JoVE Logo
Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • النتائج
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

وقد تم تقديم بروتوكول لتصوير microtubules الحيوية في الجسم الحي باستخدام البروتين ملزمة نهاية المسمى fluorescently. وصفنا أساليب لتسمية, صورة, وتحليل microtubules الحيوية في الخلايا العصبية الميكروتبول الجانبي الخلفي (PLM) من C. elegans.

Abstract

في الخلايا العصبية، كان التوجه microtubule مقيم رئيسي لتحديد المحاور التي لديها زائد نهاية من microtubules و dendrites التي لديها عموما اتجاه مختلط. هنا نحن وصف أساليب لتسمية, صورة, وتحليل ديناميات microtubule والنمو أثناء تطوير وتجديد الخلايا العصبية التي تعمل باللمس في C. elegans. باستخدام المراسلين الفلورسنت المشفرة وراثيا من نصائح microtubule، ونحن صورت microtubules أكسنال. يمكن قياس التغيرات المحلية في سلوك microtubule الذي يبدأ تجديد المحور بعد استئصال الاكستوم باستخدام هذا البروتوكول. هذا المقايسة قابلة للتكيف مع الخلايا العصبية والخلفيات الوراثية الأخرى للتحقيق في تنظيم ديناميات microtubule في مختلف العمليات الخلوية.

Introduction

الخلايا العصبية لديها بنية متقنة مع مقصورات متخصصة مثل التشعبات، والهيئات الخلية، محاور عصبية، ونقاط الاشتباك العصبي. هيكل الخلايا العصبية الخلوية تتكون من microtubules، microfilaments، و neurofilaments وتنظيمها متميزة تدعم مقصورات الخلايا العصبية هيكليا ووظيفيا1،2،3،4،5،6،7،8،9،10 . على مر السنين، تم تحديد منظمة microtubule كمحدد رئيسي للقطب العصبية وظيفة. كما الخلايا العصبية الخضوع لإعادة عرض الهيكلية أثناء التنمية أو التجديد, ديناميات microtubule والتوجه تحديد الهوية, استقطاب النقل, نمو, وتطوير مختلف مقصورات الخلايا العصبية7. ولذلك، فمن الضروري لتقييم ديناميات microtubule والتوجه في الجسم الحي لربط مع عملية إعادة عرض الخلايا العصبية.

وتتكون microtubules من protofilaments من α β توبولين heterodimers مع نهايات زائد ديناميكية ومستقرة نسبيا ناقص ينتهي11،12. وقد مكن اكتشاف مجمع تلميح زائد والبروتينات المرتبطة ملزمة نهاية منصة لتقييم منظمة microtubule13. نهاية ملزمة البروتينات (EBP) ترتبط عابر مع نهايات زائد المتزايد من microtubule وديناميات ارتباطها لنمو protofilaments microtubule14،15. بسبب الارتباط المتكرر والتفكك من مجمع تلميح زائد مع microtubule، وظيفة انتشار نقطة من EBP GFP الموسومة يظهر على أنه "المذنب" في فيلم الفاصل الزمني15،16. منذ الملاحظة الرائدة في الخلايا العصبية الثديية16، تم استخدام بروتينات الربط النهائي الموسومة بالبروتينات الفلورية لتحديد ديناميات microtubule عبر أنظمة نموذجية مختلفة وأنواع الخلايا العصبية17و18و19و20و21و22و23.

نظرا لنظامه العصبي البسيط وجسمه الشفاف ، أثبت C. elegans أنه نظام نموذجي ممتاز لدراسة إعادة عرض الخلايا العصبية أثناء التطوير والتجديد في الجسم الحي. هنا نحن وصف أساليب لتسمية, صورة, وتحليل ديناميات microtubule والنمو أثناء تطوير وتجديد الخلايا العصبية التي تعمل باللمس في C. elegans. باستخدام ترميز وراثيا EBP-2::GFP, صورنا microtubules في الخلايا العصبية PLM, مما سمح لنا لتحديد قطبية microtubules في اثنين من neurites مختلفة من هذه الخلايا العصبية24. تسمح هذه الطريقة بمراقبة المذنبات EBP وتحديد كميتها كمقياس لديناميكيات microtubule في سياقات خلوية مختلفة ، على سبيل المثال ، يمكن تقييم التغيرات المحلية في سلوك microtubule الذي يبدأ تجديد المحور بعد استئصال الاكستوم باستخدام بروتوكولنا. يمكن تكييف هذا المقايسة للتحقيق في تنظيم ديناميات microtubule في مختلف العمليات الخلوية في أنواع الخلايا المتنوعة والخلفيات الوراثية.

Protocol

1. مراسل سلالة: الثقافة والصيانة

ملاحظة: لقياس ديناميات microtubule والتوجه في الخلايا العصبية PLM, استخدمنا سلالة دودة التعبير EBP-2::GFP تحت لمسة الخلايا العصبية محددة المروج mec-4 (juIs338 أليل)18,25,26. نحن نستخدم ثقافة الدودة القياسية وأساليب الصيانة لهذه السلالة27.

  1. إعداد متوسط نمو النيماتودا (3.0 غرام / لتر كلوريد الصوديوم، 2.5 غرام / لتر بيبتون، 20.0 غرام / لتر أجار، 10 ملغ / لتر الكوليسترول (مخففة من محلول الأسهم من 10 ملغم / مل)) في الماء وautclave الخليط.
  2. يبرد الخليط لفترة وجيزة لمدة 10-15 دقيقة قبل استكماله بكلوريد الكالسيوم 1 mM وكبريتات المغنيسيوم 1 mM و 25.0 mM فوسفات البوتاسيوم أحادي الباسيك pH 6.0.
  3. صب حوالي 9 مل من الخليط في أطباق بيتري 60 ملم باستخدام موزع معقم يليه التخزين في درجة حرارة الغرفة والظروف العقيمة ليوم واحد والتخزين اللاحق عند 4 درجة مئوية.
  4. إعداد 50 مل من ب مرق (5.0 غرام / لتر كلوريد الصوديوم، 10.0 غرام / لتر باكو تريبتون)، الأوتوكلاف وتبريده قبل تلقيح مع مستعمرة واحدة من الإشريكية القولونية (OP50 سلالة).
  5. زراعة البكتيريا في 37 درجة مئوية لمدة 12 ساعة. جلب لوحات NGM المبردة إلى درجة حرارة الغرفة للبذر واستخدام موزع الزجاج المعقم جعل مسحة من البكتيريا OP50 على لوحة NGM.
  6. الحفاظ على لوحات NGM تلقيح في 37 درجة مئوية لمدة 12 ساعة، والتي سوف تسمح بتشكيل حديقة بكتيرية لزراعة C. elegans. يمكن تخزين هذه اللوحات في حاضنة 20 درجة مئوية حتى الاستخدام.
  7. إعادة الضغط المعدلة وراثيا على لوحات NGM المصنف.
  8. تعقيم اختيار الأسلاك البلاتين على اللهب واختيار 20-25 hermaphrodites الكبار gravid لنقلها إلى لوحة البذور الطازجة.
  9. بمجرد نقلها، حول اللوحة إلى حاضنة 20 درجة مئوية لمدة ساعة واحدة. ثم، استخراج البالغين من هذه اللوحات. هذه الأطباق سوف تحتوي الآن على البيض التي هي مطابقة للعمر.
  10. قم بتحويل اللوحات إلى حاضنة 20 درجة مئوية للتربية حتى تصل إلى مرحلة التطوير التي هي في هذه الحالة مرحلة L4 بعد 43.5 ساعة من وضع البيض. لمزيد من الديدان، لوحات متعددة الخلفية لتجنب الازدحام.
  11. في مرحلة النمو المطلوبة ، يمكن تركيب هذه الديدان لتصوير المذنبات EBP-2::GFP.

2. إعداد العينة: تصاعد الديدان لتصوير المذنبات EBP-2

ملاحظة: لتمكين المراقبة الحية للمذنبات EBP في الخلايا العصبية PLM، ونحن شنت الديدان على منصات agarose للحد من حركتها في حين لا المساس فسيولوجيا الخلايا العصبية. من بين مختلف أساليب شل الحركة، اخترنا 0.1 ميكرومتر حل حبة البوليسترين المتاحة بسهولة تجاريا. لقد أوجزنا الإجراء المتصاعد المستخدم خصيصا لمراقبة EBP-2::GFP.

  1. إعداد حل من 10٪ agarose عن طريق ذوبان 0.2 غرام من الآجاروز في 2 مل من 1x M9 العازلة (0.02 M KH2PO4، 0.02 MNa 2HPO4، 0.008 M NaCl ، 0.02 M NH4Cl) في أنبوب اختبار زجاجي 5 مل فوق اللهب. يمكن أن يتناسب أنبوب الاختبار هذا بسهولة مع كتلة التدفئة التي تحافظ على الآغاروز في الحالة المنصهرة حتى الاستخدام.
  2. باستخدام قطرة واسعة الفم، والاستغناء عن قطرة (حوالي 100 ميكرولتر) من هذا agarose المنصهر على شريحة زجاجية نظيفة من أبعاد 35 ملم × 25 ملم.
  3. بينما هو في حالة المنصهرة، اضغط على قطرة مع شريحة زجاجية أخرى لخلق فيلم رقيقة من الآغاروز بين الشرائح الزجاجية. و agarose بصلابة كفيلم من حوالي 0.5 - 1.0 ملم في سمك في حوالي 30 ثانية.
  4. بمجرد أن يتماسك agarose ، اضغط على الشريحة السفلية في اليد غير المهيمنة والشريحة العلوية في اليد المهيمنة. الوجه حتى الشريحة العلوية في حين عقد الشريحة السفلي ثابت نتيجة لذلك لوحة agarose العصي على واحدة من الشرائح اثنين.
  5. إذا كانت لوحة الآجروز التي تم تشكيلها أكبر من حجم الغطاء (18 مم × 18 مم)، فقم بتقليم حواف الوسادة للحصول على الأبعاد المطلوبة لضمان وضع غطاء الغطاء بشكل مناسب. هذه منصات agarose للاستخدام الفوري وليس ليتم تخزينها.
  6. فحص بصريا لوحة agarose لسطح أملس التي هي رطبة ومناسبة للتركيب. إذا تعرضت لوحة الآغاروز للهواء وجفت ، فإن سطح لوحة الآغاروز يبدو مجعدا. في مثل هذا السيناريو، إعداد لوحة agarose جديدة كما هو مذكور في الخطوات 2-6 من هذا القسم.
  7. على لوحة agarose، وضع 2 ميكرولتر من محلول حبة البوليسترين 0.1 ميكرومتر كوسيلة تصاعد.
  8. اختيار 3-4 الديدان باستخدام اختيار الأسلاك البلاتين وتحويلها إلى لوحة NGM غير المصنف. تضمن هذه العملية إزالة البكتيريا السطحية التي تعيق الجمود أثناء التركيب.
  9. مرة واحدة الديدان الزحف من البكتيريا السطحية، والتقاطها لتركيب باستخدام اختيار الأسلاك البلاتين وإعادة إنفاقها في قطرة من حبات البوليسترين على لوحة agarose.
  10. بعناية، ضع غطاء 18 مم × 18 مم على الديدان. لمنع انتزاع الديدان المركبة، لا تحرك الغطاء بعد الموضع.
  11. قم بتركيب الشريحة المعدة على المجهر للتصوير.

3. التصوير الإعداد والاستحواذ

ملاحظة: تنتقل المذنبات EBP بسرعة تقريبية قدرها 0.22 ميكرومتر /ثانية كما لوحظ في الخلايا العصبية الثديية وPLM من C. elegans16،18. ويتعين إجراء عينة على النحو الأمثل للأحداث في عملية اقتناء الفاصل الزمني وفقا لمعايير Nyquist28،والمقاييس المكانية والزمنية من 0.09 ميكرومتر و 0.43 ثانية، على التوالي. للوقاية من السمية الضوئية أو photobleaching، استخدمنا الغزل القرص اقتناء. لقد وصفنا إعداد التصوير وإعدادات الاستحواذ أدناه.

  1. التقط الصور باستخدام مجهر مقلوب مجهز بوحدة قرص دوار وكاميرا. قم بتشغيل الإعداد وفقا لتعليمات الشركة المصنعة.
  2. قم بتشغيل البرنامج الذي يتحكم في الإعداد.
  3. بما أن هذا مجهر مقلوب، ضع الشريحة مع الديدان المركبة على المسرح مع هدف تكبير منخفض (5x أو 10x) مع غطاء مواجه لأسفل.
  4. إعداد مسار الضوء إلى العين أو الوضع المرئي الذي يستخدم الإضاءة من مصباح الهالوجين للضوء المرسل ومصباح قوس الزئبق للضوء المنعكس.
  5. التركيز على دودة في حقل العرض أسفل حقل brightfield وتوسيطها.
  6. وضع زيت الغمر وتغيير التكبير إلى 63x (1.4NA / النفط) وإعادة تركيز ذيل الدودة في برايتفيلد للخلايا العصبية PLM.
  7. بدوره على مضان مصباح قوس الزئبق لإعادة تركيز قصيرة من الخلايا العصبية PLM. ضع المجموعة الصحيحة من العاكس (AF488) في مسار الضوء لتصور GFP.
  8. قم بتعيين المجهر على الكاميرا من خلال توجيه مسار الضوء إلى الكاميرا.
    ملاحظة: التحكم في الخطوات المذكورة أعلاه 4-7 من خلال شاشة الترانزستور رقيقة فيلم (TFT) من المجهر سريع ويمنع التعرض لا لزوم لها للإضاءة. بدلا من ذلك، والسيطرة على الإضاءة، عاكس من خلال البرنامج.
  9. بعد تركيز الخلايا العصبية PLM في مجال العرض، في واجهة البرمجيات حدد الإضاءة من الليزر 488 نانومتر مع قوة 30٪ والتعرض 300 مللي ثانية للكاميرا مع الإلكترون ضرب (EM) كسب قيمة 70. اعتمادا على التعبير المراسل، تختلف هذه المعلمات كما هو مطلوب. تخزين الإعدادات كتهيئة لجلسات التصوير اللاحقة.
  10. تخزن علامة التبويب Channels المسارات مع إعداد إضاءة وكاميرا محددين. المسار المميز يسمح بالتصور الحي في حين أنه للحصول على صورة يجب وضع علامة على المسار. تمييز قناة مع brightfield (DIC) لتصور مباشر من ذيل الفيروس المتنقل في مساحة العمل. يتم تركيز العينة وتوسيطها في إطار التصوير المباشر لمساحة العمل.
  11. تسليط الضوء على القناة مع 488 نانومتر ليزر الإثارة للتركيز السريع للخلية العصبية PLM في إطار التصوير الحي. بمجرد التركيز، ابدأ عملية اكتساب الفاصل الزمني عن طريق تعيين معلمات السلسلة الزمنية كما هو مذكور في الخطوة التالية.
  12. باستخدام إضاءة الليزر 488 نانومتر، إعداد تجربة مع سلسلة زمنية لمدة 2 دقيقة ولا فاصل زمني بين الإطارات. للحفاظ على المقاييس الزمنية لاكتساب الصورة ، حصلنا فقط على مضان GFP فقط.
  13. باستخدام علامة التبويب بدء التجربة، ابدأ عملية الاستحواذ. استخدام تكبير 63x يقيد الدقة المكانية إلى 0.21 ميكرومتر التي يتم أخذ عينات من قبل الكاميرا في حجم بكسل من 0.09 ميكرومتر. الحصول على الفاصل الزمني في 3.3 إطارات / ثانية لعينة الأمثل للحدث. وكان للصورة الفاصل الزمني 396 إطارا زمنيا تم الحصول عليها على مدى دقيقتين. بعد عملية الاستحواذ، احفظ الصورة بالتنسيق الافتراضي، والتي يمكن الوصول إليها لاحقا بواسطة البرنامج الافتراضي أو ImageJ.

4. المراقبة والتحليل

  1. معاينة الحصول على timelapse في البرنامج الافتراضي أو فتحه في صورة J من خلال المكونات Bioformats لها.
    ملاحظة: لقد وصفنا عملية تحليل الصورة في الصورة J.
  2. تثبيت المكونات Bioformats في ImageJ.
    1. بدلا من ذلك، تصدير ملف التنسيق الافتراضي إلى .tif توافق الملفات في ImageJ. تصدير الدالة في ZEN2 النتائج في إطارات فردية من الصورة كملفات .tif منفصلة. نحن نتجنب هذه الطريقة لمنع تشكيل عدد كبير من الملفات.
  3. افتح الصورة بتنسيق '.czi' مباشرة في Image J من خلال المكون الإضافي "Bioformats". يتم فتح الصورة ككدسة متعددة الصور. إذا كنت تستخدم وظيفة "التصدير" للبرنامج الافتراضي، ثم إعادة تشكيل الصور ككومة متعددة الصور باستخدام سير العمل التالي في ImageJ: ImageJ برنامج > قائمة الصور > مكدسات submenu > الصور إلى المكدس.
  4. معاينة الصورة كفيلم باستخدام رمز التشغيل في الزاوية السفلية اليسرى من نافذة الصورة. ويمكن رؤية المذنبات كما punctae المحمول مشرق في الجسم الخليوي وعمليات الخلايا العصبية PLM. إذا كانت المذنبات مرئية بوضوح، انتقل إلى الخطوة 8 وإلا اتبع الخطوات 5-7 من هذا القسم.
  5. تحويل ملف تعريف لون الصورة باستخدام جدول البحث (LUT) إلى صورة تدرج الرمادي: ImageJ برنامج > الصورة القائمة > القائمة الفرعية جداول البحث > تحديد الرمادي .
  6. عكس الملف الشخصي LUT للصورة لسهولة التصور: ImageJ برنامج > صورة القائمة > البحث الجداول > عكس LUT.
  7. ضبط سطوع وعلى النقيض من الصورة لرؤية المذنبات: ImageJ برنامج > صورة القائمة > ضبط > الفرعية سطوع / التباين.
    1. حرك أشرطة التمرير الحد الأدنى والحد الأقصى والسطوع والتباين للتحجيم المطلوب من الكثافات عبر الصورة. لقد قمنا بقياس الصور مع المذنبات مرئية بوضوح.
  8. يحتوي الإصدار الأساسي من ImageJ على أدوات بدء التشغيل الممثلة كرموز. حدد موقع الرمز وانقر بزر الماوس الأيمن عليه باستخدام خط لفتح قائمة منسدلة وحدد الخط المقسم. رسم خط مجزأة على المناطق ذات الاهتمام (ROI) مع أصله على أو بالقرب من جسم الخلية من الخلايا العصبية.
    1. لاعتبارات لاحقة، احفظ عائد الاستثمار السطر المقسم من خلال مدير عائد الاستثمار باستخدام سير العمل التالي: ImageJ > تحليل أدوات > > مدير عائد الاستثمار > حدد التتبع المرسوم في الصورة وانقر فوق إضافة في إطار إدارة عائد الاستثمار > المزيد في إطار إدارة عائد الاستثمار > حفظ.
  9. قبل توليد kymograph ، كما المقاييس المكانية والزمنية مختلفة إزالة التحجيم للحصول على القياسات بالبكسل باستخدام ما يلي :
    imageJ > تحليل > تعيين مقياس > انقر لإزالة مقياس > موافق.
  10. باستخدام وظيفة Reslice تحت القائمة المنسدلة "مداخن > الصورة"، قم بإنشاء kymograph. وkymograph هو تمثيل لعائد الاستثمار المجزأة في الوقت المناسب. يمثل المحور الأفقي المسافة ويمثل المحور العمودي الوقت. الآثار القطرية تمثل المذنبات المتحركة. بشكل عام، يأخذ kymograph ملف تعريف لون الصورة وإلا تعيين ملف تعريف لون كما هو موضح في الخطوات السابقة 5-6 لتصور آثار قطري.
  11. باستخدام الدالة خط مستقيم في القائمة المنسدلة من أداة الخط (الرجوع إلى الخطوة 9 من هذا المقطع) رسم خطوط مستقيمة على كل من آثار قطري وإلحاقها في إدارة عائد الاستثمار.
  12. ضمن علامة التبويب تحليل، انتقل إلى تعيين القياسات وحدد متوسط الكثافة ومعلمات مستطيل الحدود لقياس الآثار.
  13. في إطار إدارة عائد الاستثمار، انقر فوق قياس الذي سيفتح إطار نتيجة التي سوف تسفر عن متوسط كثافة العائد على الاستثمار، والإحداثيات س و ص من آثار الخط، والعرض، والارتفاع، والزاوية، وطول آثار الخط. يمكن حفظ هذه النافذة بتنسيق .csv ثم استيرادها لاحقا إلى برنامج تحليل البيانات.
  14. في برنامج جدول البيانات، تفتح نافذة النتائج بالقيم الموزعة في الصفوف والأعمدة. القيم ذات الصلة هي عرض وإرتفاع وزاوية الآثار. العرض يعطي إزاحة التتبع، والارتفاع يعطي المدة والزاوية تمثل المتجه. وبما أن قيم العرض والارتفاع بالبكسل، قم بضربهما بالمقاييس المكانية والزمنية، على التوالي، للحصول على المعلمات القياسية القابلة للقياس.
  15. وبما أن الجانب الأيسر من الكيموغراف قريب من جسم الخلية، حسب الزاوية، يصنف المذنبات إلى زائد نهاية أو ناقص نهاية (أي بعيدا عن جسم الخلية أو نحو جسم الخلية، على التوالي). تصنيف الزوايا بين 1° إلى -89° و -91° إلى -179° كما زائد نهاية التدريجي وناقص نهاية التدريجي، على التوالي. جمع البيانات من عدة kymographs في جدول بيانات لدراسة وتمثل إحصائيا.

النتائج

وكمثال تمثيلي، وصفنا في المراقبة الحية لمذنبات EBP في الحالة الثابتة وتجديد محاور عصبية لخلايا PLM العصبية. وتقع الخلايا العصبية PLM في منطقة الذيل من الدودة مع عملية طويلة الأمامية التي تشكل المشبك وعملية قصيرة الخلفي. تنمو الخلايا العصبية PLM في الاتجاه الأمامي الخلفي بالقرب من البشرة وهي مس...

Discussion

كان فهم ديناميكيات الميكروتبول محور تركيز رئيسي في مجال أبحاث الهيكل الخلوي على مر السنين. Microtubules الخضوع للنوى وكارثة جنبا إلى جنب مع عملية مستمرة من عدم الاستقرار الديناميكي44،45،46،47. وقد تم الحصول على ?...

Disclosures

ولا يعلن صاحبا البلاغ عن وجود تضارب في المصالح.

Acknowledgements

نشكر يشي جين وأندرو تشيشولم على الدعم الأولي والإجهاد المستخدم في الدراسة. تم الاستفادة من سلالة البكتيريا OP50 تجاريا من مركز علم الوراثة Caenorhabditis (CGC) بتمويل من مكتب المعاهد القومية للصحة لبرامج البنية التحتية للبحوث (P40 OD010440). كما نشكر دارميندرا بوري على توحيد الإجراءات التجريبية. يتم تمويل الدراسة من المنحة الأساسية للمركز الوطني لأبحاث الدماغ (بدعم من إدارة التكنولوجيا الحيوية، الحكومة الهندية)، DBT/Wellcome Trust India Alliance في وقت مبكر منحة مهنية (منحة # IA/E/18/1/504331) إلى S.D.، ويلكوم ترست-DBT الهند التحالف منحة وسيطة (منحة # IA/I/13/1/500874) إلى A.G.-R ومنحة من مجلس البحوث العلمية والهندسية (الصربية: CRG/2019/002194) إلى A.G.R.

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
CZ18975 worm strainYishi Jin labCZ18975Generated by Anindya Ghosh-Roy
AgaroseSigmaA9539Mounting worms
Coverslip (18 mm x 18 mm)Zeiss474030-9010-000Mounting worms
Dry bath with heating blockNeolabMounting worms
Glass slides (35 mm x 25 mm)Blue StarMounting worms
Polystyrene bead solution (4.55 x 10^13 particles/ml in aqueous medium with minimal surfactant)Polysciences Inc.00876Mounting worms
Test tubesMounting worms
OP50 bacterial strainCaenorhabditis Genetics Center (CGC)OP50Worm handling
60mm petri platesPraveen Scientific20440Worm handling
Aspirator/CapillaryVWR53432-921Worm handling
IncubatorPanasonicMIR554EWorm handling
Platinum wireWorm handling
Stereomicroscope with fluorescence attachmentLeicaM165FCWorm handling
0.3% Sodium ChlorideSigma71376Nematode Growth Medium
0.25% PeptoneT M Media1506Nematode Growth Medium
10mg/mL CholesterolSigmaC8667Nematode Growth Medium
1mM Calcium chloride dihydrateSigma223506Nematode Growth Medium
1mM Magnesium sulphate heptahydrateSigmaM2773Nematode Growth Medium
2% AgarT M Media1202Nematode Growth Medium
25mM Monobasic Potassium dihydrogen phosphateSigmaP9791Nematode Growth Medium
0.1M Monobasic Potassium dihydrogen phosphateSigmaP97911X M9 buffer
0.04M Sodium chlorideSigma713761X M9 buffer
0.1M Ammonium chlorideFisher Scientific214051X M9 buffer
0.2M Dibasic Disodium hydrogen phosphate heptahydrateSigmaS93901X M9 buffer
Glass bottlesBorosilBuffer storage
488 nm laserZeissImaging
5X objectiveZeissImaging
63X objectiveZeissImaging
CameraPhotometricsEvolve 512 DeltaImaging
Computer system for Spinning Disk unitHPIntel ® Xeon CPU E5-2623 3.00GHzImaging
Epifluorescence microscopeZeissObserver.Z1Imaging
Halogen lampZeissImaging
Mercury Arc LampZeissImaging
Spinning Disk UnitYokogawaCSU-X1Imaging
ZEN2 softwareZeissImaging
Image J (Fiji Version)Image analysis and processing
Adobe Creative CloudAdobeImage analysis and processing
Computer system for Image AnalysisDellIntel ® Core ™ i7-9700 CPU 3.00GHzImage processing/Representation

References

  1. Bush, M. S., Eagles, P. A. M., Gordon-Weeks, P. R. The neuronal cytoskeleton. Cytoskeleton: A Multi-Volume Treatise. 3, 185-227 (1996).
  2. Kapitein, L. C., Hoogenraad, C. C. Building the Neuronal Microtubule Cytoskeleton. Neuron. 87 (3), 492-506 (2015).
  3. Tas, R. P., Kapitein, L. C. Exploring cytoskeletal diversity in neurons. Science. 361 (6399), 231-232 (2018).
  4. Kirkpatrick, L. L., Brady, S. T. Molecular Components of the Neuronal Cytoskeleton. Basic Neurochemistry: Molecular, Cellular and Medical Aspects, 6th edition. , (1999).
  5. Muñoz-Lasso, D. C., Romá-Mateo, C., Pallardó, F. V., Gonzalez-Cabo, P. Much More Than a Scaffold: Cytoskeletal Proteins in Neurological Disorders. Cells. 9 (2), 358 (2020).
  6. Menon, S., Gupton, S. L. Building Blocks of Functioning Brain: Cytoskeletal Dynamics in Neuronal Development. International Review of Cell and Molecular Biology. 322, 183-245 (2016).
  7. Lasser, M., Tiber, J., Lowery, L. A. The role of the microtubule cytoskeleton in neurodevelopmental disorders. Frontiers in Cellular Neuroscience. 12, 165 (2018).
  8. Konietzny, A., Bär, J., Mikhaylova, M. Dendritic Actin Cytoskeleton: Structure, Functions, and Regulations. Frontiers in Cellular Neuroscience. 11, 147 (2017).
  9. Helfand, B. T., Mendez, M. G., Pugh, J., Delsert, C., Goldman, R. D. A Role for Intermediate Filaments in Determining and Maintaining the Shape of Nerve Cells. Molecular Biology of the Cell. 14 (12), 5069-5081 (2003).
  10. Lariviere, R. C., Julien, J. P. Functions of Intermediate Filaments in Neuronal Development and Disease. Journal of Neurobiology. 58 (1), 131-148 (2004).
  11. Desai, A., Mitchison, T. J. Microtubule polymerization dynamics. Annual Review of Cell and Developmental Biology. 13, 83-117 (1997).
  12. Nogales, E., Wolf, S. G., Downing, K. H. Structure of the αβ tubulin dimer by electron crystallography. Nature. 391 (6663), 199-203 (1998).
  13. Akhmanova, A., Steinmetz, M. O. Microtubule +TIPs at a glance. Journal of Cell Science. 123 (20), 3415-3419 (2010).
  14. Bieling, P., et al. Reconstitution of a microtubule plus-end tracking system in vitro. Nature. 450 (7172), 1100-1105 (2007).
  15. Perez, F., Diamantopoulos, G. S., Stalder, R., Kreis, T. E. CLIP-170 highlights growing microtubule ends in vivo. Cell. 96 (4), 517-527 (1999).
  16. Stepanova, T., et al. Visualization of microtubule growth in cultured neurons via the use of EB3-GFP (end-binding protein 3-green fluorescent protein). Journal of Neuroscience. 23 (7), 2655-2664 (2003).
  17. Rolls, M. M., Satoh, D., Clyne, P. J., Henner, A. L., Uemura, T., Doe, C. Q. Polarity and intracellular compartmentalization of Drosophila neurons. Neural Development. 2 (1), 7 (2007).
  18. Ghosh-Roy, A., Goncharov, A., Jin, Y., Chisholm, A. D. Kinesin-13 and Tubulin Posttranslational Modifications Regulate Microtubule Growth in Axon Regeneration. Developmental Cell. 23 (4), 716-728 (2012).
  19. Chen, L., et al. Axon Regeneration Pathways Identified by Systematic Genetic Screening in C. Elegant. Neuron. 71 (6), 1043-1057 (2011).
  20. Tran, L. D., et al. Dynamic microtubules at the vegetal cortex predict the embryonic axis in zebrafish. Development (Cambridge). 139 (19), 3644-3652 (2012).
  21. Tirnauer, J. S., Grego, S., Salmon, E. D., Mitchison, T. J. EB1-Microtubule Interactions in Xenopus Egg Extracts: Role of EB1 in Microtubule Stabilization and Mechanisms of Targeting to Microtubules. Molecular Biology of the Cell. 13 (10), 3614-3626 (2002).
  22. Maniar, T. A., et al. UNC-33 (CRMP) and ankyrin organize microtubules and localize kinesin to polarize axon-dendrite sorting. Nature Neuroscience. 15 (1), 48-56 (2012).
  23. Stone, M. C., Nguyen, M. M., Tao, J., Allender, D. L., Rolls, M. M. Global Up-Regulation of Microtubule Dynamics and Polarity Reversal during Regeneration of an Axon from a Dendrite. Molecular Biology of the Cell. 21 (5), 767-777 (2010).
  24. Puri, D., Ponniah, K., Biswas, K., Basu, A., Lundquist, E. A., Ghosh-Roy, A. Wnt signaling establishes the microtubule polarity in neurons through regulation of Kinesin-13 Family Microtubule Depolymerizing Factor. SSRN Electronic Journal. , (2019).
  25. CZ18975 (strain). WormBase Nematode Information Resource Available from: https://wormbase.org/species/c_elegans/stran/WBStrain00005443#03–10 (2021)
  26. Ghosh-Roy, A., Goncharov, A., Jin, Y., Chisholm, A. D. Kinesin-13 and tubular post translational modifications regulate microtubule growth in axon regeneration. Developmental Cell. 23 (4), 716-728 (2012).
  27. Chuang, M., Goncharov, A., Wang, S., Oegema, K., Jin, Y., Chisholm, A. D. The microtubule minus-end-binding protein patronin/PTRN-1 is required for axon regeneration in C. elegans. Cell Reports. 9 (3), 874-883 (2014).
  28. Stiernagle, T. Maintenance of C. elegans. WormBook. , 1-11 (2006).
  29. Pawley, J. B. . Handbook of Biological Confocal Microscopy: Third Edition. , (2006).
  30. Chalfie, M., Thomson, J. N. Organization of neuronal microtubules in the nematode Caenorhabditis elegans. Journal of Cell Biology. 82 (1), 278-289 (1979).
  31. Murthy, K., Bhat, J. M., Koushika, S. P. In vivo imaging of retrogradely transported synaptic vesicle proteins in Caenorhabditis elegans neurons. Traffic. 12 (1), 89-101 (2011).
  32. Rao, G. N., Kulkarni, S. S., Koushika, S. P., Rau, K. R. In vivo nanosecond laser axotomy: cavitation dynamics and vesicle transport. Optics Express. 16 (13), 9884 (2008).
  33. Chen, L., et al. Axon Regeneration Pathways Identified by Systematic Genetic Screening in C. Elegant. Neuron. 71 (6), 1043-1057 (2011).
  34. Ghosh-Roy, A., Chisholm, A. D. Caenorhabditis elegant: A new model organism for studies of axon regeneration. Developmental Dynamics. 239 (5), 1464 (2010).
  35. Hilliard, M. A., Bargmann, C. I. Wnt signals and Frizzled activity orient anterior-posterior axon outgrowth in C. elegans. Developmental Cell. 10 (3), 379-390 (2006).
  36. Prasad, B. C., Clark, S. G. Wnt signaling establishes anteroposterior neuronal polarity and requires retromer in C. Elegant. Development. 133 (9), 1757-1766 (2006).
  37. Puri, D., et al. Wnt signaling establishes the microtubule polarity in neurons through regulation of Kinesin-13. Journal of Cell Biology. 220 (9), (2021).
  38. Chen, C. H., Chen, Y. C., Jiang, H. C., Chen, C. K., Pan, C. L. Neuronal aging: Learning from C. elegans. Journal of Molecular Signaling. 8, (2013).
  39. Toth, M. L., et al. Neurite sprouting and synapse deterioration in the aging Caenorhabditis elegans nervous system. Journal of Neuroscience. 32 (26), 8778-8790 (2012).
  40. Bourgeois, F., Ben-Yakar, A. Femtosecond laser nanoaxotomy properties and their effect on axonal recovery in C. Elegant. Optics Express. 15 (14), 8521-8531 (2007).
  41. Raabe, I., Vogel, S. K., Peychl, J., ToliĆ-NØrrelykke, I. M. Intracellular nanosurgery and cell enucleation using a picosecond laser. Journal of Microscopy. 234 (1), 1-8 (2009).
  42. Hutson, M. S., Ma, X. Plasma and cavitation dynamics during pulsed laser microsurgery in vivo. Physical Review Letters. 99 (15), (2007).
  43. Steinmeyer, J. D., et al. Construction of a femtosecond laser microsurgery system. Nature Protocols. 5 (3), 395-407 (2010).
  44. Williams, W., Nix, P., Bastiani, M. Constructing a low-budget laser axotomy system to study axon regeneration in C. elegans. Journal of Visualized Experiments. (57), e3331 (2011).
  45. Byrne, A. B., Edwards, T. J., Hammarlund, M. In vivo laser axotomy in C. elegans. Journal of Visualized Experiments. (51), e2707 (2011).
  46. Basu, A., et al. let-7 miRNA controls CED-7 homotypic adhesion and EFF-1-mediated axonal self-fusion to restore touch sensation following injury. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 114 (47), 10206-10215 (2017).
  47. Horio, T., Murata, T., Murata, T. The role of dynamic instability in microtubule organization. Frontiers in Plant Science. 5, (2014).
  48. Michaels, T. C. T., Feng, S., Liang, H., Mahadevan, L. Mechanics and kinetics of dynamic instability. eLife. 9, 1-29 (2020).
  49. Zhang, R., Alushin, G. M., Brown, A., Nogales, E. Mechanistic origin of microtubule dynamic instability and its modulation by EB proteins. Cell. 162 (4), 849-859 (2015).
  50. Aher, A., Akhmanova, A. Tipping microtubule dynamics, one protofilament at a time. Current Opinion in Cell Biology. 50, 86-93 (2018).
  51. Zwetsloot, A. J., Tut, G., Straube, A. Measuring microtubule dynamics. Essays in Biochemistry. 62 (6), 725-735 (2018).
  52. Harterink, M., et al. Local microtubule organization promotes cargo transport in C. elegans dendrites. Journal of Cell Science. 131 (20), 223107 (2018).
  53. Yogev, S., Maeder, C. I., Cooper, R., Horowitz, M., Hendricks, A. G., Shen, K. Local inhibition of microtubule dynamics by dynein is required for neuronal cargo distribution. Nature Communications. 8, (2017).
  54. Liang, X., et al. Growth cone-localized microtubule organizing center establishes microtubule orientation in dendrites. eLife. 9, 1-28 (2020).
  55. Yan, J., et al. Kinesin-1 regulates dendrite microtubule polarity in Caenorhabditis elegans. eLife. 2013 (2), 133 (2013).
  56. Wang, S., et al. NOCA-1 functions with γ-tubulin and in parallel to Patronin to assemble non-centrosomal microtubule arrays in C. elegans. eLife. 4, (2015).
  57. Castigiioni, V. G., Pires, H. R., Bertolini, R. R., Riga, A., Kerver, J., Boxem, M. Epidermal par-6 and pkc-3 are essential for larval development of C. elegans and organize non-centrosomal microtubules. eLife. 9, 1-37 (2020).
  58. Taffoni, C., et al. Microtubule plus-end dynamics link wound repair to the innate immune response. eLife. 9, (2020).
  59. Motegi, F., Velarde, N. V., Piano, F., Sugimoto, A. Two phases of astral microtubule activity during cytokinesis in C. elegans embryos. Developmental Cell. 10 (4), 509-520 (2006).
  60. Kim, E., Sun, L., Gabel, C. V., Fang-Yen, C. Long-Term Imaging of Caenorhabditis elegans Using Nanoparticle-Mediated Immobilization. PLoS ONE. 8 (1), 53419 (2013).
  61. Breton, S., Brown, D. Cold-induced microtubule disruption and relocalization of membrane proteins in kidney epithelial cells. Journal of the American Society of Nephrology. 9 (2), 155-166 (1998).
  62. Weber, K., Pollack, R., Bibring, T. Antibody against tubulin: the specific visualization of cytoplasmic microtubules in tissue culture cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 72 (2), 459-463 (1975).
  63. Weisenberg, R. C. Microtubule formation in vitro in solutions containing low calcium concentrations. Science. 177 (4054), 1104-1105 (1972).
  64. Tilney, L. G., Porter, K. R. Studies on the microtubules in heliozoa. II. The effect of low temperature on these structures in the formation and maintenance of the axopodia. The Journal of Cell Biology. 34 (1), 327-343 (1967).
  65. Li, G., Moore, J. K. Microtubule dynamics at low temperature: Evidence that tubulin recycling limits assembly. Molecular Biology of the Cell. 31 (11), 1154-1166 (2020).
  66. Wang, X., et al. In vivo imaging of a PVD neuron in Caenorhabditis elegans. STAR Protocols. 2 (1), 100309 (2021).
  67. Dirksen, P., et al. CeMbio - The Caenorhabditis elegans microbiome resource. G3: Genes, Genomes, Genetics. 10 (9), 3025-3039 (2020).
  68. Portman, D. S. Profiling C. elegans gene expression with DNA microarrays. WormBook. , 1-11 (2006).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

177

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved