Ensaio de triagem de medicamentos e radioterapia de médio rendimento usando organoides derivados de pacientes

Resumo

Descrevemos protocolos detalhados para usar organoides derivados de pacientes para exames de sensibilidade à terapia de médio rendimento. As terapias testadas incluem quimioterapia, radioterapia e quimiorradioterapia. Os níveis de trifosfato de adenosina são usados como uma leitura funcional.

Resumo

Os modelos organoides derivados do paciente (PDO) permitem a expansão e manutenção a longo prazo das células epiteliais primárias cultivadas em três dimensões e em um estado quase nativo. Quando derivados de tecido tumoral ressecado ou biopsiado, os organoides recapitulam de perto a morfologia do tumor in vivo e podem ser usados para estudar a resposta à terapia in vitro. Os biobancos de organoides tumorais refletem a grande variedade de tumores clínicos e pacientes e, portanto, são muito promissores para aplicações pré-clínicas e clínicas. Este artigo apresenta um método para triagem de medicamentos de médio rendimento usando organoides de carcinoma espinocelular de cabeça e pescoço e adenocarcinoma colorretal. Essa abordagem pode ser facilmente adotada para uso com qualquer modelo organoide derivado de tecido, normal e doente. São descritos métodos para exposição in vitro de organoides à quimioterapia e radioterapia (como modalidade de tratamento único ou em combinação). A sobrevivência celular após 5 dias de exposição ao medicamento é avaliada medindo os níveis de adenosina trifosfato (ATP). A sensibilidade ao medicamento é medida pelas métricas de concentração inibitória semimáxima (IC₅₀), área sob a curva (AUC) e taxa de crescimento (GR). Esses parâmetros podem fornecer informações sobre se uma cultura organoide é considerada sensível ou resistente a um tratamento específico.

Introdução

Modelos organoides estabelecidos a partir de células-tronco adultas e cultivados em uma matriz extracelular (ECM) tridimensional (3D) e um coquetel de fator de crescimento específico (também conhecido como HUB Organoids) estão ganhando força como plataformas de triagem oncológica pré-clínica. As culturas organoides derivadas do paciente (PDO) podem ser estabelecidas a partir de biópsias de tecido normal e doente dentro de 1-2 semanas e podem ser expandidas por um período mínimo de 1-2 meses até períodos de tempo ilimitados. A criopreservação permite o uso a longo prazo de culturas bem caracterizadas. Ao contrário dos modelos tradicionais de linha celular bidimensional que são derivados clonalmente, os modelos PDO recapitulam de perto o tecido tumoral original, tanto fenotípica quanto geneticamente, e preservam a heterogeneidade do tumor. Exames de medicamentos de médio rendimento em DOPs, testando uma ampla gama de terapias, fornecem uma plataforma única para medicina personalizada.

Estudos anteriores descreveram o uso de modelos organoides para triagem terapêutica, especificamente drogas e radioterapia, em modelos estabelecidos a partir de diferentes tipos de tumores e mostram o potencial preditivo dos organoides para orientar a tomada de decisão clínica1,2,3,4,5,6,7,8,9,10,11. Este artigo descreve os métodos de triagem de terapia oncológica usando PDOs em uma capacidade de médio rendimento (Figura 1A). Este protocolo é configurado em um formato de placa de 384 poços com semiautomação, permitindo testes de terapia para até oito modelos de organoides, 16 compostos e até oito placas de 384 poços. Além de triagens de drogas compostas, este artigo também descreve métodos para testar a sensibilidade e sensibilização à radioterapia. Além disso, é discutido o uso de robótica de alto rendimento para aumentar a triagem de drogas para automação total. É importante ressaltar que organoides de diferentes tecidos podem exigir diferentes meios e diferentes manuseios.

Aqui, é descrito um protocolo geral de ensaio de triagem de drogas, que pode precisar de adaptação dependendo do organoide de interesse. Pontos de partida e sugestões de otimização estão incluídos na discussão, bem como recomendações gerais sobre configuração experimental e prática de organoides. Exemplos são dados usando organoides de carcinoma de células escamosas de cabeça e pescoço (HNSCC), que normalmente têm uma morfologia densa, e organoides de câncer colorretal (CRC) que podem ter uma morfologia cística ou densa. Observe que os métodos de estabelecimento e cultura de expansão de organoides primários não são cobertos por este protocolo; Para técnicas básicas de organoides, o leitor deve consultar outros protocolos (por exemplo,12). Este protocolo visual fornecerá informações sobre o processo de triagem de medicamentos de médio rendimento usando modelos organoides.

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Protocolo

NOTA: Antes de usar este protocolo, certifique-se de que as diretrizes do comitê de ética em pesquisa com seres humanos da instituição sejam seguidas. A coleta de tecido e dados do paciente descritos neste protocolo foi realizada seguindo as diretrizes da EUREC e seguindo a legislação europeia, nacional e local. Todos os organoides foram derivados de pacientes que consentiram e o consentimento pode ser retirado a qualquer momento.

1. Antes da triagem

1. Confirme a identidade de modelos recém-estabelecidos (por exemplo, por histologia e/ou sequenciamento de DNA 1,2,3,4,5,6,7,8,9,10,11) para excluir a possibilidade de supercrescimento celular normal e garantir que a triagem de drogas seja realizada em culturas de organoides tumorais (veja o exemplo em Figura 2D).
2. Projete a configuração experimental da placa, fazendo uso das recomendações gerais fornecidas na seção de discussão (veja o exemplo na Figura Suplementar S1).
3. Calcule o número necessário de organoides e prepare organoides suficientes prontos para dividir no dia 0 (use a Tabela 1 como referência).
   NOTA: Dependendo do GR do tipo e modelo de organoide, são necessárias aproximadamente 1-2 placas completas de 6 poços para cada placa de triagem completa de 384 poços. Como diretriz, um poço cheio de uma placa de 6 poços contém ± 20.000 organoides císticos ou até 50.000 organoides densos / semelhantes a uvas.
4. Verifique se o dispensador de células está calibrado usando um corante repórter e calibre de acordo com o protocolo do fabricante, se necessário.

2. Preparação do reagente

1. Prepare o meio base: avançado DMEM/F12+++ (aDF+++). Adicione 5 mL de 1x substituto de L-glutamina (v / v), 1 M de ácido etanossulfônico 4-(2-hidroxietil) -1-piperazina (HEPES) e 100 U / mL de penicilina / estreptomicina a um frasco de 500 mL de DMEM / F12 avançado. Manter aDF+++ a 4 °C até 1 mês.
2. Prepare o meio de expansão organoide apropriado (ou seja, crescimento) para o tipo de organoide em uso ^9,10.
3. Prepare o meio de peneiramento, que pode ser diferente do meio de expansão, dependendo da configuração experimental. Para ajudar na recuperação após a distribuição dos organoides, adicione 5 μM de inibidor de Rho quinase (ROCK) (Y-27632) ao meio de triagem.
4. Preparar uma solução de 100 mg/ml de Dispase II em aDF+++.
   NOTA: Uma solução 100x da dispase é estável a -20 °C por 2 meses.

3. Dia 0: Preparação de organoides

NOTA: Os volumes indicados abaixo começam a partir de uma placa completa de 6 poços de organoides, equivalente a 1200 μL de organoides/ECM (200 μL de organoides/ECM por poço).

1. Inspecione organoides usando um microscópio de campo claro para possível infecção, densidade e aparência geral; Tire imagens de todos os modelos para referência antes de passar.
2. Passe os organoides e a semente de acordo com os passos a seguir. Execute estas etapas em temperatura ambiente para reduzir as flutuações de temperatura do organoide. Sempre que manusear suspensões organoides, use pontas de baixa retenção ou pipetas e plásticos pré-umedecidos para evitar a perda de organoides.
   1. Ao usar volumes maiores de ECM/organoides (>1200 μL de ECM), considere a digestão de ECM com dispase da seguinte forma para ajudar na remoção de organoides do ECM.
      NOTA: Dispase desintegra o ECM, mas não afeta os organoides.
      1. Opcional: Adicione 1 mg/mL de dispersão a cada poço e incube os organoides em uma incubadora a 37 °C por 30 minutos antes de passar como de costume.
         NOTA: Como a dispase não é inativada por componentes médios, lave-a (usando aDF+++) com pelo menos 20x o volume da dispase adicionado.
   2. Colete os organoides em três tubos de 15 mL (até 400 μL de ECM por tubo). Complete até 12 mL com aDF+++ e centrifugue por 5 min em RT a 85 × g. Se devidamente peletizado, aspire o sobrenadante. Se os organoides não tiverem sido claramente peletizados, centrifugue a uma velocidade mais alta (até 450 × g; dependendo do tipo e tamanho do organoide) por mais 5 min. Ressuspenda o pellet e repita a lavagem.
      NOTA: Uma camada semelhante a vidro acima do pellet indica a presença de ECM. Verifique se nenhum organoide está preso no ECM usando um microscópio de campo claro (um baixo número de organoides presos pode ser aceitável) e remova cuidadosamente o ECM restante com uma pipeta p1000. Se (muito) muitos organoides estiverem presentes no ECM, repita a etapa de dissociação da dispase ou lave o pellet e gire em uma velocidade mais alta (máximo de 450 × g).
   3. Para cada tubo de 15 mL, ressuspenda o pellet organoide em 1 mL de aDF+++ e dissocie cuidadosamente os organoides até que atinjam o tamanho certo. Use o método de dissociação usado para divisão regular, dependendo do tipo/morfologia (Tabela 1).
      1. No caso de organoides císticos e semelhantes a uvas, interrompê-los mecanicamente, cortando-os em pequenos fragmentos (<100 μm) pipetando para cima e para baixo com um p1000 com uma ponta p2 no topo, ou com uma pipeta de Pasteur pré-umedecida com tampo de vidro cuja ponta foi estreitada em uma chama.
         NOTA: Confirme a ruptura de organoides usando um microscópio de campo claro após pipetar para cima e para baixo a cada 5 vezes, com o objetivo de que os organoides sejam menores ou dentro da faixa de tamanho da tela (Tabela 1).
      2. Para organoides densos, adicione 1 mL de solução a 50% v / v de TrypLE em aDF +++ para ressuspender o pellet celular e incubar por um mínimo de 2 min a 37 ° C. Em seguida, agite vigorosamente o tubo para cima e para baixo e verifique em um microscópio de campo claro. Usando a mesma abordagem acima, interrompa mecanicamente os organoides com uma pipeta, verificando ao microscópio constantemente durante todo o processo. Para organoides HNSCC, incubar em solução 100% de TrypLE por 5 min.
         NOTA: Dependendo do tipo de cultura, procure terminar com pequenos grupos de células (por exemplo, organoides CRC, >20 μm) ou células únicas (por exemplo, organoides HNSCC). Certifique-se de que a incubação proteolítica não exceda 15 min, pois isso pode afetar a viabilidade do organoide.
   4. Lave os organoides com 10 mL de aDF+++. Gire os organoides a 85 × g por 5 min; aspirar o sobrenadante se estiver devidamente peletizado. Alternativamente, se os organoides forem difíceis de granular, centrifugue até 450 × g por 5 min.
   5. Organoides de sementes em alta densidade em meio de expansão de 50% / ECM de 50% (permitindo fácil remoção do ECM na seção 4). Procure aproximadamente o dobro da densidade em comparação com uma divisão regular, geralmente resultando em uma divisão de 1:1 (veja exemplos na Figura 1). Organoides de sementes em gotículas de 10 μL (um total de 200 μL por poço) de uma placa pré-aquecida de 6 poços.
      NOTA: Mantenha as placas pré-aquecidas em uma incubadora a 37 ° C durante a noite ou em um forno a 60 ° C por pelo menos 1 h para garantir a solidificação rápida do ECM, evitando a propagação do ECM e, assim, garantindo a formação adequada da cúpula do hemisfério.
   6. Inverter a placa e colocá-la numa incubadora a 37 °C durante 30 minutos para permitir
   o ECM a ser definido. Após 30-60 min, adicione suavemente o meio de expansão (temperatura ambiente) aos poços.

4. Dia 2 (intervalo: dias 1 - 3): Distribuição de organoides

NOTA: Dependendo do organoide GR, isso também pode ocorrer no dia 1 ou 3. Durante toda a triagem de drogas, os organoides são mantidos em suspensão. Para isso, eles são dispensados em uma baixa concentração de ECM (5-10%) na qual o crescimento do organoide é mantido, mas onde não ocorre solidificação da ECM. Isso permite dispensação automatizada, interação organoide-composto ideal e lise celular reprodutível, mas também limita a oportunidade de mudar o meio.

1. Calcule a concentração e a quantidade de suspensão organoide necessária para a triagem de drogas.
   1. Dependendo do dispensador de células que está sendo usado, considere o volume morto durante o cálculo.
      NOTA: Ao dispensar 40 μL de suspensão organoide por poço, uma placa de 384 requer um volume total de 15,4 mL. Em média, cada tubo dispensador de célula Multidrop tem um volume morto de ~1 mL, resultando em 8 mL de volume morto ao usar todos os bicos. Isso resulta em um total de 23,4 mL para cada modelo de organoide para uma placa inteira de 384 poços. A preparação de 25 mL de suspensão organoide, portanto, garante organoides suficientes para dispensação, além de análise opcional de acompanhamento (polimorfismo de nucleotídeo único, SNP) (ver 4.4.7).
2. Preparação para coleta de organoides
   1. Para preparar o tampão de lavagem, adicione o inibidor de ROCK (Y-27632) a aDF+++ até uma concentração final de 10 μM. (±100 mL são necessários para cada cultura organoide que será rastreada).
   2. Inspecione os organoides em todos os poços usando um microscópio de campo claro para avaliar a recuperação de organoides após a passagem e excluir possíveis infecções. Verifique se os organoides são do tamanho correto tirando uma imagem microscópica e medindo os organoides usando uma barra de escala digital (Tabela 1).
      NOTA: Se os organoides não forem do tamanho correto (muito grandes ou muito pequenos), eles serão perdidos no processo de filtragem e pode não haver material suficiente para realizar a triagem de drogas. Se for esse o caso, é aconselhável adiar a triagem de drogas.
   3. Adicione 1 mg / mL de dispase a cada poço e incube em uma incubadora a 37 ° C por 30-60 min (até 120 min no máximo) para digerir a ECM. Verifique o progresso da dissociação da MEC ao microscópio para ver se as gotas da MEC estão flutuando. Caso contrário, pipete o conteúdo do poço sobre as gotículas de ECM, que devem sair com facilidade quando a digestão estiver completa.
3. Prepare os organoides para dispensar em uma placa de 384 poços de acordo com as etapas a seguir. Execute essas etapas em temperatura ambiente (incluindo centrifugação) para reduzir as flutuações de temperatura do organoide.
   1. Recolher a suspensão organoide da placa de cultura utilizando uma pipeta p1000.
   2. Dependendo das etapas de filtro necessárias (dependendo do tipo de organoide, consulte a Tabela 1), siga a etapa correspondente.
      NOTA: A pré-umedecimento dos filtros com tampão de lavagem é essencial para evitar que os organoides adiram ao filtro.
      1. Realize a filtragem única ao incluir todos os pequenos fragmentos e células individuais, por exemplo, para organoides tumorais de CECP, filtre para organoides < 70 μm. Colete os organoides colhidos em um tubo de 15 mL e lave-os duas vezes com 12 mL de tampão de lavagem. Filtrar os organoides sobre um filtro pré-humedecido de 70 μm para um tubo de 50 ml, lavar o filtro com 3 x 4 ml de aDF+++ e transferi-los para um tubo de 15 ml. Se o volume for muito alto, gire a 85 × g por 5 min e transfira o pellet em 12 mL de aDF+++ para um tubo de 15 mL; Prossiga para 4.3.3.
      2. Realize a filtragem dupla para remover detritos e organoides grandes, por exemplo, para organoides tumorais de CRC, filtre organoides de >100 μm e <20 μm. Filtre imediatamente os organoides colhidos sobre um filtro pré-umedecido de 100/70/40 μm (Tabela 1) em um tubo de 50 mL e lave o filtro com 2 x 10 mL de tampão de lavagem. Use um filtro pré-umedecido de 20 μm por três poços de uma placa de organoides de 6 poços. Filtre os organoides de <100 μm sobre os filtros de 20 μm e lave o filtro com 2 x 10 mL de tampão de lavagem. Recupere os organoides do filtro invertendo-o em cima de um tubo limpo de 50 mL e lavando com 3 x 4 mL de aDF+++. Transferir a suspensão organoide para um tubo de 15 ml; se o volume for >15 mL (pois pode ser necessária mais lavagem do filtro), gire a 85 × g por 5 min e transfira o pellet em 12 mL aDF+++ para um tubo de 15 mL.
         NOTA: Os organoides que ficam presos no filtro podem ser recuperados para uso posterior (passagem); Organoides < 100 μm são usados na próxima etapa. As células e detritos que passaram pelo filtro serão descartados, organoides presos no filtro (>20 μm, <100 μm) são usados para triagem.
   3. Centrifugue a 450 × g por 3 min e aspire cuidadosamente o sobrenadante. Ressuspenda o pellet cuidadosamente em 1 mL de meio de triagem, complete com outro meio de 1-9 mL (dependendo do tamanho do pellet; procure ter ~ 75-150 organoides / 10 μL) e ressuspenda pipetando para cima e para baixo com uma pipeta sorológica pré-umedecida.
      NOTA: Recomenda-se adicionar 5 μM de inibidor de ROCK ao meio de triagem.
   4. Misture bem a suspensão organoide pipetando para cima e para baixo com uma pipeta sorológica pré-umedecida 5x e conte o número de organoides em 10 μL da suspensão pipetando uma linha em uma placa de Petri e contando-os ao microscópio. Para organoides menores (<70 μm), adicione 10 μL da suspensão organoide a uma lâmina de 10 câmaras com uma grade de hemocitômetro e conte o número de organoides. Calcule o número de organoides/mL seguindo as instruções do fabricante.
   5. Prepare a quantidade necessária de meio dispensador adicionando 5% (v/v) de ECM ao meio de triagem gelado (por exemplo, para 25 mL de meio dispensador, adicione 1.25 mL de ECM a 23.75 mL de meio de peneiramento gelado). Adicione o ECM apenas ao meio gelado para evitar que o ECM se solidifique. Ao selecionar vários modelos de organoides, prepare o meio de distribuição a granel para garantir a consistência da % de ECM em todos os modelos.
   6. Adicione o número necessário de organoides (consulte a Tabela 1 para diretrizes e discussão para notas) a um novo tubo de 15 mL e centrifugue a 450 × g por 3 min. Aspirar cuidadosamente sem perturbar o pellet e ressuspender completamente o pellet em 100 μL de meio de triagem com uma pipeta p200. Certifique-se de que o pellet seja homogêneo e ressuspenso completamente sem aglomerados de organoides. Em seguida, complete a suspensão com a quantidade necessária de meio dispensador gelado e mantenha a suspensão organoide no gelo a partir de agora.
4. Dispense os organoides em placas de 384 poços usando um dispensador de células (por exemplo, Multidrop).
   1. Configure o dispensador de células para dispensar 40 μL de suspensão de células por poço.
      1. Menu principal | selecione o tipo de placa | ESTÁ BEM | Padrão 384 | OKEY
      2. tipo de tubo padrão (lado direito) | selecione o volume usando as setas para cima e para baixo (40 μL).
      3. Selecione Placa completa ou Colunas, dependendo do layout da placa.
   2. Lave a tubulação com etanol a 70% (EtOH), seguido de solução salina tamponada com fosfato estéril (PBS); use >15 mL por lavagem. Deixe um pouco de ar entre cada fluido para visualizar o início e o fim de cada lavagem. Verifique se todas as cabeças de distribuição estão dispensando 'retas' e lave novamente quando não for o caso.
   3. No menu Configurações , selecione pré-dispensar e defina para 60 μL para pré-dispensar a suspensão organoide após o primer e antes da dispensação.
   4. Prepare o dispensador com a suspensão organoide, mantendo a suspensão no gelo. Ressuspenda pipetando continuamente com uma pipeta p1000. Tenha cuidado para evitar a geração de bolhas de ar na solução. Uma vez preparada e a placa estiver na posição, dispense os organoides pressionando Iniciar.
      NOTA: Esta etapa é mais fácil com duas pessoas: uma pessoa ressuspendendo e a outra operando o dispensador.
   5. Se necessário, para cada modelo de organoide incluído na tela, dispense pelo menos mais 5 poços em uma placa de triagem extra.
      NOTA: Isso permitirá uma leitura T = 0 mais tarde neste dia (consulte a seção 7 e a discussão). Esta dispensação também pode ser feita manualmente, se preferir.
   6. Recoloque a tampa da placa imediatamente para evitar a contaminação dos poços. Confirme ao microscópio se todos os poços foram preenchidos corretamente e se os organoides estão igualmente distribuídos por toda a placa.
   7. Se necessário, uma vez terminado o revestimento, recupere a suspensão organoide da tubulação (clique em Esvaziar) e gire os organoides restantes para baixo. Transfira para um tubo de 1,5 mL e congele para posterior análise de SNP.
      NOTA: Se o ar entrou na tubulação durante a distribuição e alguns poços não foram preenchidos corretamente, encha os poços manualmente adicionando 40 μL por poço.
   8. Se vários modelos de organoides forem dispensados, enxágue a tubulação com PBS, EtOH e PBS e repita as etapas 4.4.4-4.4.8 para cada modelo.
   9. Transfira as placas para uma atmosfera de CO₂ a 5% em uma incubadora a 37 ° C até que estejam prontas para a distribuição do medicamento. Para eliminar as diferenças na troca de ar entre as diferentes placas, evite empilhar as placas na incubadora.
   10. Limpe a tubulação o mais rápido possível com PBS e depois EtOH. Certifique-se de secar completamente a tubulação passando ar pelo sistema.

5. Dia 2 (intervalo: dias 1 a 3): Dispensação de medicamentos usando um dispensador de medicamentos (por exemplo , D300e)

NOTA:. Dependendo da questão da pesquisa, a impressão do medicamento também pode ser feita um dia após a semeadura.

1. Configurar o dispensador de medicamentos
   1. Inicie o software dispensador e selecione o formato de placa desejado usado para a tela, destacando a Placa 1 e selecionando a ferramenta de lápis para abrir o editor de placas.
   2. Selecione o tipo de placa e defina o volume adicional de cada poço (volume de líquido (suspensão organoide) já na placa). Para o formato de 384 poços, use 40 μL/poço.
   3. Na barra esquerda, use o símbolo + para adicionar cada solução de medicamento que será usada na tela.
   4. Edite cada fluido selecionando a ferramenta lápis . Edite o nome do medicamento, a classe do medicamento (por exemplo, à base de DMSO ou aquoso (por exemplo, água, PBS)) e a concentração de estoque do medicamento.
      NOTA: Não exceda a concentração de estoque de 10 mM de cada medicamento. Idealmente, a concentração máxima de solvente deve ser de 0,8% para DMSO e 3% para PBS/0,3% de detergente (por exemplo, Tween) (consulte a normalização abaixo e a discussão).
   5. Depois que todos os medicamentos forem adicionados ao programa, selecione os poços para adição dos medicamentos, destacando um poço no layout da placa e arrastando-o. Clique com o botão direito do mouse nos poços selecionados e adicione a concentração.
      1. Defina o valor para definir a concentração desejada de cada medicamento (μM).
      2. Para titulação, defina a concentração mais alta e mais baixa desejada de cada medicamento (μM), a distribuição (logarítmica ou linear), as réplicas por nível (por exemplo, 3) e o padrão de titulação.
      3. Para titulação direcionada, defina a concentração mais alta e mais baixa de cada medicamento, a distribuição (logarítmica ou linear), concentração alvo (μM), região alvo (níveis), intervalo alvo (log), réplicas por nível (por exemplo, 3) e o padrão de titulação.
   6. Normalize todos os poços de medicamentos para o solvente apropriado (por exemplo, DMSO ou aquoso + Tween-20). Para medicamentos dissolvidos em soluções aquosas, adicione Tween-20 (concentração final de 0,3% no estoque de medicamentos) para garantir a tensão superficial apropriada da solução do medicamento para dispensação usando o D300e (ver 5.2.6). Selecione todos os poços, incluindo aqueles sem medicamento (controles negativos), clique com o botão direito do mouse, selecione Normalização e, em seguida, Normalizar. Selecione o solvente apropriado e selecione Normalizar para o volume de classe mais alto para normalizar para a concentração mais alta do medicamento selecionado.
      NOTA: Triângulos pretos agora aparecem no canto inferior esquerdo de cada poço para confirmar a normalização. Procure ter um mínimo de 6 (idealmente >9) poços de controle negativo para cada solvente de medicamento usado.
   7. Selecione um mínimo de 3 alvéolos (idealmente >6) para usar reagentes citotóxicos conhecidos, como estaurosporina, como controles positivos (1-5 μM), dependendo das culturas. Se a concentração citotóxica do controle positivo for desconhecida, opte por uma concentração alta para matar todos os organoides nos poços de controle positivo.
      NOTA: Alternativamente, Navitoclax (20 μM) pode ser usado para garantir a morte do organoide durante a triagem do medicamento.
   8. Quando o layout da placa estiver concluído, selecione Executar (se a máquina estiver ligada) no canto superior esquerdo. Salve o protocolo para continuar.
      NOTA: O programa agora calculou o volume necessário de cada medicamento para dispensação. Como isso inclui erro de pipetagem, essa é a quantidade exata de medicamento necessária para todo o protocolo. Opcional: Selecionar Simular simulará todo o protocolo (sem adicionar medicamentos) para observar como o protocolo será executado. Nos modos Executar e Simulação , é gerado um relatório que documentará o tempo, a ordem e os volumes de medicamentos adicionados a cada poço. Isso pode ser útil para garantir que o protocolo esteja correto e para determinar o volume e o número exatos de que serão necessários antes de prosseguir com o experimento.
2. Preparar e imprimir medicamentos
   1. Adicione 0,3% (v/v) de Tween-20 aos estoques aquosos (por exemplo, água ou PBS) para garantir a tensão superficial apropriada da solução do medicamento para dispensação usando o D300e. Certifique-se de que a concentração de Tween-20 não exceda 3% de PBS/0.3% de Tween-20 (v/v) e mantenha a concentração final de Tween-20 abaixo de 0.01%.
      NOTA: Adicione apenas Tween-20 aos estoques de medicamentos antes de adicioná-lo ao da impressora de medicamentos, pois a alta concentração de Tween-20 no estoque potencialmente inativa medicamentos (à base de proteínas) (por exemplo, medicamentos à base de anticorpos). Esta etapa não é necessária para medicamentos dissolvidos em DMSO; no entanto, certifique-se de que a porcentagem final de DMSO em cada poço não exceda 0,8-1%.
   2. Tenha os D8+ de baixo volume e D4+ de alto volume prontos. Marque Usar de alto volume no programa ao usar grandes volumes de fluido de normalização.
   3. Execute o protocolo para começar a dispensar os medicamentos.
      NOTA: O programa executará o protocolo passo a passo e indicará quando e quanto de cada composto precisa ser adicionado. Use pontas de filtro para lidar com altas concentrações de drogas. Tenha cuidado ao descartar resíduos químicos e pontas usadas seguindo as diretrizes de biossegurança.
   4. Uma vez concluído o protocolo, use vedações adesivas permeáveis a ar e líquido (por exemplo, vedações de placa de poliuretano de grau médico; Tabela de Materiais) para cobrir as placas e retorná-las a 37 °C, 5% CO₂.
      NOTA: O uso dessas vedações evita a evaporação do "efeito de borda" (consulte a discussão). Se não estiver usando as vedações, certifique-se de que as bordas externas da placa não sejam usadas na triagem de drogas. Não empilhe as placas umas sobre as outras e certifique-se de que as placas sejam mantidas na parte de trás da incubadora, ou use uma incubadora que não seja aberta (com frequência) para evitar flutuações de temperatura.
   5. Se a radioterapia for combinada com medicamentos impressos, prossiga para a seção 6. Caso contrário, deixe as placas na incubadora por 5 dias.
      NOTA: Dependendo do tipo de organoide e do tipo de medicamento, alguns experimentos podem levar mais de 5 dias. Para experimentos com duração de >7 dias, mude cuidadosamente o meio e os compostos na metade do procedimento experimental (por exemplo, substituindo 50% do meio por meio de triagem fresco) para evitar a morte celular extensa nos poços de controle negativo.

6. Dia 2 (intervalo: dias 2 - 4): Tratamento de organoides usando radiação de feixe de fótons

NOTA: As etapas a seguir descrevem a irradiação de organoides. Para avaliar os efeitos radiossensibilizadores dos compostos medicamentosos, a irradiação é feita 24 horas após os organoides serem expostos à quimioterapia. O mesmo protocolo é usado para avaliar os efeitos da irradiação isoladamente, em que os organoides são semeados e irradiados 24 h após a semeadura. Isso pode exigir alguma otimização, dependendo da hipótese e das culturas organoides. As etapas a seguir descrevem o processo usado para irradiar organoides usando feixes de fótons de 6 MV gerados especificamente (Tabela de Materiais). Esta máquina é otimizada para aplicações clínicas e, portanto, reflete a prática clínica real. Máquinas diferentes podem exigir uma configuração diferente e também podem exigir otimização da dosagem, pois a dose eficiente pode diferir daquela selecionada.

1. Remova as placas da incubadora a 37 ° C e retorne as tampas para cada placa em cima das vedações; Não remova as vedações. Leve a placa de 0 Gy neste processo para garantir que a placa de controle foi submetida a condições idênticas.
2. Transporte os organoides para o irradiador. Configure o dispositivo de irradiação enchendo uma caixa de plástico com água morna da torneira e fixe no suporte da placa para evitar que a placa flutue.
3. Mergulhe a placa em água para que a água fique nivelada com a superfície superior da placa. Fixe a placa na posição usando um aparelho que não permita que a placa flutue (como mostrado no vídeo). Saia da sala e irradie as placas em dosagens crescentes (por exemplo, 1, 2, 4, 6, 8 e 10 Gy). Irradie apenas uma placa de cada vez, pois uma pilha de placas não permite uma dispersão uniforme da radiação.
   NOTA: Certifique-se de que as doses de irradiação apropriadas sejam escolhidas para atingir uma curva dose-resposta.
4. Seque bem as placas após a irradiação com lenços de papel e recoloque a tampa rígida. Transporte as placas de volta para a sala de cultura. Remova a tampa rígida e limpe o exterior de cada placa com lenços de EtOH levemente pulverizados. Não remova as vedações respiráveis.
5. Coloque as placas na parte de trás da incubadora para evitar oscilações de temperatura devido à abertura da porta; Não empilhe as placas.

7. Dia 2. Opcional: Placa de medição CellTiter-Glo 3D Cell Viability Assay (CTG) T=0 (necessária para análise de RG)

1. Se pretende calcular as métricas de GR (consulte 11.3.5 e discussão), meça os valores de CTG na placa T = 0 seguindo as etapas 9.1-10.4.

8. Um dia antes da leitura da triagem de drogas: preparação

1. Calcule o volume total de CTG necessário. Para uma placa de 384 poços, use 40 μL de CTG por poço (adicione CTG 1:1 de acordo com a recomendação do fabricante). Leve em consideração o volume morto para dispensação multidrop (1 mL por tubo). Descongele o CTG durante a noite a 4 °C, protegido da luz.
2. Teste se o dispensador requer calibração.

9. Dia 7 (intervalo: dias 7 a 14): Leitura de triagem de drogas: Ensaio CTG

1. Deixe o CTG atingir a temperatura ambiente. Inspecione visualmente todos os poços da placa de 384 poços antes da leitura, registre se ocorreu alguma infecção.
2. Visualize os poços relevantes sob um microscópio de campo claro. Inclua controles positivos (estaurosporina), controles negativos (poços de normalização) e a maior concentração de cada medicamento.
3. Lave e prepare a máquina multidrop de acordo com as etapas descritas na seção 4.4. Dispense 40 μL de CTG para cada poço, de acordo com a configuração da placa. Agite usando o agitador de placas do dispensador multigotas (Shake) por 5 min e incube em temperatura ambiente, protegido da luz por 25 min.
   NOTA: A reação CTG é uma reação enzimática e, portanto, é afetada pela temperatura e pelo tempo de incubação. O sinal é supostamente estável por 30-60 min; no entanto, usar o mesmo tempo de incubação para todas as placas, especialmente ao calcular as métricas de GR, aumenta a precisão.

10. Medições de bioluminescência CTG

1. Ligue o leitor de placas de bioluminescência com capacidade de 384 poços e o computador. Aqui, um leitor de placas Spark foi usado.
2. Abra o software editor de método Spark (consulte a Tabela de Materiais). Selecione o formato da placa: COS384fb-Corning 384 preto fosco | sem tampa | sem de umidade; Selecione os poços que precisam ser medidos.
3. No menu inferior esquerdo, selecione Detecção | Luminescência e arraste por baixo da placa. Tipo: atenuação, segundo menu: nenhum. Defina o tempo de integração [ms]: 500.
4. Coloque a placa, selecione-a e execute o método clicando em Iniciar. Salve a planilha exportada.

11. Análise dos dados

1. Calcule o fator Z (Z') para avaliar a qualidade da tela.
   1. Calcule a média (Av) e os desvios padrão (DPs) dos controles negativos (Ctrl^neg, por exemplo, DMSO) e positivos (Ctrl^pos, por exemplo, Staurosporine).
   2. Calcule o fator Z = 1 - (3 × DP[Ctnl^neg] + 3 × SD[Ctrl^pos]/mean[Ctrl^neg] -mean[Ctrl^pos]).
      NOTA: Z' expressa a variação dentro e o espaço raciométrico entre os controles positivo e negativo e, portanto, é uma medida para a faixa dinâmica do ensaio¹³. Excluir resultados de triagem de drogas com um Z' menor que 0,3; recomenda-se o uso de dados com um Z' > 0,5. O Z' médio geralmente varia entre 0,5 e 0,7 (dependendo dos modelos organoides usados). Para que o Z' seja informativo, todos os organoides nos poços de controle positivo devem ter morrido.
2. Calcule a viabilidade organoide relativa para cada poço definindo Ctrl^neg como 100% e Ctrl^pos como 0% de viabilidade.
   1. Use esta fórmula para calcular a viabilidade do organoide.
      Viabilidade organoide = 100% × (valor do poço experimental - Av Ctrl^pos) / (Av Ctrl^neg - Av Ctrl^pos)
      1. Para organoides irradiados, calcule o valor percentual.
         Porcentagem de viabilidade organoide = 100% × (valor do poço experimental de x GY) / (Av Ctrl^neg valor do poço de 0 GY)
   2. Visualize os dados em um programa de software de análise de dados copiando os dados de viabilidade em uma tabela xy, selecionando o número apropriado de valores replicados por concentração.
   3. Para concentrações logarítmicas de drogas, transforme as concentrações de drogas e copie esses valores para a primeira coluna da tabela.
   4. Para formatar o gráfico, selecione o tipo de gráfico (XY), selecione o erro padrão da média (SEM) e defina a origem no canto inferior esquerdo.
3. Determine as métricas relativas de IC₅₀, área sob a curva (AUC) e GR.
   1. Para regressão não linear, na guia Analisar , selecione ajustar uma curva com regressão não linear. Escolha a opção log (inibidor) vs. resposta normalizada - inclinação variável para criar uma curva de eliminação.
   2. Clique na guia Resultados para exibir o IC₅₀ relativo para cada medicamento.
      NOTA: Esta é a concentração de droga que dá uma resposta a meio caminho entre a parte inferior e superior da curva. A parte inferior e superior são platôs nas unidades do eixo y.
   3. Para área sob a curva (AUC), na guia Analisar , selecione Área sob a curva, use as configurações predefinidas e selecione OK.
   4. Clique na guia Resultados para exibir a AUC (área total) de cada medicamento.
      NOTA: A AUC é uma medida integrada de um efeito mensurável, que é usada como a medição cumulativa de um efeito de medicamento. Com algumas moléculas, como anticorpos, a curva dose-resposta não é de forma sigmoidal e os valores de IC₅₀ são difíceis de interpretar. Em tal situação, os valores de AUC podem fornecer mais informações como uma métrica para comparar as diferenças entre as linhas organoides.
   5. Alternativamente, se as medições CTG forem feitas no dia 2 (etapas opcionais 4.4.5 e seção 7), calcule as métricas de GR. Analise as métricas de GR usando uma calculadora de GR on-line¹⁴, levando em consideração as diferenças na taxa de proliferação entre os modelos organoides em uma triagem de drogas para garantir medições mais reprodutíveis e sensíveis.

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Resultados

O objetivo deste experimento foi examinar a sensibilidade dos organoides do CECP à quimioterapia e radioterapia como agentes únicos. Também testamos a reprodutibilidade dos resultados executando o experimento várias vezes com intervalo de uma semana, resultando em várias réplicas biológicas (experimentos 1-3) (Figura 2). Seguindo o protocolo, no dia 0, as PDOs do HNSCC foram colhidas de 6 poços de uma placa de 6 poços e cortadas enzimaticamente e me...

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Discussão

Este artigo e vídeo descrevem como realizar a triagem de medicamentos de médio rendimento usando PDOs. Este protocolo pode, com otimização, ser adotado para rastrear organoides derivados de diferentes tipos de tecidos dos descritos aqui. Determinar o período de tempo de passagem ideal antes da triagem é importante, pois isso varia para culturas organoides individuais e depende do tipo de tecido. A densidade e o tamanho dos organoides semeados por poço são um fator importante a se...

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Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
Required equipment
384-well bioluminescence platereader; e.g. Tecan Spark 10M plate reader	Tecan
Brightfield microscope with large field of view lens (2.5x)
Digital dispenser; e.g. Tecan D300e	Tecan		Drug dispensing
6 MV photon beam irradiator	Elekta model Synergy, Elekta Sweden
Liquid handler with large nozzle (“standard tube”) cassettes;
e.g. Multidrop Combi Reagent Dispenser	Thermo Scientific
Plastic container with plate holder insert for radiotherapy	Home-made
Spark control method editor software
Standard tissue culturing equipment (LAF cabinet, incubator, centrifuge, waterbath, etc)
Required materials
1.5 mL plastic tubes
15- and 50-mL plastic tubes
5, 10- and 25-mL sterile plastic pipets
6-well cell culture plates
Black 384-well ultra-low-attachment clear-bottom plate; e.g.. Corning 384 flat black	Corning	4588
Breathe-Easy sealing membrane	Merck		pre-cut polyurethane medical-grade membrane with acrylic adhesive
Glasstic slide			10-chambered slide with hemocytometer grid
Multidrop Combi Reagent Dispenser standard tube dispensing cassette	Thermo Scientific
Plugged Pasteur’s pipet of which the tip has been tightened in a flame
Reversible 20/40/70/100 µm filters: PluriStrainer	Pluriselect	e.g. 43-50020-03
Sterile P1000, P200, P20 and P2 pipet tips and low-retention filter tips ( e.g. Sapphire tips)	Greiner	750266
T8 Plus and D4 Plus casettes	HP/Tecan
Required reagents
100 x Glutamax			L-glutamine substitute
1 M HEPES
30% (v/v) Tween-20 diluted in PBS
70% EtOH
Advanced-DMEM/F12	Thermo Scientific	12634-010
CellTiter-Glo 3D cell viability assay	Promega	G9681
Compounds to test screen, including Staurosporin or other positive control
Dispase II	Sigma-Aldrich	D4693
DMSO
ECM for CRC: growth-factor reduced Matrigel, phenol-free	Corning	356231
ECM for HNSCC PDOs: BME, Cultrex RGF Basement membrane extract, Type R1	R&D Systems	3433-005-R1
Expansion growth medium (specific for each organoid type)
Organoid growth factors (specific for each organoid type)
PBS
Pen/Strep (100 U/mL)
ROCK inhibitor: Y-27632	Abmole	M1817
TrypLE
Required Software Packages:
GraphPad Prism
Microsoft Excel