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Resumo

Foi apresentado um protocolo para a imagem dos microtúbulos dinâmicos in vivo usando proteína de ligação final rotulada fluorescente. Descrevemos os métodos para rotular, imagem e analisar os microtúbulos dinâmicos no neurônio de microtúbulo lateral posterior (PLM) de C. elegans.

Resumo

Nos neurônios, a orientação dos microtúbulos tem sido um dos principais assessores para identificar axônios que têm microtúbulos e dendritos que geralmente têm orientação mista. Aqui descrevemos métodos para rotular, imagem e analisar a dinâmica e crescimento de microtúbulos durante o desenvolvimento e regeneração de neurônios sensíveis ao toque em C. elegans. Usando repórteres fluorescentes geneticamente codificados de pontas de microtúbulos, nós imagemmos os microtúbulos axonais. As mudanças locais no comportamento dos microtúbulos que iniciam a regeneração do axônio após a axotomia podem ser quantificadas usando este protocolo. Este ensaio é adaptável a outros neurônios e origens genéticas para investigar a regulação da dinâmica dos microtúbulos em vários processos celulares.

Introdução

Os neurônios possuem uma arquitetura elaborada com compartimentos especializados como dendritos, corpos celulares, axônios e sinapses. O citoesqueleto neuronal é constituído dos microtúbulos, microfilamentos e neurofilamentos e sua organização distinta suporta os compartimentos neuronais estrutural e funcionalmente1,2,3,4,5,6,7,8,9,10 . Ao longo dos anos, a organização dos microtúbulos foi identificada como um determinante chave da polaridade e função neuronal. À medida que os neurônios passam por remodelação estrutural durante o desenvolvimento ou regeneração, a dinâmica e orientação do microtúbulo determinam a identidade, o transporte polarizado, o crescimento e o desenvolvimento de vários compartimentos neuronais7. É, portanto, imperativo avaliar a dinâmica e orientação do microtúbulo in vivo para se correlacionar com o processo de remodelação neuronal.

Microtúbulos são compostos de perfis de α e β heterodimers tubulin com extremidades dinâmicas mais e extremidades relativamente estáveis menos11,12. A descoberta das proteínas de ligação final do complexo plus tip e associadas permitiu que uma plataforma avaliasse a organização dos microtúbulos13. As proteínas de ligação final (EBP) associam-se transitoriamente com as extremidades crescentes mais do microtúbulo e sua dinâmica de associação estão correlacionadas com o crescimento dos perfis de microtúbulos14,15. Devido à frequente associação e dissociação do complexo de pontas plus com o microtúbulo, a função de propagação de ponto do EBP marcado por GFP aparece como um "cometa" em um filme timelapse15,16. Desde a observação pioneira nos neurônios mamíferos16, proteínas de ligação final marcadas com proteínas fluorescentes têm sido utilizadas para determinar a dinâmica dos microtúbulos em diferentes sistemas modelo e tipos de neurônios17,18,19,20,21,22,23.

Devido ao seu simples sistema nervoso e corpo transparente, C. elegans provou ser um excelente sistema modelo para estudar a remodelagem neuronal durante o desenvolvimento e regeneração in vivo. Aqui descrevemos métodos para rotular, imagem e analisar a dinâmica e crescimento de microtúbulos durante o desenvolvimento e regeneração de neurônios sensíveis ao toque em C. elegans. Usando EBP-2::GFP geneticamente codificado, nós imagemmos os microtúbulos no neurônio PLM, o que nos permitiu determinar a polaridade dos microtúbulos em dois neurites diferentes deste neurônio24. Este método permite a observação e quantificação dos cometas EBP como medida da dinâmica dos microtúbulos em diferentes contextos celulares, por exemplo, as mudanças locais no comportamento dos microtúbulos que iniciam a regeneração do axônio após a axotomia podem ser avaliadas usando nosso protocolo. Este ensaio pode ser adaptado para investigar a regulação da dinâmica dos microtúbulos em diversos processos celulares em diversos tipos celulares e origens genéticas.

Protocolo

1. Tensão repórter: Cultura e manutenção

NOTA: Para medir a dinâmica e orientação do microtúbulo nos neurônios PLM, utilizou-se a cepa de verme expressando EBP-2::GFP sob o neurônio de toque promotor específico mec-4 (juIs338 alelo)18,25,26. Usamos a cultura padrão de vermes e métodos de manutenção para esta cepa27.

  1. Prepare o ágar de crescimento nematode (3,0 g/L cloreto de sódio, 2,5 g/L peptone, 20,0 g/L de ágar, 10 mg/L de colesterol (diluído de uma solução de estoque de 10 mg/mL)) na água e autoclave a mistura.
  2. Esfrie a mistura brevemente por 10-15 min antes de suplementá-la com cloreto de cálcio de 1 mM, sulfato de magnésio de 1 mM e 25,0 mM de fosfato de potássio pH 6.0.
  3. Despeje cerca de 9 mL da mistura em placas de Petri de 60 mm usando um dispensador estéril seguido de armazenamento à temperatura ambiente e condições estéreis por um dia e armazenamento subsequente a 4 °C.
  4. Prepare 50 mL de Caldo B (cloreto de sódio 5.0 g/L, 10,0 g/L Bacto-Tryptone), autoclave e esfrie-o antes de inocular com uma única colônia de Escherichia coli (cepa OP50).
  5. Cultue a bactéria a 37 °C durante 12 horas. Leve as placas de NGM refrigerados à temperatura ambiente para semeadura e usando um espalhador de vidro esterilizado faça uma mancha de bactérias OP50 na placa NGM.
  6. Mantenha as placas de NGM inoculadas a 37 °C durante 12 horas, o que permitirá a formação de um gramado bacteriano para a colheita de C. elegans. Estas placas podem ser armazenadas em uma incubadora de 20 °C até o uso.
  7. Guarde a cepa transgênica nas placas de NGM semeadas.
  8. Esterilize uma pega de fio de platina na chama e escolha 20-25 hermafroditas adultas gravid para transferência para uma placa recém-semeada.
  9. Uma vez transferida, mude a placa para uma incubadora de 20 °C por 1h. Então, extraia os adultos dessas placas. Essas placas agora conterão ovos que são combinados com a idade.
  10. Deslocar as placas para a incubadora de 20 °C para criação até chegar ao estágio de desenvolvimento de interesse que, neste caso, é o estágio L4 a 43,5 horas após a colocação de ovos. Para mais vermes, vire várias placas para evitar aglomeração.
  11. No estágio de desenvolvimento desejado, esses worms podem ser montados para imagens dos cometas EBP-2::GFP.

2. Preparação da amostra: Montagem de vermes para imagens de cometas EBP-2

NOTA: Para permitir a observação ao vivo dos cometas EBP nos neurônios PLM, montamos os vermes em almofadas de agarose para minimizar sua mobilidade, sem comprometer a fisiologia do neurônio. Entre os vários métodos de imobilização, optamos por uma solução de contas de poliestireno de 0,1 μm prontamente disponível comercialmente. Delineamos o procedimento de montagem utilizado especificamente para observação EBP-2::GFP.

  1. Prepare uma solução de 10% de agarose derretendo 0,2 g de agarose em 2 mL de tampão 1x M9 (0,02 M KH2PO4, 0,02 M Na2HPO4, 0,008 M NaCl, 0,02 M NH4Cl) em um tubo de teste de vidro de 5 mL sobre uma chama. Este tubo de ensaio pode facilmente caber em um bloco de aquecimento que mantém a agarose no estado derretido até o uso.
  2. Usando um porta-voz de boca larga, dispense uma gota (cerca de 100 μL) desta agarose derretida sobre um escorregador de vidro limpo de dimensões de 35 mm x 25 mm.
  3. Enquanto estiver no estado derretido, pressione a queda com outra lâmina de vidro para criar uma fina película da agarose entre os slides de vidro. A agarose solidifica-se como um filme de cerca de 0,5 - 1,0 mm de espessura em cerca de 30 segundos.
  4. Uma vez que a agarose se solidificar, segure o slide inferior na mão não dominante e o slide superior na mão dominante. Vire o slide superior enquanto segura o slide inferior estável como resultado do qual a almofada agarose gruda em um dos dois slides.
  5. Se a almofada de agarose formada for maior que o tamanho do deslizamento de tampa (18 mm x 18 mm), então corte as bordas da almofada para obter as dimensões necessárias para garantir a colocação adequada do deslizamento de tampas. Estas almofadas agarose são para uso imediato e não devem ser armazenadas.
  6. Inspecione visualmente a almofada de ágarose para uma superfície lisa que seja úmida e adequada para montagem. Se a almofada de agarose for exposta ao ar e se tornar seca, a superfície da almofada agarose parece enrugada. Em tal cenário, prepare-se novo bloco de agarose, como mencionado nas etapas 2-6 desta seção.
  7. Na almofada de agarose, coloque 2 μL de 0,1 μm de solução de contas de poliestireno como o meio de montagem.
  8. Escolha 3-4 worms usando uma picareta de fio de platina e mude-os para uma placa NGM não semeada. Esse processo garante a remoção de bactérias superficiais que dificultam a imobilização durante a montagem.
  9. Uma vez que os vermes rastejam para fora de suas bactérias superficiais, pegue-os para montagem usando uma palheira de fio de platina e resuspensá-los na gota de contas de poliestireno na almofada de agarose.
  10. Com cuidado, coloque uma tampa de 18 mm x 18 mm nos vermes. Para evitar a evisceração dos vermes montados, não mova a mancha de cobertura após a colocação.
  11. Monte o slide preparado no microscópio para imagens.

3. Configuração e aquisição de imagens

NOTA: Os cometas EBP viajam com uma velocidade aproximada de 0,22 μm/s, como observado nos neurônios mamíferos e PLM de C. elegans16,18. Para melhor amostrar os eventos em uma aquisição de lapso de tempo conforme os critérios de Nyquist28, são necessárias escalas espaciais e temporais de 0,09 μm e 0,43 s, respectivamente. Para a prevenção da fototoxicidade ou fotobleaching, utilizamos a aquisição do Spinning Disk. Descrevemos nossas configurações de configuração e aquisição de imagens abaixo.

  1. Capture as imagens usando um microscópio invertido equipado com uma unidade de disco giratório e câmera. Ligue a configuração de acordo com as instruções do fabricante.
  2. Ligue o software que controla a configuração.
  3. Como se trata de um microscópio invertido, coloque o slide com os vermes montados no palco com um objetivo de baixa ampliação (5x ou 10x) com o deslizamento voltado para baixo.
  4. Configure o caminho da luz para o modo olho ou visível que usa iluminação da lâmpada halógena para luz transmitida e lâmpada de arco de mercúrio para a luz refletida.
  5. Concentre-se e centralize um verme no campo de visão sob o campo brilhante.
  6. Coloque o óleo de imersão e mude a ampliação para 63x (1.4NA/Óleo) e reconcentre a cauda do verme no campo brilhante para os neurônios PLM.
  7. Ligue a fluorescência da lâmpada do arco de mercúrio para um breve refoco dos neurônios PLM. Coloque o conjunto correto de refletores (AF488) no caminho da luz para a visualização do GFP.
  8. Ajuste o microscópio para a aquisição da câmera direcionando o caminho da luz para a câmera.
    NOTA: Controlar as etapas acima mencionadas 4-7 através da tela Thin Film Transistor (TFT) do microscópio é rápido e evita exposição desnecessária à iluminação. Alternativamente, controle a iluminação, refletor através do software.
  9. Após o foco do neurônio PLM no campo de visão, na interface de software selecione a iluminação de laser de 488 nm com 30% de potência e exposição de 300 ms para a câmera com Multiplicação eletrônica (EM) ganham valor 70. Dependendo da expressão do repórter, varie esses parâmetros conforme necessário. Armazene as configurações como configuração para sessões de imagem subsequentes.
  10. A guia Canais armazena as faixas cada uma com uma iluminação específica e configuração da câmera. A faixa destacada permite uma visualização ao vivo, enquanto para adquirir uma imagem a faixa precisa ser marcada. Destaque um canal com brightfield (DIC) para visualização ao vivo da cauda do worm no espaço de trabalho. A amostra é focada e centrada na janela de imagem ao vivo do espaço de trabalho.
  11. Destaque o canal com excitação a laser de 488 nm para um rápido foco do neurônio PLM na janela de imagem ao vivo. Uma vez focado, inicie a aquisição do lapso de tempo definindo os parâmetros da série de tempo como mencionado na próxima etapa.
  12. Usando iluminação laser de 488 nm, configure um experimento com séries temporais por 2 minutos e sem intervalo de tempo entre os quadros. Para manter as escalas temporais de aquisição de imagens, só adquirimos fluorescência GFP.
  13. Usando a guia Iniciar experiência, inicie a aquisição. O uso de uma ampliação de 63x restringe a resolução espacial a 0,21 μm, que é amostrada pela câmera no tamanho do pixel de 0,09 μm. Adquira um lapso de tempo a 3,3 quadros/s para melhor amostrar o evento. A imagem do lapso de tempo teve 396 períodos de tempo adquiridos ao longo de uma duração de 2 minutos. Após a aquisição, salve a imagem no formato padrão, que pode ser acessada posteriormente pelo software padrão ou ImageJ.

4. Observação e análise

  1. Visualize a aquisição do timelapse no software padrão ou abra-o na Imagem J através de seu plug-in Bioformats.
    NOTA: Descrevemos o processo de análise de imagem na Imagem J.
  2. Instale o Plug-in Bioformats ImageJ.
    1. Alternativamente, exporte o arquivo de formato padrão para .tif para compatibilidade de arquivos no ImageJ. A função de exportação no ZEN2 resulta em quadros individuais da imagem como arquivos .tif discretos. Evitamos este método para evitar a formação de um grande número de arquivos.
  3. Abra a imagem no formato '.czi' diretamente na Imagem J através de seu plugin 'Bioformats'. A imagem se abre como uma pilha de várias imagens. Se usar a função "exportar" do software padrão, reconstitua as imagens como uma pilha de várias imagens usando o seguinte fluxo de trabalho em ImageJ: ImageJ Program > Image Menu > Stacks Submenu > Images To Stack.
  4. Visualize a imagem como um filme usando o ícone Reproduzir no canto inferior esquerdo da janela de imagem. Os cometas podem ser vistos como punctae móvel brilhante no corpo celular e processos do neurônio PLM. Se os cometas estiverem visíveis claramente, siga a etapa 8 de outra forma siga os passos 5-7 desta seção.
  5. Converta o perfil de cor da imagem usando o Visualup Table (LUT) em uma imagem em escala de cinza: Programa ImageJ > menu de imagem > Tabelas de Procurar submenu > Selecionar cinzas.
  6. Inverter o perfil LUT da imagem para fácil visualização: Programa ImageJ > menu imagem > Tabelas de Procura submenu > Invert LUT.
  7. Ajuste o brilho e o contraste da imagem para ver os cometas: Programa ImageJ > Menu de imagem > Ajuste submenu > Brilho/Contraste.
    1. Mova os controles deslizantes de Mínimo, Máximo, Brilho e Contraste para o dimensionamento desejado das intensidades através da imagem. Quantificamos as imagens com cometas visíveis distintamente.
  8. A versão básica do ImageJ tem ferramentas de inicialização representadas como ícones. Localize e clique com o botão direito do mouse no ícone com uma linha para abrir um menu suspenso e selecione a linha Segmentada. Desenhe a linha segmentada nas regiões de interesse (ROI) com sua origem sobre ou perto do corpo celular do neurônio.
    1. Para considerações posteriores, salve o ROI de linha segmentado através do gerenciador de ROI usando o seguinte fluxo de trabalho: ImageJ > Analyze > Tools > o gerenciador de ROI > Selecione o traço desenhado na imagem e clique em Adicionar na janela do gerenciador de ROI > Mais na janela do gerenciador de ROI > Salvar.
  9. Antes de gerar o kymógrafo, como as escalas espaciais e temporais são diferentes remova o dimensionamento para obter as medições em pixels usando o seguinte:
    ImageJ > Analisar > escala de conjunto > Clique para remover a escala > Ok.
  10. Usando a função Reslice sob o menu suspenso Image > Stacks, gere um kymograph. O kymograph é uma representação do ROI segmentado no tempo. O eixo horizontal representa a distância e o eixo vertical representa o tempo. Os traços diagonais representam os cometas em movimento. Geralmente, o kymograph leva o perfil de cor da imagem de outra forma atribuir um perfil de cor como descrito nas etapas anteriores 5-6 para a visualização dos traços diagonais.
  11. Usando a função Linha reta no menu suspenso da ferramenta Linha (consulte a etapa 9 desta seção) desenhe linhas retas sobre cada um dos traços diagonais e apte-as no gerenciador de ROI.
  12. Na guia Analisar, vá para Definir medidas e selecione parâmetros de intensidade média e retângulo delimitante para medir os traços.
  13. Na janela gerenciador do ROI, clique em Medir qual abrirá uma janela Result que produzirá a intensidade média do ROI, as coordenadas X e Y dos traços de linha, Largura, Altura, Ângulo e Comprimento dos traços da linha. Esta janela pode ser salva como um formato .csv e posteriormente importada em um programa de análise de dados.
  14. No programa de planilhas, a janela de resultados se abre com os valores distribuídos em linhas e colunas. Os valores relevantes são a largura, altura e ângulo dos traços. A largura dá o deslocamento do traço, a altura dá a duração e o ângulo representa o vetor. Como os valores de largura e altura estão em pixels, multiplique-os com as escalas espacial e temporal, respectivamente, para a obtenção dos parâmetros mensuráveis padrão.
  15. Como o lado esquerdo do kymógrafo é proximal ao corpo celular, dependendo do ângulo, classifique os cometas em plus-end-out ou menos-end-out (ou seja, longe do corpo celular ou em direção ao corpo celular, respectivamente). Classifique ângulos entre 1° a -89° e -91° a -179° como plus-end-out e menos-end-out, respectivamente. Coleto dados de vários kymogramas em uma planilha para um estudo e representa estatisticamente.

Resultados

Como exemplo representativo, descrevemos a observação in vivo dos cometas EBP nos axônios de estado estável e regeneradores dos neurônios PLM. Os neurônios PLM estão localizados na região da cauda do verme com um longo processo anterior que forma uma sinapse e um processo posterior curto. Os neurônios PLM crescem na direção anterior-posterior perto da epiderme e são responsáveis pela sensação de toque suave nos vermes. Devido à sua estrutura simplificada, e à comodidade à imagem e à microcirurgia, os n...

Discussão

A compreensão da dinâmica dos microtúbulos tem sido um foco fundamental no campo da pesquisa citoesquelletal ao longo dos anos. Microtúbulos sofrem nucleação e catástrofe, juntamente com um processo contínuo de instabilidade dinâmica44,45,46,47. Grande parte dessas informações foi obtida através de ensaios in vitro, como leituras de dispersão de luz de ...

Divulgações

Os autores não declaram conflitos de interesse.

Agradecimentos

Agradecemos a Yishi Jin e Andrew Chisholm pelo apoio inicial e pela tensão usada no estudo. A cepa bacteriana OP50 foi comercializada do Centro de Genética de Caenorhabditis (CGC) financiado pelo NIH Office of Research Infrastructure Programs (P40 OD010440). Agradecemos também a Dharmendra Puri pela padronização dos procedimentos experimentais. O estudo é financiado pela bolsa central do Centro Nacional de Pesquisa Cerebral (apoiado pelo Departamento de Biotecnologia, Govt. of India), DBT/Wellcome Trust India Alliance Early Career Grant (Grant # IA/E/18/1/504331) para S.D., Wellcome Trust-DBT India Alliance Intermediate Grant (Grant # IA/I/13/1/500874) para A.G.-R e uma bolsa do Conselho de Pesquisa em Ciência e Engenharia (SERB: CRG/2019/002194) para A.G.-R.

Materiais

NameCompanyCatalog NumberComments
CZ18975 worm strainYishi Jin labCZ18975Generated by Anindya Ghosh-Roy
AgaroseSigmaA9539Mounting worms
Coverslip (18 mm x 18 mm)Zeiss474030-9010-000Mounting worms
Dry bath with heating blockNeolabMounting worms
Glass slides (35 mm x 25 mm)Blue StarMounting worms
Polystyrene bead solution (4.55 x 10^13 particles/ml in aqueous medium with minimal surfactant)Polysciences Inc.00876Mounting worms
Test tubesMounting worms
OP50 bacterial strainCaenorhabditis Genetics Center (CGC)OP50Worm handling
60mm petri platesPraveen Scientific20440Worm handling
Aspirator/CapillaryVWR53432-921Worm handling
IncubatorPanasonicMIR554EWorm handling
Platinum wireWorm handling
Stereomicroscope with fluorescence attachmentLeicaM165FCWorm handling
0.3% Sodium ChlorideSigma71376Nematode Growth Medium
0.25% PeptoneT M Media1506Nematode Growth Medium
10mg/mL CholesterolSigmaC8667Nematode Growth Medium
1mM Calcium chloride dihydrateSigma223506Nematode Growth Medium
1mM Magnesium sulphate heptahydrateSigmaM2773Nematode Growth Medium
2% AgarT M Media1202Nematode Growth Medium
25mM Monobasic Potassium dihydrogen phosphateSigmaP9791Nematode Growth Medium
0.1M Monobasic Potassium dihydrogen phosphateSigmaP97911X M9 buffer
0.04M Sodium chlorideSigma713761X M9 buffer
0.1M Ammonium chlorideFisher Scientific214051X M9 buffer
0.2M Dibasic Disodium hydrogen phosphate heptahydrateSigmaS93901X M9 buffer
Glass bottlesBorosilBuffer storage
488 nm laserZeissImaging
5X objectiveZeissImaging
63X objectiveZeissImaging
CameraPhotometricsEvolve 512 DeltaImaging
Computer system for Spinning Disk unitHPIntel ® Xeon CPU E5-2623 3.00GHzImaging
Epifluorescence microscopeZeissObserver.Z1Imaging
Halogen lampZeissImaging
Mercury Arc LampZeissImaging
Spinning Disk UnitYokogawaCSU-X1Imaging
ZEN2 softwareZeissImaging
Image J (Fiji Version)Image analysis and processing
Adobe Creative CloudAdobeImage analysis and processing
Computer system for Image AnalysisDellIntel ® Core ™ i7-9700 CPU 3.00GHzImage processing/Representation

Referências

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