In vivo Evaluación de la dinámica y orientación de los microtúbulos en las neuronas caenorhabditis elegans

Resumen

Se ha presentado un protocolo para la obtención de imágenes de los microtúbulos dinámicos in vivo utilizando la proteína de unión al extremo etiquetada fluorescentemente. Describimos los métodos para etiquetar, obtener imágenes y analizar los microtúbulos dinámicos en la neurona del microtúbulo lateral posterior (PLM) de C. elegans.

Resumen

En las neuronas, la orientación de los microtúbulos ha sido un evaluador clave para identificar los axones que tienen microtúbulos y dendritas de extremo superior que generalmente tienen una orientación mixta. Aquí describimos métodos para etiquetar, obtener imágenes y analizar la dinámica y el crecimiento de los microtúbulos durante el desarrollo y la regeneración de las neuronas táctiles en C. elegans. Usando reporteros fluorescentes codificados genéticamente de puntas de microtúbulos, tomamos imágenes de los microtúbulos axonales. Los cambios locales en el comportamiento de los microtúbulos que inician la regeneración del axón después de la axotomía se pueden cuantificar utilizando este protocolo. Este ensayo es adaptable a otras neuronas y antecedentes genéticos para investigar la regulación de la dinámica de los microtúbulos en diversos procesos celulares.

Introducción

Las neuronas tienen una arquitectura elaborada con compartimentos especializados como dendritas, cuerpos celulares, axones y sinapsis. El citoesqueleto neuronal está constituido por los microtúbulos, microfilamentos y neurofilamentos y su organización distinta soporta los compartimentos neuronales estructural y funcionalmente^{1,2,3,4,5,6,7,8,9,10} . A lo largo de los años, la organización de los microtúbulos se ha identificado como un determinante clave de la polaridad y función neuronal. A medida que las neuronas experimentan una remodelación estructural durante el desarrollo o la regeneración, la dinámica y la orientación de los microtúbulos determinan la identidad, el transporte polarizado, el crecimiento y el desarrollo de varios compartimentos neuronales⁷. Por lo tanto, es imperativo evaluar la dinámica y la orientación de los microtúbulos in vivo para correlacionarlos con el proceso de remodelación neuronal.

Los microtúbulos están compuestos por protofilamentos de α y β heterodímeros de Tubulina con extremos más dinámicos y extremos menos relativamente estables^11,12. El descubrimiento del complejo de punta más y las proteínas de unión final asociadas han permitido una plataforma para evaluar la organización de los microtúbulos¹³. Las proteínas de unión al final (EBP) se asocian transitoriamente con los extremos de crecimiento más del microtúbulo y su dinámica de asociación se correlaciona con el crecimiento de los protofilamentos de microtúbulos^14,15. Debido a la frecuente asociación y disociación del complejo de punta más con el microtúbulo, la función de dispersión puntual del EBP marcado con GFP aparece como un "cometa" en una película de lapso de tiempo^15,16. Desde la observación pionera en neuronas de mamíferos^16,las proteínas de unión final marcadas con proteínas fluorescentes se han utilizado para determinar la dinámica de microtúbulos a través de diferentes sistemas modelo y tipos de neuronas^{17,18, 19,20, 21,22,23.}

Debido a su sistema nervioso simple y cuerpo transparente, C. elegans ha demostrado ser un excelente sistema modelo para estudiar la remodelación neuronal durante el desarrollo y la regeneración in vivo. Aquí describimos métodos para etiquetar, obtener imágenes y analizar la dinámica y el crecimiento de los microtúbulos durante el desarrollo y la regeneración de las neuronas táctiles en C. elegans. Utilizando EBP-2::GFP codificado genéticamente, tomamos imágenes de los microtúbulos en la neurona PLM, lo que nos permitió determinar la polaridad de los microtúbulos en dos neuritas diferentes de esta neurona²⁴. Este método permite la observación y cuantificación de los cometas EBP como medida de la dinámica de los microtúbulos en diferentes contextos celulares, por ejemplo, los cambios locales en el comportamiento de los microtúbulos que inician la regeneración de los axones después de la axotomía se pueden evaluar utilizando nuestro protocolo. Este ensayo se puede adaptar para investigar la regulación de la dinámica de los microtúbulos en diversos procesos celulares en diversos tipos de células y antecedentes genéticos.

Protocolo

1. Cepa reportera: Cultura y mantenimiento

NOTA: Para medir la dinámica y orientación de los microtúbulos en las neuronas PLM, utilizamos la cepa de gusano que expresa EBP-2::GFP bajo el promotor específico de la neurona táctil mec-4 (alelo juIs338) ^18,25,26. Utilizamos métodos estándar de cultivo y mantenimiento de gusanos para esta cepa²⁷.

1. Preparar el nematodo growth medium (3,0 g/L de cloruro de sodio, 2,5 g/L de peptona, 20,0 g/L de agar, 10 mg/L de colesterol (diluido de una solución caldo de 10 mg/mL)) en agua y autoclave la mezcla.
2. Enfríe la mezcla brevemente durante 10-15 min antes de complementarla con 1 mM de cloruro de calcio, 1 mM de sulfato de magnesio y 25.0 mM de fosfato de potasio monobásico pH 6.0.
3. Vierta alrededor de 9 ml de la mezcla en placas de Petri de 60 mm utilizando un dispensador estéril, seguido de almacenamiento a temperatura ambiente y condiciones estériles durante un día y posterior almacenamiento a 4 °C.
4. Preparar 50 ml de caldo B (5,0 g/L de cloruro de sodio, 10,0 g/L de bacto-triptona), autoclave y enfriarlo antes de inocular con una sola colonia de Escherichia coli (cepa OP50).
5. Culta la bacteria a 37 °C durante 12 horas. Lleve las placas NGM refrigeradas a temperatura ambiente para la siembra y, con un esparcidor de vidrio esterilizado, haga un frotis de bacterias OP50 en la placa NGM.
6. Mantenga las placas NGM inoculadas a 37 °C durante 12 horas, lo que permitirá la formación de un césped bacteriano para el cultivo de C. elegans. Estas placas se pueden almacenar en una incubadora de 20 °C hasta su uso.
7. Criar la cepa transgénica en las placas NGM secuescas.
8. Esterilice una púa de alambre de platino en llama y elija 20-25 hermafroditas adultos grávidos para transferirlos a un plato recién sembrado.
9. Una vez transferida, cambie la placa a una incubadora de 20 °C durante 1 h. Luego, extraiga a los adultos de estas placas. Estas placas ahora contendrán huevos que son compatibles con la edad.
10. Cambie las placas a la incubadora de 20 ° C para la cría hasta que alcancen la etapa de desarrollo de interés, que en este caso es la etapa L4 a las 43,5 horas después de la puesta de huevos. Para más gusanos, retrovisormente múltiples placas para evitar aglomeraciones.
11. En la etapa de desarrollo deseada, estos gusanos se pueden montar para obtener imágenes de los cometas EBP-2::GFP.

2. Preparación de la muestra: Montaje de gusanos para la obtención de imágenes de cometas EBP-2

NOTA: Para permitir la observación en vivo de los cometas EBP en las neuronas PLM, montamos los gusanos en almohadillas de agarosa para minimizar su movilidad sin comprometer la fisiología de la neurona. Entre los diversos métodos de inmovilización, hemos elegido una solución de perlas de poliestireno de 0,1 μm fácilmente disponible comercialmente. Hemos esbozado el procedimiento de montaje utilizado específicamente para la observación EBP-2::GFP.

1. Preparar una solución de agarosa al 10% fundiendo 0,2 g de agarosa en 2 mL de tampón 1x M9 (0,02 M KH₂PO₄, 0,02 M Na₂HPO₄, 0,008 M NaCl, 0,02 M NH₄Cl) en un tubo de ensayo de vidrio de 5 mL sobre una llama. Este tubo de ensayo puede caber fácilmente en un bloque de calentamiento que mantiene la agarosa en estado fundido hasta su uso.
2. Usando un gotero de boca ancha, dispense una gota (alrededor de 100 μL) de esta agarosa fundida sobre un portaobjetos de vidrio limpio de dimensiones de 35 mm x 25 mm.
3. Mientras esté en estado fundido, presione la gota con otro portaobjetos de vidrio para crear una película delgada de la agarosa entre los portaobjetos de vidrio. La agarosa se solidifica como una película de alrededor de 0,5 a 1,0 mm de espesor en unos 30 segundos.
4. Una vez que la agarosa se solidifique, sostenga la diapositiva inferior en la mano no dominante y la diapositiva superior en la mano dominante. Voltee hacia arriba la diapositiva superior mientras mantiene la diapositiva inferior estable como resultado de lo cual la almohadilla de agarosa se adhiere a una de las dos diapositivas.
5. Si la almohadilla de agarosa formada es más grande que el tamaño de la cubierta (18 mm x 18 mm), recorte los bordes de la almohadilla para obtener las dimensiones requeridas para garantizar la colocación adecuada de la cubierta. Estas almohadillas de agarosa son para el uso inmediato y no para ser almacenadas.
6. Inspeccione visualmente la almohadilla de agarosa para obtener una superficie lisa que esté húmeda y sea adecuada para el montaje. Si la almohadilla de agarosa se expone al aire y se seca, la superficie de la almohadilla de agarosa aparece arrugada. En tal escenario, prepare una almohadilla de agarosa fresca como se menciona en los pasos 2-6 de esta sección.
7. En la almohadilla de agarosa, coloque 2 μL de solución de perlas de poliestireno de 0,1 μm como medio de montaje.
8. Elija 3-4 gusanos usando una púa de alambre de platino y desplazándolos a una placa NGM sin semilla. Este proceso asegura la eliminación de bacterias superficiales que dificultan la inmovilización durante el montaje.
9. Una vez que los gusanos se arrastran fuera de sus bacterias superficiales, recójalos para montarlos con una púa de alambre de platino y resuspendlos en la gota de perlas de poliestireno en la almohadilla de agarosa.
10. Con cuidado, coloque una funda de 18 mm x 18 mm sobre los gusanos. Para evitar la evisceración de los gusanos montados, no mueva la cubierta después de la colocación.
11. Monte la diapositiva preparada en el microscopio para obtener imágenes.

3. Configuración y adquisición de imágenes

NOTA: Los cometas EBP viajan con una velocidad aproximada de 0,22 μm/s como se observa en las neuronas de mamíferos y PLM de C. elegans^16,18. Para muestrear de manera óptima los eventos en una adquisición de lapso de tiempo según el criterio de Nyquist^28,se requieren escalas espaciales y temporales de 0.09 μm y 0.43 s, respectivamente. Para la prevención de la fototoxicidad o el fotobleaching, se utilizó la adquisición de Spinning Disk. Hemos descrito nuestra configuración de imágenes y la configuración de adquisición a continuación.

1. Capture las imágenes utilizando un microscopio invertido equipado con una unidad de disco giratorio y una cámara. Active la configuración según las instrucciones del fabricante.
2. Encienda el software que controla la configuración.
3. Como se trata de un microscopio invertido, coloque la diapositiva con los gusanos montados en el escenario con un objetivo de bajo aumento (5x o 10x) con la cubierta hacia abajo.
4. Configure la trayectoria de la luz hacia el ojo o el modo visible que utiliza la iluminación de la lámpara halógena para la luz transmitida y la lámpara de arco de mercurio para la luz reflejada.
5. Enfoca y centra un gusano en el campo de visión debajo del campo brillante.
6. Coloque el aceite de inmersión y cambie el aumento a 63x (1.4NA / Aceite) y vuelva a enfocar la cola de gusano en el campo brillante para las neuronas PLM.
7. Encienda la fluorescencia de la lámpara de arco de mercurio para un breve reenfoque de las neuronas PLM. Coloque el conjunto correcto de reflectores (AF488) en la trayectoria de la luz para la visualización de GFP.
8. Ajuste el microscopio a la adquisición de la cámara dirigiendo la trayectoria de la luz hacia la cámara.
   NOTA: El control de los pasos 4-7 mencionados anteriormente a través de la pantalla del transistor de película delgada (TFT) del microscopio es rápido y evita la exposición innecesaria a la iluminación. Alternativamente, controle la iluminación, el reflector a través del software.
9. Después del enfoque de la neurona PLM en el campo de visión, en la interfaz del software seleccione la iluminación del láser de 488 nm con 30% de potencia y 300 ms de exposición para la cámara con multiplicación de electrones (EM) valor de ganancia 70. Dependiendo de la expresión del reportero, varíe estos parámetros según sea necesario. Almacene la configuración como una configuración para las sesiones de creación de imágenes posteriores.
10. La pestaña Canales almacena las pistas, cada una con una iluminación y una configuración de cámara específicas. La pista resaltada permite una visualización en vivo, mientras que para adquirir una imagen la pista debe estar marcada. Resalte un canal con campo brillante (DIC) para la visualización en vivo de la cola del gusano en el espacio de trabajo. La muestra está enfocada y centrada en la ventana de imágenes en vivo del espacio de trabajo.
11. Resalte el canal con excitación láser de 488 nm para un enfoque rápido de la neurona PLM en la ventana de imágenes en vivo. Una vez enfocado, comience la adquisición de lapso de tiempo estableciendo los parámetros de la serie de tiempo como se menciona en el siguiente paso.
12. Usando iluminación láser de 488 nm, configure un experimento con series de tiempo durante 2 minutos y sin intervalo de tiempo entre fotogramas. Para mantener las escalas temporales de adquisición de imágenes, solo adquirimos fluorescencia GFP solamente.
13. Con la pestaña Iniciar experimento, comience la adquisición. El uso de un aumento de 63x restringe la resolución espacial a 0.21 μm que es muestreada por la cámara al tamaño de píxel de 0.09 μm. Adquiera un lapso de tiempo a 3.3 fotogramas / s para muestrear de manera óptima el evento. La imagen de lapso de tiempo tenía 396 marcos de tiempo adquiridos durante una duración de 2 minutos. Después de la adquisición, guarde la imagen en el formato predeterminado, al que luego se puede acceder mediante el software predeterminado o ImageJ.

4. Observación y análisis

1. Obtenga una vista previa de la adquisición de lapso de tiempo en el software predeterminado o ábrala en Image J a través de su complemento Bioformats.
   NOTA: Hemos descrito el proceso de análisis de imágenes en la Imagen J.
2. Instale el complemento Bioformats en ImageJ.
   1. Alternativamente, exporte el archivo de formato predeterminado a .tif para la compatibilidad de archivos en ImageJ. La función de exportación en ZEN2 da como resultado fotogramas individuales de la imagen como archivos discretos .tif. Evitamos este método para evitar la formación de un gran número de archivos.
3. Abra la imagen en formato '.czi' directamente en la Imagen J a través de su plugin 'Bioformatos'. La imagen se abre como una pila de varias imágenes. Si utiliza la función "exportar" del software predeterminado, reconstituya las imágenes como una pila de varias imágenes utilizando el siguiente flujo de trabajo en ImageJ: ImageJ Program > Image Menu > Stacks Submenú > Images To Stack.
4. Obtenga una vista previa de la imagen como una película utilizando el icono Reproducir en la esquina inferior izquierda de la ventana de la imagen. Los cometas se pueden ver como puntinos móviles brillantes en el cuerpo celular y los procesos de la neurona PLM. Si los cometas son visibles claramente, continúe con el paso 8, de lo contrario, siga los pasos 5-7 de esta sección.
5. Convierta el perfil de color de la imagen utilizando la tabla de búsqueda (LUT) en una imagen en escala de grises: el programa ImageJ > menú Imagen > submenú Tablas de búsqueda > Seleccionar grises.
6. Invierta el perfil LUT de la imagen para una fácil visualización: el programa ImageJ > menú Imagen > submenú Tablas de búsqueda > Invertir LUT.
7. Ajuste el brillo y el contraste de la imagen para ver los cometas: Programa ImageJ > menú Imagen > Ajustar submenú > Brillo/Contraste.
   1. Mueva los controles deslizantes de Mínimo, Máximo, Brillo y Contraste para obtener la escala deseada de las intensidades en toda la imagen. Cuantificamos las imágenes con cometas visibles claramente.
8. La versión básica de ImageJ tiene herramientas de inicio representadas como iconos. Localice y haga clic con el botón derecho en el icono con una línea para abrir un menú desplegable y seleccione la línea segmentada. Dibuje la línea segmentada en las regiones de interés (ROI) con su origen en o cerca del cuerpo celular de la neurona.
   1. Para consideraciones posteriores, guarde el ROI de la línea segmentada a través del administrador de ROI utilizando el siguiente flujo de trabajo: ImageJ > Analizar herramientas > > gestor de ROI > Seleccione el rastro dibujado en la imagen y haga clic en Agregar en la ventana del gestor de ROI > Más en la ventana del gestor de ROI > Guardar.
9. Antes de generar el kymograph, como las escalas espaciales y temporales son diferentes se quita la escala para obtener las medidas en píxeles utilizando lo siguiente:
   ImageJ > Analizar > Establecer escala > Haga clic para quitar la escala > Aceptar.
10. Usando la función Reslice en el menú desplegable Image > Stacks, genere un kymograph. El kymograph es una representación del ROI segmentado en el tiempo. El eje horizontal representa la distancia y el eje vertical representa el tiempo. Las trazas diagonales representan los cometas en movimiento. Generalmente, el kymograph toma el perfil de color de la imagen, de lo contrario, asigne un perfil de color como se describe en los pasos anteriores 5-6 para la visualización de las trazas diagonales.
11. Usando la función Línea recta en el menú desplegable de la herramienta Línea (consulte el paso 9 de esta sección) dibuje líneas rectas sobre cada una de las trazas diagonales y adíslas en el administrador de ROI.
12. En la pestaña Analizar, vaya a Establecer mediciones y seleccione Intensidad media y Parámetros de rectángulo delimitador para medir las trazas.
13. En la ventana del administrador de ROI, haga clic en Medir, que abrirá una ventana de resultados que arrojará la intensidad media del ROI, las coordenadas X e Y de las trazas de línea, Ancho, Alto, Ángulo y Longitud de las trazas de línea. Esta ventana se puede guardar como un formato .csv y luego importarse a un programa de análisis de datos.
14. En el programa de hoja de cálculo, se abre la ventana de resultados con los valores distribuidos en filas y columnas. Los valores relevantes son el ancho, el alto y el ángulo de las trazas. El ancho da el desplazamiento de la traza, la altura da la duración y el ángulo representa el vector. Como los valores de anchura y altura están en píxeles, multiplíquelos con las escalas espacial y temporal, respectivamente, para obtener los parámetros medibles estándar.
15. Como el lado izquierdo del kymograph es proximal al cuerpo celular, dependiendo del ángulo, clasifique los cometas en más-extremo-fuera o menos-extremo-fuera (es decir, lejos del cuerpo celular o hacia el cuerpo celular, respectivamente). Clasifique los ángulos entre 1° a -89° y -91° a -179° como más-extremo-out y menos-extremo-fuera, respectivamente. Recopile datos de múltiples kymographs en una hoja de cálculo para un estudio y represente estadísticamente.

Resultados

Como ejemplo representativo, hemos descrito la observación in vivo de los cometas EBP en estado estacionario y los axones regeneradores de las neuronas PLM. Las neuronas PLM se encuentran en la región de la cola del gusano con un proceso anterior largo que forma una sinapsis y un proceso posterior corto. Las neuronas PLM crecen en la dirección anterior-posterior cerca de la epidermis y son responsables de la suave sensación de tacto en los gusanos. Debido a su estructura simplificada y su facilidad para la obtención...

Discusión

La comprensión de la dinámica de los microtúbulos ha sido un enfoque clave en el campo de la investigación citoesquelética a lo largo de los años. Los microtúbulos sufren nucleación y catástrofe junto con un proceso continuo de inestabilidad dinámica^44,45,46,47. Gran parte de esta información se ha obtenido a través de ensayos in vitro como lecturas de d...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
CZ18975 worm strain	Yishi Jin lab	CZ18975	Generated by Anindya Ghosh-Roy
Agarose	Sigma	A9539	Mounting worms
Coverslip (18 mm x 18 mm)	Zeiss	474030-9010-000	Mounting worms
Dry bath with heating block	Neolab		Mounting worms
Glass slides (35 mm x 25 mm)	Blue Star		Mounting worms
Polystyrene bead solution (4.55 x 10^13 particles/ml in aqueous medium with minimal surfactant)	Polysciences Inc.	00876	Mounting worms
Test tubes			Mounting worms
OP50 bacterial strain	Caenorhabditis Genetics Center (CGC)	OP50	Worm handling
60mm petri plates	Praveen Scientific	20440	Worm handling
Aspirator/Capillary	VWR	53432-921	Worm handling
Incubator	Panasonic	MIR554E	Worm handling
Platinum wire			Worm handling
Stereomicroscope with fluorescence attachment	Leica	M165FC	Worm handling
0.3% Sodium Chloride	Sigma	71376	Nematode Growth Medium
0.25% Peptone	T M Media	1506	Nematode Growth Medium
10mg/mL Cholesterol	Sigma	C8667	Nematode Growth Medium
1mM Calcium chloride dihydrate	Sigma	223506	Nematode Growth Medium
1mM Magnesium sulphate heptahydrate	Sigma	M2773	Nematode Growth Medium
2% Agar	T M Media	1202	Nematode Growth Medium
25mM Monobasic Potassium dihydrogen phosphate	Sigma	P9791	Nematode Growth Medium
0.1M Monobasic Potassium dihydrogen phosphate	Sigma	P9791	1X M9 buffer
0.04M Sodium chloride	Sigma	71376	1X M9 buffer
0.1M Ammonium chloride	Fisher Scientific	21405	1X M9 buffer
0.2M Dibasic Disodium hydrogen phosphate heptahydrate	Sigma	S9390	1X M9 buffer
Glass bottles	Borosil		Buffer storage
488 nm laser	Zeiss		Imaging
5X objective	Zeiss		Imaging
63X objective	Zeiss		Imaging
Camera	Photometrics	Evolve 512 Delta	Imaging
Computer system for Spinning Disk unit	HP	Intel ® Xeon CPU E5-2623 3.00GHz	Imaging
Epifluorescence microscope	Zeiss	Observer.Z1	Imaging
Halogen lamp	Zeiss		Imaging
Mercury Arc Lamp	Zeiss		Imaging
Spinning Disk Unit	Yokogawa	CSU-X1	Imaging
ZEN2 software	Zeiss		Imaging
Image J (Fiji Version)			Image analysis and processing
Adobe Creative Cloud	Adobe		Image analysis and processing
Computer system for Image Analysis	Dell	Intel ® Core ™ i7-9700 CPU 3.00GHz	Image processing/Representation