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要約

蛍光標識End結合タンパク質を用いて 生体内で 動的微小管をイメージングするプロトコルが提示された。 我々は、C.エレガンスの後方微小管(PLM)ニューロンにおける動的微小管の標識、画像化、および分析の方法を説明した。

要約

ニューロンでは、微小管配向は、一般的に配向が混在するプラスエンドアウト微小管と樹状突起を有する軸索を同定するための重要な査定者であった。ここでは 、C.エレガンス におけるタッチニューロンの発達と再生中の微小管ダイナミクスおよび成長を標識、画像化、分析する方法について説明する。微小管先端の遺伝的にコードされた蛍光レポーターを用いて、軸索微小管を画像化した。このプロトコルを使用して、奇数に続いて軸索再生を開始する微小管挙動の局所的変化を定量化することができる。このアッセイは、様々な細胞プロセスにおける微小管ダイナミクスの調節を調査するために、他のニューロンおよび遺伝的背景に適応可能である。

概要

ニューロンは、樹状突起、細胞体、軸索、シナプスなどの特殊なコンパートメントを備えた精巧なアーキテクチャを持っています。ニューロン細胞骨格は、微小管、マイクロフィラメント、および神経フィラメントと、その明確な組織が、神経区画を構造的および機能的に支持する1、2、3、4、5、6、7、8、9、10 .長年にわたり、微小管組織は、神経極性および機能の重要な決定要因として同定されてきた。ニューロンが開発中または再生中に構造リモデリングを受けるにつれて、微小管のダイナミクスと配向は、様々なニューロンコンパートメントのアイデンティティ、偏光輸送、成長、および発達を決定する。したがって、ニューロンリモデリングプロセスと相関させるために、生体内での微小管ダイナミクスおよび向きを評価することが不可欠である。

微小管は、αおよびβのtubulinヘテロ二量体の原始フィラメントで構成され、動的なプラスエンドと比較的安定したマイナス末端11,12を有する。プラス先端複合体および関連するエンド結合タンパク質の発見により、プラットフォームは微小管組織13を評価することができました。エンド結合タンパク質(EBP)は、微小管の成長プラス末端と一過性に関連付け、それらの関連ダイナミクスは、微小管原線維14、15の成長と相関している。微小管とのプラス先端複合体の頻繁な関連付けと解離のために、GFPタグ付きEBPの点広がり関数は、タイムラプスムービー15,16において「彗星」として現れる。哺乳類ニューロン16における先駆的な観察以来、蛍光タンパク質でタグ付けされた末端結合タンパク質は、異なるモデル系およびニューロンタイプ17、18、19、20、21、22、23の間で微小管ダイナミクスを決定するために使用されてきた。

その単純な神経系と透明な体のために 、C.エレガンス は 、開発中および生体内の再生中にニューロンのリモデリングを研究するための優れたモデルシステムであることが証明されています。ここでは 、C.エレガンス におけるタッチニューロンの発達と再生中の微小管ダイナミクスおよび成長を標識、画像化、分析する方法について説明する。遺伝的にコード化されたEBP-2:::GFPを用いて、PLMニューロン内の微小管を画像化し、このニューロン24の2つの異なる神経突起中の微小管の極性を決定することができた。この方法は、異なる細胞コンテキストにおける微小管ダイナミクスの尺度としてEBP彗星の観察および定量化を可能にする、例えば、奇方解術後に軸索再生を開始する微小管挙動の局所的変化は、我々のプロトコルを用いて評価することができる。このアッセイは、多様な細胞タイプおよび遺伝的背景における様々な細胞プロセスにおける微小管動力学の調節を調べることができる。

プロトコル

1. レポーター株:文化とメンテナンス

注:PLMニューロンの微小管のダイナミクスと向きを測定するために、我々はEBP-2を発現するワーム株を使用しました::GFPはタッチニューロン特異的プロモーター mec-4(juIs338アレーレ)18、25、26の下で。私たちは、この株27のための標準的なワームの培養とメンテナンス方法を使用しています。

  1. ネマトード成長培地(3.0 g/L塩化ナトリウム、2.5 g/Lペプトン、20.0 g/L寒天、10mg/Lコレステロール(10mg/mLのストック溶液から希釈)を水に調製し、混合物をオートクレーブします。
  2. 1 mM塩化カルシウム、1 mM硫酸マグネシウム、25.0 mMリン酸カリウム単塩基pH 6.0で補う前に、混合物を10〜15分間短時間冷却します。
  3. 滅菌ディスペンサーを使用して60mmペトリ皿に約9 mLの混合物を注ぎ、その後室温で保存し、1日の無菌条件で保存し、その後4°Cで貯蔵します。
  4. 50 mLのBブロス(5.0 g/L塩化ナトリウム、10.0 g/L Bacto-トリプトン)を準備し、オートクレーブと冷却してから 、大腸菌 の単一コロニー(OP50株)で接種します。
  5. 37°Cで12時間培養する。冷蔵されたNGMプレートを室温にして播種し、殺菌ガラススプレッダーを使用してOP50バクテリアのスミアをNGMプレートにします。
  6. 接種したNGMプレートを37°Cで12時間保ち 、C.エレガンスの培養のための細菌の芝生を形成することができます。これらのプレートは、使用されるまで20°Cインキュベーターに保存することができます。
  7. 播種されたNGMプレート上のトランスジェニック歪みを後に付けます。
  8. 炎にプラチナワイヤーピックを殺菌し、新しく播種されたプレートに転送するための20-25グラビッド大人の雌雄同体を選びます。
  9. 一度移した後、プレートを20°Cインキュベーターに1時間シフトします。次いで、これらのプレートから成人を抽出する。これらのプレートには、年齢に一致する卵が含まれるようになりました。
  10. プレートを20°Cインキュベーターに移して、飼育する際に、産卵後43.5時間でL4ステージが目的の発達段階に達するまで飼育します。より多くのワームのために、混雑を避けるために複数のプレートを後部。
  11. 望ましい発達段階では、これらのワームはEBP-2::GFP彗星のイメージングのためにマウントすることができる。

2. サンプル調製:EBP-2彗星のイメージング用ワームの取り付け

注:PLMニューロンのEBP彗星のライブ観察を可能にするために、我々はニューロンの生理学を損なうことなく、その移動性を最小限に抑えるためにアガロースパッドにワームを取り付けた。様々な固定化方法の中で、市販のポリスチレンビーズ溶液を0.1μm選択しました。EBP-2::GFP観測に用いられる取り付け手順について概説しました。

  1. 1x M9バッファー(0.02 M KH2PO 4、0.02 M Na2HPO4、0.008M NaCl、0.02 M NH4Cl)を炎上で5mLのガラス試験管で2mLで0.2gのアガロースを溶融して、10%アガロースの溶液を調製します。この試験管は使用まで溶融状態でアガロースを保つ加熱ブロックに容易に合うことができる。
  2. 広口ドロッパーを使用して、35 mm x 25 mmの寸法のきれいなガラススライドの上にこの溶融アガロースの滴(約100 μL)を分配する。
  3. 溶融状態の間、別のガラススライドでドロップを押して、ガラススライドの間にアガロースの薄膜を作成します。アガロースは、約30秒で厚さ約0.5〜1.0mmの膜として固化する。
  4. アガロースが固まったら、下のスライドを非支配的な手で、上のスライドを支配的な手で保持します。アガロースパッドが2つのスライドのいずれかにくっつい結果として、下のスライドを安定したまま上のスライドを反転させます。
  5. 形成されたアガロースパッドがカバースリップサイズ(18 mm x 18 mm)よりも大きい場合は、パッドの端をトリムして、カバースリップの適切な配置を確実にする必要な寸法を得ます。これらのアガロースパッドは、即時使用のためであり、保存されません。
  6. 湿った、取り付けに適した滑らかな表面のためにアガロースパッドを視覚的に検査します。アガロースパッドが空気にさらされて乾燥すると、アガロースパッドの表面がしわに見えます。このようなシナリオでは、このセクションの手順 2 ~ 6 で説明したように、新鮮なアガロース パッドを準備します。
  7. アガロースパッドに、0.1 μmポリスチレンビーズ溶液を取り付け媒体として2μLにします。
  8. プラチナワイヤーピックを使用して3〜4ワームを選び、シードされていないNGMプレートに移します。このプロセスは、取り付け時に固定化を妨げる表面細菌の除去を保証します。
  9. ワームが表面細菌から這い出したら、白金ワイヤーピックを使用して取り付けるためにそれらを拾い、アガロースパッド上のポリスチレンビーズのドロップでそれらを再中断します。
  10. 慎重に、ワームの上に18ミリメートル×18ミリメートルのカバースリップを置きます。マウントされたワームの回避を防ぐために、配置後にカバースリップを移動しないでください。
  11. 準備したスライドを顕微鏡に取り付けてイメージングします。

3. イメージングの設定と取得

注:EBP彗星は、C.エレガンス16、18の哺乳類およびPLMニューロンで観察された0.22 μm/sの概速度で移動します。ナイキスト基準28に従ってタイムラプス取得でイベントを最適にサンプリングするには、それぞれ0.09 μmと0.43sの空間的スケールと時間スケールが必要です。光毒性や光の消光を防止するために、スピニングディスクの取得を使用しました。イメージングの設定と取得の設定については、以下で説明します。

  1. 回転するディスクユニットとカメラを搭載した反転顕微鏡を使用して画像をキャプチャします。製造元の指示に従ってセットアップをオンにします。
  2. セットアップを制御するソフトウェアをオンにします。
  3. これは逆の顕微鏡であるため、カバースリップを下に向けて低倍率の目的(5xまたは10倍)でステージ上に取り付けられたワームとスライドを置きます。
  4. 透過光用のハロゲンランプからの照明と、反射光用の水銀アーク灯を用いた目や可視モードへの光路を設定します。
  5. 明視野の下のビューフィールドにワームを集中して中央に配置します。
  6. 浸漬油を入れて、63倍(1.4NA/オイル)に倍率を変更し、PLMニューロンの明視野でワームテールを再び焦点を合わせます。
  7. PLMニューロンの短時間の再焦点を合わせるための水銀アークランプの蛍光をオンにします。GFP の可視化のためにライト パスに正しい反射器(AF488)のセットを置きます。
  8. カメラに光路を向けて、カメラの取得に顕微鏡を設定します。
    注:顕微鏡の薄膜トランジスタ(TFT)スクリーンを介して上記のステップ4-7を制御することは速く、照明への不必要な露出を防ぐ。あるいは、ソフトウェアを介して照明、反射器を制御する。
  9. ビューフィールドでPLMニューロンの焦点を合わせた後、ソフトウェアインターフェースで、電子乗算(EM)ゲイン値70でカメラの30%のパワーと300 ms露光を有する488 nmレーザーの照明を選択します。レポーターの式に応じて、必要に応じてこれらのパラメータを変更します。設定を後続のイメージング セッションの構成として保存します。
  10. [ チャンネル ]タブには、特定の照明とカメラ設定を含むトラックがそれぞれ保存されます。ハイライト表示されたトラックではライブビジュアライゼーションが可能ですが、画像を取得するにはトラックをチェックする必要があります。ワークスペース内のワームの尾部をライブで視覚化するために、明視野(DIC)でチャネルをハイライト表示します。サンプルは、ワークスペースのライブイメージングウィンドウに焦点を合わせ、中央に配置します。
  11. 488 nmレーザー励起でチャンネルをハイライトし、ライブイメージングウィンドウでPLMニューロンを素早く焦点を合わせます。フォーカスが設定されたら、次のステップで説明したように時系列パラメータを設定して、タイムラプス取得を開始します。
  12. 488 nmレーザー照明を使用して、2分間の時系列で、フレーム間の時間間隔を設けずに実験を行います。画像取得の時間スケールを維持するために、我々は唯一のGFP蛍光を獲得しました。
  13. [実験の開始] タブを使用して、取得を開始します。63倍の倍率を使用すると、空間解像度が0.09 μmのピクセルサイズでカメラでサンプリングされる0.21 μmに制限されます。3.3 フレーム/s でタイムラプスを取得し、イベントを最適にサンプリングします。タイムラプス画像は、2分の期間にわたって取得された396の時間枠を持っていました。取得後、デフォルトのフォーマットでイメージを保存し、後でデフォルトのソフトウェアまたは ImageJ でアクセスできます。

4. 観察・分析

  1. デフォルトのソフトウェアでタイムラプス取得をプレビューするか、Bioformats プラグインを使用してイメージ J で開きます。
    注: 画像解析のプロセスについては、イメージ J で説明しました。
  2. ImageJ にバイオフォーマット プラグインをインストールします。
    1. または、ImageJ でのファイル互換性のために、デフォルトのフォーマット ファイルを .tif にエクスポートします。ZEN2でエクスポート機能を使用すると、イメージの個々のフレームが個別の.tifファイルとして出力されます。大量のファイルの生成を防ぐため、この方法は避けます。
  3. '.czi' 形式の画像を'Bioformats' プラグインを使用してイメージ J で直接開きます。イメージがマルチイメージ スタックとして開きます。デフォルトソフトウェアの「エクスポート」機能を使用する場合は、ImageJで次のワークフローを使用してイメージをマルチイメージスタックとして再構成します: ImageJプログラム>イメージメニュー>スタックサブメニュー>スタックにイメージをスタックします。
  4. イメージ ウィンドウの左下隅にある 再生 アイコンを使用して、イメージをムービーとしてプレビューします。彗星は、細胞体およびPLMニューロンのプロセスにおける明るい移動性パンクテエと見なすことができる。彗星がはっきりと見える場合は、手順 8 に進み、このセクションの手順 5 ~ 7 に進みます。
  5. ルックアップ テーブル (LUT) を使用してイメージのカラー プロファイルをグレースケール イメージに変換します: ImageJ プログラム > イメージ メニュー>参照テーブルサブメニュー> [グレーを選択]を選択します。
  6. イメージの LUT プロファイルを反転して簡単に視覚化する: ImageJ プログラム > イメージ メニュー>参照テーブル サブメニュー> LUT を反転します。
  7. 彗星を見るための画像の明るさとコントラストを調整する :ImageJプログラム>画像メニュー>[明るさ/コントラスト>調整]サブメニューを調整します。
    1. イメージ全体で希望する強度のスケーリングのために 、[最小]、[最大値]、[明るさ]、 および [コントラスト] のスライダを移動します。彗星がはっきりと見える画像を定量化しました。
  8. ImageJ の基本バージョンには、スタートアップ ツールがアイコンで表されています。線のあるアイコンを見つけて右クリックし、ドロップダウンメニューを開き、 セグメント線を選択します。ニューロンの細胞体上またはその近くに原点を持つ対象領域(ROI)上にセグメント化線を描画します。
    1. 後で考慮する場合は、次のワークフローを使用して、ROI マネージャを介してセグメント線の ROI を保存します > > > > > >。
  9. キモグラフを生成する前に、空間的スケールと時間スケールが異なるようにスケーリングを削除し、次の値を使用してピクセル単位で測定値を取得します。
    ImageJ >分析>スケールを設定> クリックしてスケールを削除>OK。
  10. [イメージ>スタック] ドロップダウンメニューの下にある再スライス機能を使用して、カイモグラフを生成します。キモグラフは、セグメント化されたROIを時間で表したものです。横軸は距離を表し、縦軸は時間を表します。斜めのトレースは、移動する彗星を表します。一般的に、キモグラフは、対角線トレースの視覚化のために前の手順 5 から 6 で説明したように、画像のカラープロファイルを使用します。
  11. 線ツールのドロップダウンメニューの 直線 関数(このセクションのステップ9を参照)を使用して、対角線の各トレースの上に直線を描き、ROIマネージャに追加します。
  12. [ 解析 ]タブで、[ 測定の設定] に移動し、トレースを測定するための 平均強度 と 外接矩形 パラメータを選択します。
  13. ROI マネージャ ウィンドウで[ メジャー] をクリックすると、[結果]ウィンドウが開き、ROI の平均強度、ライン トレースの X 座標と Y 座標、線のトレースの幅、高さ、角度、長さが表示されます。このウィンドウは、.csv形式で保存し、後でデータ分析プログラムにインポートすることができます。
  14. スプレッドシート プログラムでは、結果ウィンドウが開き、値が行と列に分散されます。関連する値は、トレースの幅、高さ、角度です。幅はトレースの変位を与え、高さは持続時間を与え、角度はベクトルを表します。幅と高さの値はピクセル単位で表され、空間的スケールと時間スケールをそれぞれ乗算して、標準の測定可能なパラメーターを取得します。
  15. キモグラフの左側は細胞体に近いため、角度に応じて彗星をプラスエンドアウトまたはマイナスエンドアウト(すなわち、細胞体から離れた、または細胞体に向かって)に分類する。1°~-89°~-91°~-179°の角度をプラスエンドアウトとマイナスエンドアウトとしてそれぞれ分類します。複数のカイモグラフのデータを、1 つのスプレッドシートで照合して、調査用に統計的に表現します。

結果

代表的な例として、PLMニューロンの定常状態および再生軸索におけるEBP彗星のインビボ観察について説明した。PLMニューロンは、シナプスと短い後工程を形成する長い前工程を有するワームの尾領域に位置する。PLMニューロンは表皮に近い前部後方向に成長し、ワームの穏やかな接触感覚を担う。PLMニューロンは、その構造が単純化され、イメージングとマイクロサージャリーに対する無分?...

ディスカッション

微小管ダイナミクスを理解することは、長年にわたって細胞骨格研究の分野で重要な焦点となっています。微小管は、動的不安定性44、45、46、47の連続的なプロセスと共に核形成および大惨事を起こす。この情報の多くは、遊離対重合チューブリンの光散乱読み出し、蛍光チ...

開示事項

著者らは利益相反を宣言しない。

謝辞

私たちは、初期のサポートと研究で使用される緊張のためにイーシ・ジンとアンドリュー・チザムに感謝します。細菌株OP50は、研究インフラプログラムのNIH事務所(P40 OD010440)が資金を提供するカエノハブディティス遺伝学センター(CGC)から商業的に利用されました。また、実験手順の標準化に対するダルメンドラ・プリに感謝します。この研究は、国立脳研究センター(インドのバイオテクノロジー省、インド政府の支援)、DBT/ウェルカム・トラスト・インディア・アライアンス早期キャリア・グラント(グラント#IA/E/18/1/504331)のS.D.、ウェルカム・トラストDBTインド同盟中間助成金(グラント#IA/I/13/1/500874)のコアグラントによって資金提供されています。 CRG/2019/002194) から A.G.-R へ。

資料

NameCompanyCatalog NumberComments
CZ18975 worm strainYishi Jin labCZ18975Generated by Anindya Ghosh-Roy
AgaroseSigmaA9539Mounting worms
Coverslip (18 mm x 18 mm)Zeiss474030-9010-000Mounting worms
Dry bath with heating blockNeolabMounting worms
Glass slides (35 mm x 25 mm)Blue StarMounting worms
Polystyrene bead solution (4.55 x 10^13 particles/ml in aqueous medium with minimal surfactant)Polysciences Inc.00876Mounting worms
Test tubesMounting worms
OP50 bacterial strainCaenorhabditis Genetics Center (CGC)OP50Worm handling
60mm petri platesPraveen Scientific20440Worm handling
Aspirator/CapillaryVWR53432-921Worm handling
IncubatorPanasonicMIR554EWorm handling
Platinum wireWorm handling
Stereomicroscope with fluorescence attachmentLeicaM165FCWorm handling
0.3% Sodium ChlorideSigma71376Nematode Growth Medium
0.25% PeptoneT M Media1506Nematode Growth Medium
10mg/mL CholesterolSigmaC8667Nematode Growth Medium
1mM Calcium chloride dihydrateSigma223506Nematode Growth Medium
1mM Magnesium sulphate heptahydrateSigmaM2773Nematode Growth Medium
2% AgarT M Media1202Nematode Growth Medium
25mM Monobasic Potassium dihydrogen phosphateSigmaP9791Nematode Growth Medium
0.1M Monobasic Potassium dihydrogen phosphateSigmaP97911X M9 buffer
0.04M Sodium chlorideSigma713761X M9 buffer
0.1M Ammonium chlorideFisher Scientific214051X M9 buffer
0.2M Dibasic Disodium hydrogen phosphate heptahydrateSigmaS93901X M9 buffer
Glass bottlesBorosilBuffer storage
488 nm laserZeissImaging
5X objectiveZeissImaging
63X objectiveZeissImaging
CameraPhotometricsEvolve 512 DeltaImaging
Computer system for Spinning Disk unitHPIntel ® Xeon CPU E5-2623 3.00GHzImaging
Epifluorescence microscopeZeissObserver.Z1Imaging
Halogen lampZeissImaging
Mercury Arc LampZeissImaging
Spinning Disk UnitYokogawaCSU-X1Imaging
ZEN2 softwareZeissImaging
Image J (Fiji Version)Image analysis and processing
Adobe Creative CloudAdobeImage analysis and processing
Computer system for Image AnalysisDellIntel ® Core ™ i7-9700 CPU 3.00GHzImage processing/Representation

参考文献

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