il volume aggiuntivo di ciascun pozzetto (volume di liquido (sospensione di organoidi) già presente nella piastra). Per il formato a 384 pozzetti, utilizzare 40 μL/pozzetto.
   3. Nella barra di sinistra, utilizzare il simbolo + per aggiungere ogni soluzione farmacologica che verrà utilizzata sullo schermo.
   4. Modifica ogni fluido selezionando lo strumento matita . Modifica il nome del farmaco, la classe del farmaco (ad esempio, a base di DMSO o acquoso (ad esempio, acqua, PBS)) e la concentrazione di stock del farmaco.
      NOTA: Non superare la concentrazione di 10 mM di ciascun farmaco. Idealmente, la concentrazione massima di solvente dovrebbe essere dello 0,8% per il DMSO e del 3% per il PBS/0,3% di detersivo (ad esempio, Tween) (vedere la normalizzazione di seguito e la discussione).
   5. Una volta che tutti i farmaci sono stati aggiunti al programma, selezionare i pozzetti per l'aggiunta dei farmaci evidenziando un pozzetto sul layout della piastra e trascinandolo. Fare clic con il pulsante destro del mouse sui pozzetti selezionati e aggiungere la concentrazione.
      1. Impostare il valore per definire la concentrazione desiderata di ciascun farmaco (μM).
      2. Per la titolazione, definire la concentrazione massima e minima desiderata di ciascun farmaco (μM), la distribuzione (logaritmica o lineare), le repliche per livello (ad esempio, 3) e il modello di titolazione.
      3. Per una titolazione mirata, definire la concentrazione massima e minima di ciascun farmaco, la distribuzione (logaritmica o lineare), la concentrazione target (μM), la regione target (livelli), l'intervallo target (log), le repliche per livello (ad es. 3) e il modello di titolazione.
   6. Normalizzare tutti i pozzetti del farmaco al solvente appropriato (ad esempio, DMSO o acquoso + Tween-20). Per i farmaci disciolti in soluzioni acquose, aggiungere Tween-20 (concentrazione finale 0,3% nello stock di farmaco) per garantire un'adeguata tensione superficiale della soluzione farmacologica per la dispensazione utilizzando il D300e (vedere 5.2.6). Seleziona tutti i pozzetti, compresi quelli senza farmaco (controlli negativi), fai clic con il pulsante destro del mouse, seleziona Normalizzazione, quindi Normalizza. Selezionare il solvente appropriato e selezionare Normalizza al volume di classe più alto per normalizzare alla massima concentrazione di farmaco selezionato.
      NOTA: i triangoli neri ora appaiono nell'angolo in basso a sinistra di ogni pozzetto per confermare la normalizzazione. Cercare di avere un minimo di 6 (idealmente >9) pozzetti di controllo negativo per ogni solvente farmacologico utilizzato.
   7. Selezionare un minimo di 3 pozzetti (idealmente >6) per utilizzare reagenti citotossici noti come la staurosporina come controlli positivi (1-5 μM) a seconda delle colture. Se la concentrazione citotossica del controllo positivo è sconosciuta, optare per un'alta concentrazione per uccidere tutti gli organoidi nei pozzetti di controllo positivo.
      NOTA: In alternativa, Navitoclax (20 μM) può essere utilizzato per garantire la morte degli organoidi durante lo screening del farmaco.
   8. Una volta completato il layout della lastra, selezionare Esegui (se la macchina è accesa) nell'angolo in alto a sinistra. Salvare il protocollo per continuare.
      NOTA: Il programma ha ora calcolato il volume richiesto di ciascun farmaco per la dispensazione. Poiché questo include l'errore di pipettaggio, questa è l'esatta quantità di farmaco necessaria per l'intero protocollo. Facoltativo: selezionando Simula si simulerà l'intero protocollo (senza l'aggiunta di farmaci) per osservare come verrà eseguito il protocollo. Sia in modalità Esecuzione che in modalità Simulazione , viene generato un report che documenta l'ora, l'ordine e i volumi di farmaci aggiunti a ciascun pozzetto. Questo può essere utile per garantire che il protocollo sia corretto e per determinare il volume e il numero esatti di cassette che saranno necessari prima di procedere con l'esperimento.
2. Preparare e stampare farmaci
   1. Aggiungere lo 0,3% (v/v) di Tween-20 alle scorte di farmaci acquose (ad es. acqua o PBS) per garantire un'adeguata tensione superficiale della soluzione farmacologica per l'erogazione con il D300e. Assicurarsi che la concentrazione di Tween-20 non superi il 3% di PBS/0,3% di Tween-20 (v/v) e mantenere la concentrazione finale di Tween-20 al di sotto dello 0,01%.
      NOTA: Aggiungere Tween-20 alle scorte di farmaci solo prima di aggiungerlo alla cassetta della stampante di farmaci, poiché l'alta concentrazione di Tween-20 nelle scorte potenzialmente inattiva i farmaci (a base di proteine) (ad esempio, i farmaci a base di anticorpi). Questo passaggio non è richiesto per i farmaci disciolti in DMSO; tuttavia, assicurarsi che la percentuale finale di DMSO in ciascun pozzo non superi lo 0,8-1%.
   2. Tieni a portata di mano sia le cassette D8+ a basso volume che D4+ ad alto volume. Selezionare Utilizzare cassette ad alto volume nel programma quando si utilizzano volumi elevati di fluido di normalizzazione.
   3. Esegui il protocollo per iniziare a erogare i farmaci.
      NOTA: Il programma eseguirà il protocollo in modo graduale e indicherà quando e quanto di ciascun composto deve essere aggiunto. Utilizzare i puntali dei filtri per la manipolazione di alte concentrazioni di farmaci. Fare attenzione a smaltire i rifiuti chimici e le punte usate seguendo le linee guida sulla biosicurezza.
   4. Una volta terminato il protocollo, utilizzare guarnizioni adesive permeabili all'aria e ai liquidi (ad esempio, guarnizioni per piastre in poliuretano per uso medico; Tabella dei materiali) per coprire le piastre e riportare le piastre a 37 °C, 5% CO₂.
      NOTA: L'uso di queste guarnizioni impedisce l'evaporazione "effetto bordo" (vedi discussione). Se non si utilizzano i sigilli, assicurarsi che i bordi esterni della piastra non vengano utilizzati nello screening antidroga. Non impilare le piastre una sopra l'altra e assicurarsi che le piastre siano mantenute verso la parte posteriore dell'incubatrice, oppure utilizzare un'incubatrice che non viene aperta (frequentemente) per evitare fluttuazioni di temperatura.
   5. Se la radioterapia è combinata con farmaci stampati, procedere al paragrafo 6. In caso contrario, lasciare le piastre nell'incubatrice per 5 giorni.
      NOTA: A seconda del tipo di organoide e del tipo di farmaco, alcuni esperimenti possono richiedere più di 5 giorni. Per gli esperimenti della durata di >7 giorni, cambiare attentamente il terreno e i composti a metà della procedura sperimentale (ad esempio, sostituendo il 50% del terreno con un terreno di screening fresco) per evitare un'estesa morte cellulare nei pozzetti di controllo negativo.

6. Giorno 2 (intervallo: giorni 2 - 4): Trattamento di organoidi mediante radiazione a fascio di fotoni

NOTA: I passaggi seguenti descrivono l'irradiazione degli organoidi. Per valutare gli effetti radiosensibilizzanti dei composti farmacologici, l'irradiazione viene eseguita 24 ore dopo che gli organoidi sono stati esposti alla chemioterapia. Lo stesso protocollo viene utilizzato per valutare gli effetti della sola irradiazione, in cui gli organoidi vengono seminati e irradiati 24 ore dopo la semina. Ciò potrebbe richiedere una certa ottimizzazione a seconda dell'ipotesi e delle colture di organoidi. Le fasi seguenti descrivono il processo utilizzato per irradiare gli organoidi utilizzando fasci di fotoni da 6 MV appositamente generati (Tabella dei materiali). Questa macchina è ottimizzata per applicazioni cliniche e quindi riflette la pratica clinica reale. Macchine diverse possono richiedere una configurazione diversa e possono anche richiedere l'ottimizzazione del dosaggio, poiché una dose efficiente può differire da quella selezionata.

1. Rimuovere le piastre dall'incubatore a 37 °C e rimettere i coperchi su ciascuna piastra sopra le guarnizioni; Non rimuovere i sigilli. Portare con sé la piastra da 0 Gy in questo processo per assicurarsi che la piastra di controllo sia stata sottoposta a condizioni identiche.
2. Trasportare gli organoidi all'irradiatore. Installare il dispositivo di irradiazione riempiendo una scatola di plastica con acqua tiepida del rubinetto e fissarlo nel portatarga per evitare che la piastra galleggi.
3. Immergere la piastra in acqua in modo che l'acqua sia a livello della superficie superiore della piastra. Fissare la piastra in posizione utilizzando un apparecchio che non permetta alla piastra di galleggiare (come mostrato nel video). Lasciare la stanza e irradiare le piastre a dosaggi crescenti (ad esempio, 1, 2, 4, 6, 8 e 10 Gy). Irradiare solo una piastra alla volta, poiché una pila di piastre non consente una dispersione uniforme delle radiazioni.
   NOTA: Assicurarsi che vengano scelte dosi di irradiazione appropriate per ottenere una curva dose-risposta.
4. Asciugare accuratamente le piastre dopo l'irradiazione con fazzoletti e riposizionare il coperchio rigido. Trasporta le piastre nella stanza delle colture. Rimuovere il coperchio rigido e pulire l'esterno di ogni piastra con fazzoletti di EtOH leggermente spruzzati. Non rimuovere le guarnizioni traspiranti.
5. Posizionare le piastre nella parte posteriore dell'incubatrice per evitare sbalzi di temperatura dovuti all'apertura della porta; Non impilare le piastre.

7. Giorno 2. Opzionale: piastra di misurazione del saggio di vitalità cellulare 3D (CTG) CellTiter-Glo T=0 (necessaria per l'analisi GR)

1. Se si desidera calcolare le metriche GR (vedere 11.3.5 e discussione), misurare i valori CTG nella piastra T=0 seguendo i passaggi 9.1-10.4.

8. Un giorno prima della lettura dello screening antidroga: preparazione

1. Calcola il volume totale di CTG richiesto. Per una piastra da 384 pozzetti, utilizzare 40 μl di CTG per pozzetto (aggiungere CTG 1:1 secondo le raccomandazioni del produttore). Prendere in considerazione il volume morto per l'erogazione multigoccia (1 mL per provetta). Scongelare CTG durante la notte a 4 °C, al riparo dalla luce.
2. Verificare se l'erogatore richiede la calibrazione.

9. Giorno 7 (intervallo: giorni 7 - 14): Lettura dello screening antidroga: Saggio CTG

1. Lasciare che il CTG raggiunga la temperatura ambiente. Ispezionare visivamente tutti i pozzetti della piastra a 384 pozzetti prima della lettura, registrare se si sono verificate infezioni.
2. Immagine dei pozzetti rilevanti al microscopio a campo chiaro. Includere controlli positivi (staurosporina), controlli negativi (pozzetti di normalizzazione) e la concentrazione più alta di ciascun farmaco.
3. Lavare e adescare la macchina multidrop secondo i passaggi descritti nella sezione 4.4. Erogare 40 μl di CTG in ciascun pozzetto, in base alla configurazione della piastra. Agitare con l'agitatore per piastre del dosatore multigoccia (Shake) per 5 minuti e incubare a temperatura ambiente, al riparo dalla luce per 25 minuti.
   NOTA: La reazione CTG è una reazione enzimatica ed è quindi influenzata dalla temperatura e dal tempo di incubazione. Il segnale è presumibilmente stabile per 30-60 minuti; tuttavia, l'utilizzo dello stesso tempo di incubazione per tutte le piastre, soprattutto nel calcolo delle metriche GR, aumenta l'accuratezza.

10. Misure di bioluminescenza CTG

1. Accendere il lettore di piastre a bioluminescenza con capacità di 384 pozzetti e il computer. In questo caso è stato utilizzato un lettore di targhe Spark.
2. Aprire il software dell'editor del metodo Spark (vedere la Tabella dei materiali). Seleziona il formato della piastra: COS384fb-Corning 384 flat black | senza coperchio | senza cassetta per l'umidità; Selezionare i pozzetti che devono essere misurati.
3. Nel menu in basso a sinistra, seleziona Rilevamento | Luminescenza e trascinare sotto la piastra. Tipo: attenuazione, secondo menu: nessuno. Impostare il tempo di integrazione [ms]: 500.
4. Posiziona la piastra, selezionala ed esegui il metodo facendo clic su Start. Salva il foglio di calcolo esportato.

11. Analisi dei dati

1. Calcola il fattore Z (Z') per valutare la qualità dello schermo.
   1. Calcola la media (Av) e le deviazioni standard (SD) dei controlli sia negativi (Ctrl^neg, ad es. DMSO) che positivi (Ctrl^pos, ad es. Staurosporina).
   2. Calcola il fattore Z = 1 - (3 × SD[Ctnl^neg] + 3 × SD[Ctrl^pos]/mean[Ctrl^neg] -mean[Ctrl^pos]).
      NOTA: Z' esprime la variazione all'interno e lo spazio raziometrico tra i controlli positivi e negativi e quindi è una misura per l'intervallo dinamico del saggio¹³. Escludere i risultati dello screening antidroga con una Z' inferiore a 0,3; si consiglia di utilizzare dati con una Z' > 0,5. La media di Z' varia generalmente tra 0,5 e 0,7 (a seconda dei modelli di organoidi utilizzati). Affinché la Z' sia informativa, tutti gli organoidi nei pozzetti di controllo positivo dovrebbero essere morti.
2. Calcola la vitalità relativa degli organoidi per ogni pozzetto impostando Ctrl^neg su 100% e Ctrl^pos su 0% di vitalità.
   1. Utilizzare questa formula per calcolare la vitalità degli organoidi.
      Vitalità dell'organoide = 100% × (valore del pozzo sperimentale - Av Ctrl^pos) / (Av Ctrl^neg - Av Ctrl^pos)
      1. Per gli organoidi irradiati, calcolare il valore percentuale.
         Percentuale di vitalità dell'organoide = 100% × (valore del pozzetto sperimentale di x GY) / (valore del pozzetto^neg Av Ctrl di 0 GY)
   2. Visualizzare i dati in un programma software di analisi dei dati copiando i dati di vitalità in una tabella xy, selezionando il numero appropriato di valori replicati per concentrazione.
   3. Per le concentrazioni logaritmiche dei farmaci, trasformare le concentrazioni dei farmaci e copiare questi valori nella prima colonna della tabella.
   4. Per formattare il grafico, selezionare il tipo di grafico (XY), selezionare l'errore standard della media (SEM) e impostare l'origine in basso a sinistra.
3. Determinare le metriche IC₅₀ relativa, area sotto la curva (AUC) e GR.
   1. Per la regressione non lineare, nella scheda Analizza selezionare Adatta una curva con regressione non lineare. Scegliere l'opzione log (inibitore) vs. risposta normalizzata - pendenza variabile per creare una curva di uccisione.
   2. Fare clic sulla scheda Risultati per visualizzare l'IC₅₀ relativo per ciascun farmaco.
      NOTA: Questa è la concentrazione di farmaco che dà una risposta a metà strada tra la parte inferiore e quella superiore della curva. La parte inferiore e quella superiore sono plateau nelle unità dell'asse y.
   3. Per l'area sotto la curva (AUC), nella scheda Analizza selezionare Area sotto la curva, usare le impostazioni predefinite e selezionare OK.
   4. Fare clic sulla scheda Risultati per visualizzare l'AUC (area totale) per ciascun farmaco.
      NOTA: L'AUC è una misurazione integrata di un effetto misurabile, che viene utilizzata come misurazione cumulativa dell'effetto di un farmaco. Con alcune molecole, come gli anticorpi, la curva dose-risposta non è di forma sigmoidale e i valori di IC₅₀ sono difficili da interpretare. In una situazione del genere, i valori di AUC possono fornire ulteriori informazioni come metrica per confrontare le differenze tra le linee di organoidi.
   5. In alternativa, se le misurazioni CTG vengono effettuate al giorno 2 (passaggi opzionali 4.4.5 e sezione 7), calcolare le metriche GR. Analizza le metriche GR utilizzando un calcolatore GR online¹⁴, tenendo conto delle differenze nel tasso di proliferazione tra i modelli di organoidi durante uno screening farmacologico per garantire misurazioni più riproducibili e sensibili.

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Risultati

Lo scopo di questo esperimento è stato quello di esaminare la sensibilità degli organoidi HNSCC alla chemioterapia e alla radioterapia come agenti singoli. Abbiamo anche testato la riproducibilità dei risultati eseguendo l'esperimento più volte con un intervallo di una settimana, ottenendo diverse repliche biologiche (esperimenti 1-3) (Figura 2). Seguendo il protocollo, il giorno 0, le PDO HNSCC sono state raccolte da 6 pozzetti di una piastra a 6 pozzet...

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Discussione

Questo articolo e il video descrivono come eseguire lo screening dei farmaci a medio rendimento utilizzando i PDO. Questo protocollo può, con ottimizzazione, essere adottato per lo screening di organoidi derivati da tipi di tessuto diversi da quelli qui descritti. Determinare il periodo di passaggio ideale prima dello screening è importante in quanto questo varia per le singole colture di organoidi e dipende dal tipo di tessuto. La densità e la dimensione degli organoidi seminati per ...

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Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
Required equipment
384-well bioluminescence platereader; e.g. Tecan Spark 10M plate reader	Tecan
Brightfield microscope with large field of view lens (2.5x)
Digital dispenser; e.g. Tecan D300e	Tecan		Drug dispensing
6 MV photon beam irradiator	Elekta model Synergy, Elekta Sweden
Liquid handler with large nozzle (“standard tube”) cassettes;
e.g. Multidrop Combi Reagent Dispenser	Thermo Scientific
Plastic container with plate holder insert for radiotherapy	Home-made
Spark control method editor software
Standard tissue culturing equipment (LAF cabinet, incubator, centrifuge, waterbath, etc)
Required materials
1.5 mL plastic tubes
15- and 50-mL plastic tubes
5, 10- and 25-mL sterile plastic pipets
6-well cell culture plates
Black 384-well ultra-low-attachment clear-bottom plate; e.g.. Corning 384 flat black	Corning	4588
Breathe-Easy sealing membrane	Merck		pre-cut polyurethane medical-grade membrane with acrylic adhesive
Glasstic slide			10-chambered slide with hemocytometer grid
Multidrop Combi Reagent Dispenser standard tube dispensing cassette	Thermo Scientific
Plugged Pasteur’s pipet of which the tip has been tightened in a flame
Reversible 20/40/70/100 µm filters: PluriStrainer	Pluriselect	e.g. 43-50020-03
Sterile P1000, P200, P20 and P2 pipet tips and low-retention filter tips ( e.g. Sapphire tips)	Greiner	750266
T8 Plus and D4 Plus casettes	HP/Tecan
Required reagents
100 x Glutamax			L-glutamine substitute
1 M HEPES
30% (v/v) Tween-20 diluted in PBS
70% EtOH
Advanced-DMEM/F12	Thermo Scientific	12634-010
CellTiter-Glo 3D cell viability assay	Promega	G9681
Compounds to test screen, including Staurosporin or other positive control
Dispase II	Sigma-Aldrich	D4693
DMSO
ECM for CRC: growth-factor reduced Matrigel, phenol-free	Corning	356231
ECM for HNSCC PDOs: BME, Cultrex RGF Basement membrane extract, Type R1	R&D Systems	3433-005-R1
Expansion growth medium (specific for each organoid type)
Organoid growth factors (specific for each organoid type)
PBS
Pen/Strep (100 U/mL)
ROCK inhibitor: Y-27632	Abmole	M1817
TrypLE
Required Software Packages:
GraphPad Prism
Microsoft Excel