JoVE Logo
Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • النتائج
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

إن التكوير في كل مكان هو تعديل حاسم للبروتين بعد الترجمه ، وقد تورط خلل التنظيم في العديد من الأمراض البشرية. هذا البروتوكول تفاصيل كيف يمكن استخدام عرض phage لعزل المتغيرات في كل مكان الرواية التي يمكن ربط وتعديل نشاط ليجار E3 التي تتحكم في خصوصية وكفاءة وأنماط في كل مكان.

Abstract

يوبيكيتين هو بروتين صغير 8.6 كدا الذي هو عنصر أساسي في نظام ubiquitin-proteasome. وبالتالي، فإنه يمكن ربط لمجموعة متنوعة من البروتينات مع خصوصية عالية ولكن تقارب منخفض. من خلال عرض phage ، يمكن هندسة متغيرات Ubiquitin (UbVs) بحيث تظهر تقاربا محسنا على النمط البري في كل مكان وتحافظ على خصوصية ملزمة لاستهداف البروتينات. تستخدم شاشة Phage مكتبة phagemid ، حيث يتم دمج بروتين معطف pIII من البكتيريا M13 الخيطية (التي تم اختيارها لأنه يتم عرضها خارجيا على سطح phage) مع UbVs. المخلفات المحددة من النمط البري البشري في كل مكان لينة وعشوائية (أي، هناك تحيز نحو تسلسل النمط البري الأصلي) لتوليد UbVs بحيث يتم تجنب التغييرات الضارة في تشكيل البروتين مع إدخال التنوع اللازم لتعزيز التفاعلات الجديدة مع البروتين المستهدف. خلال عملية عرض phage ، يتم التعبير عن هذه UbVs وعرضها على بروتينات معطف phage ويتم تحريكها مقابل بروتين مهم. يتم الاحتفاظ UbVs التي تظهر التفاعلات ملزمة مواتية مع البروتين المستهدف، في حين يتم غسلها المجلدات الفقراء بعيدا وإزالتها من بركة المكتبة. يتم إعادة تركيب المركبات المحتفظ بها ، والتي ترتبط بجسيمات الفياج التي تحتوي على الفاجم المقابل ل UbV ، وتضخيمها وتركيزها بحيث يمكن تحريكها ضد نفس البروتين المستهدف في جولة أخرى من عرض phage. عادة، يتم تنفيذ ما يصل إلى خمس جولات من عرض phage، خلالها يتم فرض ضغط اختيار قوي ضد UbVs التي تربط ضعيفة و / أو مشوش بحيث يتم تركيز أولئك الذين لديهم تقارب أعلى وإثراء. في نهاية المطاف، يتم عزل UbVs التي تثبت خصوصية أعلى و / أو تقارب للبروتين المستهدف من نظرائهم من النوع البري ويمكن وصفها من خلال مزيد من التجارب.

Introduction

إن فهم التفاصيل الجزيئية للتفاعلات بين البروتين والبروتين أمر بالغ الأهمية لتحديد آليات نقل الإشارات للعمليات البيولوجية، وخاصة تلك التي تساهم في الأمراض المهمة سريريا. في السنوات الأخيرة، تم استخدام عرض phage كطريقة عملية ويمكن الوصول إليها لعزل البروتينات / الببتيدات مع ربط محسنة كثيرا إلى البروتين المستهدف المطلوب1،2،3،4، والتي بدورها يمكن استخدامها كمسبارات داخل الخلايا من التفاعلات البروتين البروتين.

في كل مكان هو سلسلة من الأنشطة الأنزيمية (E1 تنشيط إنزيم → E2 اقتران انزيم → ليغاز E3) التي تترافق بشكل متناقض في كل مكان (Ub) إلى ركائز البروتين لاستهدافهم للتدهور أو للتوسط في التغيرات إشارات الخلية. وبالإضافة إلى ذلك، deubiquitinases تحفيز إزالة كل مكان من البروتينات. لذلك ، في الخلايا ، هناك الآلاف من التفاعلات البروتينية البروتينية المعتمدة على Ub ، والغالبية العظمى منها تعترف بسطح مشترك مع تقارب منخفض ولكن خصوصية عالية للسماح بالتفاعلات الضعيفة من خلال الأسطح الكبيرة والمتنوعة.

أدخل إرنست وآخرون طفرات في المناطق الملزمة المعروفة في Ub من أجل معرفة ما إذا كان بإمكانهم تعزيز التقارب الملزم لبروتين ذي أهمية مع الحفاظ على الانتقائية العالية5. تم تطوير مكتبة مشتركة تضم أكثر من 10 مليارات (7.5 × 1010) من متغيرات Ub (UbVs) مع طفرات في مواقع عبر سطح Ub تتوسط في التفاعلات المعروفة بين البروتينUb. تألفت هذه المكتبة من phagemids التي تعبر عن بروتين معطف M13 bacteriophage pIII المنصهر في UbVs المتنوعة. لذلك ، يمكن عرض UbVs الفردية على سطح phage عبر بروتين المعطف عند التعبير. خلال عملية الاختيار ، سيتم الاحتفاظ بالphage التي تعرض UbVs مع تفاعلات ملزمة كبيرة مع البروتين المستهدف وإثراؤها في الجولات اللاحقة من عرض phage ، في حين يتم غسل phage عرض UbVs التي ترتبط بشكل سيئ بالبروتين المستهدف وإزالتها من بركة phage. تحتوي جزيئات ال phage المحتفظ بها على الفاغميد المقابل ل UbV المعروض ، مما يسمح بتسلسلها وتميزها مرة أخرى بمجرد عزلها.

باستخدام هذه الاستراتيجية الهندسية البروتين، تم تطوير مثبطات UbV ل deubiquitinases5 الإنسان وبروتيازيس6 الفيروسية. الأهم من ذلك ، لقد قمنا بتوليد UbVs المثبطة لE3 ligases HECT الأسرة البشرية من خلال اختطاف موقع E2 ملزمة وتفعيل UbVs التي تحتل exosite Ub ملزمة على domain7 HECT. يمكننا أيضا أن تمنع monomeric RING-الأسرة E3s من خلال استهداف موقع الربط E2 وحمل UbV dimerization لتنشيط هوموديمريك RING E3s8. بالنسبة إلى وحدات RING E3 متعددة الوحدات، يمكن أن تحقق UbVs تثبيطا من خلال استهداف الوحدة الفرعية RING (على سبيل المثال، بالنسبة إلى APC/C complex9) أو تعطيل التكوين المعقد (على سبيل المثال، ل SCF E3s10). بشكل جماعي ، يمكن الاستفادة من UbVs لاستجواب التفاعلات بين البروتين والبروتين بشكل منهجي في نظام Ub-proteasome (UPS) حتى نتمكن من فك الآليات الكيميائية الحيوية لإنزيمات UPS بشكل أفضل وتحديد المواقع الوظيفية للتدخل العلاجي والتحقق من صحتها.

يصف البروتوكول التالي كيفية استخدام مكتبة UbV المعروضة التي تم إنشاؤها مسبقا لاستهداف بروتين ذي أهمية وكيفية إثراء ملفات UbV التي تتفاعل مع البروتين المستهدف من خلال جولات متتالية من عرض phage.

Protocol

1. إعداد الكاشف

  1. PBS (الفوسفات العازلة المالحة): مزيج 50 مل من محلول PBS 10x مع 450 مل من H2O فائقة الشراء. تعقيم عن طريق الترشيح وتخزينها في 4 درجة مئوية أو درجة حرارة الغرفة (~ 20-25 درجة مئوية).
  2. 10٪ BSA (ألبوم مصل البقر): أضف ببطء 1 غرام من BSA إلى 7 مل من H2O فائقة الشراء واخلطها حتى تذوب بالكامل (بدون كتل). أعلى مع H2O فائقة السعة حتى حجم النهائي هو 10 مل. تعقيم عن طريق الترشيح وتخزينها في 4 °C.
  3. PB العازلة (برنامج تلفزيوني تستكمل مع 1٪ BSA): إضافة ببطء 5 غرام من BSA إلى 400 مل من H2O فائقة الشراء و 50 مل من برنامج تلفزيوني ومزيج حتى يذوب تماما (لا كتل). أعلى مع H2O فائقة الشراء حتى حجم النهائي هو 500 مل. تعقيم عن طريق الترشيح وتخزينها في 4 °C.
  4. PBT العازلة (برنامج تلفزيوني تستكمل مع 1٪ BSA و 0.05٪ توين 20): إضافة ببطء 5 غرام من BSA إلى 400 مل من H2O فائقة السعة و 50 مل من برنامج تلفزيوني ومزيج حتى يذوب تماما (لا كتل). إضافة 250 ميكرولتر من توين 20. أعلى مع H2O فائقة الشراء حتى حجم النهائي هو 500 مل. تعقيم عن طريق الترشيح وتخزينها في 4 °C.
  5. PT العازلة (برنامج تلفزيوني تستكمل مع 0.05٪ توين 20): مزيج 1 مل من توين 20 مع 400 مل من برنامج تلفزيوني. أعلى مع H2O فائقة النبور حتى حجم النهائي هو 2 L. تعقيم عن طريق الترشيح وتخزينها في 4 درجة مئوية أو درجة حرارة الغرفة (~ 20-25 درجة مئوية).
  6. مرق 2YT: أضف 16 غرام من التريبتون، 10 غرام من مستخلص الخميرة، و 5 غرام من NaCl إلى 800 مل من H2O فائقة الشراء واخلط حتى يذوب تماما (لا كتل). أعلى مع H2O فائقة النبور حتى حجم النهائي هو 1 L. تعقيم عن طريق الالاستعباد التلقائي وتخزينها في درجة حرارة الغرفة (~ 20-25 درجة مئوية).
  7. LB/الكربوهيدرات لوحات: إضافة 12.5 غرام من خليط LB مسبقة الصنع و 7.5 غرام من أجار إلى 400 مل من H2O. أعلى مع H2O فائقة السعة حتى الحجم النهائي هو 500 مل وتعقيمها عن طريق الالاستعباد التلقائي. تأكد من أن أجار يذوب بالكامل وانتظر حتى يبرد إلى أقل من 60 درجة مئوية. إضافة 500 ميكرولتر من 100 مل كاربينسيلين مل, مزيج جيدا, وتصب في لوحة. يخزن عند درجة حرارة 4 درجات مئوية.
  8. لوحات LB/tet: أضف 12.5 جراما من خليط LB المصنوع مسبقا و7.5 جراما من الأجار إلى 400 مل من H2O فائقة السعة. تأكد من ذوبان أجار بالكامل وانتظر حتى يبرد إلى أقل من 60 درجة مئوية. إضافة 500 ميكرولتر من 10 مل متر رباعي السيكلين, مزيج جيدا, وتصب في لوحة. يخزن عند درجة حرارة 4 درجات مئوية.
  9. 20٪ PEG (البولي إيثيلين غليكول)/2.5 م NaCl: أضف 50 جراما من PEG-8000 و36.5 جراما من NaCl إلى 200 مل من مزيج H2O فائقة السعة حتى تذوب تماما.
    ملاحظة: قد يستغرق هذا بعض الوقت; التدفئة يمكن أن تساعد. أعلى مع H2O فائقة الشراء حتى حجم النهائي هو 250 مل. تعقيم عن طريق الترشيح أو الالاستعباد التلقائي.
  10. 0.1 م HCl: مزيج 20 مل من 1 م HCl مع 180 مل من H2O فائقة الشراء. تعقيم عن طريق الترشيح وتخزينها في درجة حرارة الغرفة (~ 20-25 درجة مئوية).
  11. 1 M Tris (درجة الحموضة 11.0): أضف 6.1 غرام من قاعدة تريس إلى 40 مل من H2O فائقة الشراء. ضبط درجة الحموضة إلى 11.0 مع HCl واخلط حتى يذوب تريس تماما. أعلى مع H2O فائقة الشراء حتى حجم النهائي هو 50 مل. تعقيم عن طريق الترشيح وتخزينها في درجة حرارة الغرفة (~ 20-25 درجة مئوية).
  12. 100 ملغم/مل (1000x) كاربينسيلين: أضف 2 غرام من ملح الكاربينسيلين ديباديوم إلى 20 مل من H2O فائقة البور حتى تذوب تماما. تعقيم عن طريق الترشيح وتخزينها في -20 درجة مئوية.
  13. 50 ملغم/مل (1000x) كاناميسين: أضف 1 غرام من كبريتات الكاناميسين إلى 20 مل من H2O فائقة السعة حتى تذوب بالكامل. تعقيم عن طريق الترشيح وتخزينها في -20 درجة مئوية.
  14. 10 ملغم/مل (1000x) تتراسيكلين: أضف 0.2 غرام من هيدروكلوريد التتراسيكلين إلى 20 مل من الإيثانول بنسبة 70٪. تخلط حتى تذوب تماما. تعقيم عن طريق الترشيح وتخزينها في -20 درجة مئوية.

2. إعداد البروتين

  1. تحديد تركيز مخزون البروتين المستهدف في ميكرومتر. الطريقة الأكثر ملاءمة لتقييم تركيز البروتين هو لقياس امتصاص مخزون البروتين في 280 نانومتر. إذا كان التركيز معروفا في ملغم / مل، تحويله إلى μM باستخدام الوزن الجزيئي للبروتين المستهدف. ويمكن استخدام مجموعة من الطرق اعتمادا على البروتين من الفائدة; راجع قسم المناقشة للحصول على التفاصيل.
    ملاحظة: إذا تم اقتطاع البروتين (مجال/عزر بروتين محدد) أو وضع علامة عليه، تذكر أن تحاسب على هذه التغيرات في الوزن الجزيئي عند التحويل من ملغم/مل إلى ميكرومتر.
  2. إعداد ثلاثة أنابيب الطرد المركزي الصغيرة المسمى "الجولة 1"، "جولة 2/3"، و "الجولة 4/5".
    1. حساب حجم البروتين اللازم لتخفيفه إلى 1 ميكرومتر في 800 ميكرولتر PBS وaliquot هذا الحجم في الأنابيب دون إضافة برنامج تلفزيوني.
      ملاحظة: إذا كانت كمية البروتين المستهدفة المتاحة منخفضة، يمكن خفض التركيز إلى أقل من 0.25 ميكرومتر.

3. التحضير للجولة الأولى من الاختيار

  1. إعداد ثقافة البذور لزراعة مدخلات phage للجولة الثانية من الاختيار.
    1. تلقيح 5 مل من 2YT/tet مع مستعمرة الإشريكية القولونية المعزولة جيدا واحتضانها بين عشية وضحاها عند 37 درجة مئوية مع اهتزاز مداري 200 دورة في الدقيقة.
  2. معطف لوحة للجولة الأولى من الاختيار.
    1. تمييع البروتين المستهدف في أنبوب "الجولة 1" مع الكمية المناسبة من PBS وaliquot 100 ميكرولتر في ثماني آبار من لوحة ملزمة 96 جيدا (أي اللوحة المستهدفة).
      ملاحظة: يمكن إجراء عرض Phage لأربعة بروتينات مختلفة في وقت واحد على لوحة واحدة عن طريق طلاء الآبار في زوايا اللوحة.
    2. التحكم الاختياري: إذا تم وضع علامة على البروتين المستهدف، كما هو الحال مع GST أو MBP (بروتين الربط المالتوس)، اغلف ثمانية آبار في لوحة ربط أخرى ذات 96 بئرا مع 100 ميكرولتر من محلول 1 ميكرومتر يحتوي على علامة epitope المناسبة. سيتم استخدام هذا لإزالة phage غير مرغوب فيه التي تربط إلى العلامة بشكل غير محدد.
    3. يهز لوحة (ق) بين عشية وضحاها في 4 درجة مئوية مع 200 دورة في الدقيقة اهتزاز المداري.

4. الجولة الأولى من الاختيار

  1. إعداد إدخال الجولة الثانية.
    1. تلقيح 30 مل من 2YT/tet مع 200 ميكرولتر من ثقافة البذور من الخطوة 3.1.
    2. احتضان عند 37 درجة مئوية مع اهتزاز مداري 200 دورة في الدقيقة حتى تكون البكتيريا في مرحلة منتصف السجل (OD600figure-protocol-6032 0.6 - 0.8). هذا يستغرق ما يقرب من ثلاثة ح.
  2. كتلة لوحة الهدف.
    1. إزالة محلول الطلاء من لوحة, أو كل لوحات إذا تم إجراء لوحة التحكم, عن طريق عكس ويهز على بالوعة. بات الجافة على المناشف الورقية.
    2. إضافة 300 ميكرولتر من PB العازلة إلى كل المغلفة جيدا.
    3. إزالة المخزن المؤقت PB كما في الخطوة 4.2.1 وإضافة آخر 200 μL من المخزن المؤقت PB.
    4. احتضان في درجة حرارة الغرفة (~ 20-25 درجة مئوية) لمدة 1 ساعة مع 300 دورة في الدقيقة اهتزاز المداري.
  3. إعداد مكتبة phage.
    1. إذابة مكتبة phage على الجليد وتمييعه إلى 100x تنوع المكتبة في برنامج تلفزيوني. على سبيل المثال، إذا كان تنوع المكتبة 1 × 1010 وكان تركيز المكتبة 1 × 1013، فإنها تضعف المكتبة بحيث يكون التركيز 1 × 1012. للمكتبات المستخدمة هنا ، تمييعها 10 أضعاف في برنامج تلفزيوني من خلال الجمع بين 1 مل من المكتبة مع 9 مل من برنامج تلفزيوني.
      ملاحظة: كان يجب تحديد تنوع المكتبات أثناء إنشاء المكتبة ولا يمكن تقييمها بسهولة بخلاف ذلك. يمكن تحديد تركيز المكتبة عن طريق تلقيح خلايا الإشريكية القولونية في مرحلة منتصف السجل (OD600figure-protocol-7202 0.6 - 0.8) والطلاء على LB / carb.
    2. إضافة 1/5 حجم PEG/ NaCl. على سبيل المثال، بالنسبة إلى 10 مل من المكتبة المخففة سابقا، أضف 2 مل من PEG/NaCl.
    3. احتضان على الجليد لمدة 30 دقيقة.
    4. جهاز الطرد المركزي في 11،000 × ز لمدة 30 دقيقة في 4 درجة مئوية، وتجاهل supernatant، والطرد الأخير لمدة 2 دقيقة لسحب أسفل supernatant المتبقية.
      ملاحظة: وضع الأنبوب في الدوار في نفس الاتجاه في المرة الثانية كما كان أول من حافظ على بيليه في نفس المكان، وبالتالي، مما يجعل من الأسهل أن نرى.
    5. إعادة إنفاق بلطف بيليه phage في 1 مل من PBT لكل بروتين. لأربعة بروتينات، إعادة إنفاق بيليه في 4 مل من PBT.
      ملاحظة: حاول عدم لمس بيليه ولا تقدم فقاعات الهواء.
  4. عرض phage إلى البروتين المستهدف (ق).
    1. التحكم الاختياري: أضف 100 ميكرولتر من مكتبة phage إلى كل بئر مغلفة جيدا في لوحة التحكم. احتضان في درجة حرارة الغرفة (~ 20-25 درجة مئوية) لمدة 1 ساعة مع اهتزاز مداري 300 دورة في الدقيقة ونقل المكتبة من لوحة التحكم إلى لوحة الهدف. تخطي الخطوة 4.4.2.
    2. إزالة المخزن المؤقت PB من لوحة الهدف كما هو الحال في الخطوة 4.2.1 وإضافة 100 ميكرولتر من مكتبة phage إلى كل المغلفة جيدا.
    3. احتضان في درجة حرارة الغرفة (~ 20-25 درجة مئوية) لمدة 1 ساعة مع 300 دورة في الدقيقة اهتزاز المداري.
  5. (إلوت) جولة واحدة
    1. إزالة مكتبة phage وغسل الآبار المغلفة أربع مرات مع المخزن المؤقت PT. عكس لوحة والاستفادة على منشفة ورقية لإزالة قطرات الماضي.
      ملاحظة: إذا كانت البروتينات المستهدفة متعددة مغلفة على طبق واحد، في محاولة لتقليل تدفق جميع الحلول اللاحقة بين الآبار.
    2. أضف 100 ميكرولتر من 0.1 M HCl إلى كل بئر مغلفة واحتضان في درجة حرارة الغرفة لمدة 5 دقائق مع اهتزاز مداري 300 دورة في الدقيقة.
    3. تحييد درجة الحموضة بإضافة 12.5 ميكرولتر من 1 M تريس-HCl (درجة الحموضة 11) إلى كل بئر المغلفة.
    4. تجمع فيج eluted من جميع الآبار 8 في أنبوب واحد 1.5 مل الطرد المركزي الدقيق. ماصة صعودا وهبوطا أثناء النقل لجعل الحلول متجانسة و أسبيرات جميع السوائل من الآبار.
    5. إضافة 10٪ BSA إلى phage eluted المجمعة إلى تركيز نهائي قدره 1٪. بالنسبة إلى حجم elution واحد مستدير نموذجي يبلغ 950 ميكرولتر، أضف 95 ميكرولتر من 10٪ BSA. يخزن عند درجة حرارة 4 درجات مئوية. هذا هو الناتج الجولة الأولى.

5. التحضير لجولات الاختيار اللاحقة

  1. إعداد ثقافة البذور لزراعة مدخلات phage للجولة التالية من الاختيار كما هو الحال في الخطوة 3.1.
  2. معطف لوحة للجولة الثالثة من الاختيار كما هو الحال في الخطوة 3.2 مع التغييرات المذكورة أدناه.
    1. معطف فقط أربعة آبار لكل بروتين في لوحة ملزمة 96 جيدا. استخدم نصف محتويات أنابيب "الجولة 2/3" أو "الجولة 4/5" للجولة المناسبة. تمييع محتويات هذه الأنابيب حسب الحاجة، من أجل تجنب استقرار البروتينات من الحل.
  3. إعداد مدخلات phage للجولة التالية من الاختيار.
    1. استخدم نصف إخراج الجولة الأولى من الخطوة 4.5.5 لتطعيم 3 مل من خلايا المرحلة المتوسطة من الخطوة 4.1. للحصول على إخراج جولة واحدة نموذجية، تلقيح مع 500 ميكرولتر من الإخراج.
    2. احتضان في 37 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة مع 200 دورة في الدقيقة اهتزاز المداري.
    3. أضف M13K07 المساعد phage إلى تركيز نهائي من 1 × 1010 PFU / مل.
    4. احتضان في 37 درجة مئوية لمدة 1 ساعة مع 200 دورة في الدقيقة اهتزاز المداري.
    5. نقل كامل 3 مل من الثقافة إلى 30 مل من 2YT / الكربوهيدرات / كان. تنمو بين عشية وضحاها في 37 درجة مئوية مع 200 دورة في الدقيقة اهتزاز المداري.
    6. في اليوم التالي، نقل الثقافة إلى أنبوب الطرد المركزي 50 مل والطرد المركزي في 11،000 × ز لمدة 10 دقيقة في 4 درجة مئوية لتسريع الخلايا.
    7. decant supernatant في أنبوب طرد مركزي جديد 50 مل ومزيج مع 8 مل من PEG / NaCl واحتضان على الجليد لمدة 10 دقيقة.
    8. جهاز الطرد المركزي في 11،000 × غرام لمدة 10 دقيقة في 4 درجة مئوية، والتخلص من supernatant، والطرد المركزي مرة أخرى لمدة 2 دقيقة.
      ملاحظة: وضع الأنبوب في الدوار في نفس الاتجاه في المرة الثانية كما كان أول من حافظ على بيليه في نفس المكان، وبالتالي، مما يجعل من الأسهل أن نرى.
    9. Resuspend بيليه phage في 800 ميكرولتر من PBT بحيث تكون متجانسة تماما وليس كتل مرئية.
    10. نقل محلول phage إلى أنبوب 1.5 مل من أجهزة الطرد المركزي والطرد المركزي عند 16200 × غرام لمدة 4 دقائق عند 4 درجات مئوية إلى حطام بيليه.
    11. نقل supernatant إلى أنبوب جديد للطرد المركزي. هذا هو الإدخال للجولة التالية من التحديد.
  4. اختياري: تتر حلول الإدخال والمخرجات.
    1. استخدم 500 ميكرولتر من زراعة بذور الإشريكية القولونية لتطعيم 5 مل من 2YT/tet واحتضانها عند 37 درجة مئوية مع اهتزاز مداري 200 دورة في الدقيقة حتى تكون البكتيريا في مرحلة منتصف السجل (OD600figure-protocol-11809 0.6 - 0.8). هذا يستغرق حوالي 1 ساعة.
    2. تخفيف المدخلات phage / مخرجات الحلول إلى 10-3 - 10-5 في برنامج تلفزيوني وإضافة 10 ميكرولتر من كل تخفيف إلى 90 ميكرولتر من الخلايا المستزرعة.
      ملاحظة: استخدام حلول phage المخفف فورا لأن phage سوف يعبيء إلى الأنبوب مع مرور الوقت، والتحولات قد تنتج السلبيات كاذبة.
    3. احتضان في 37 درجة مئوية لمدة 20 دقيقة مع 200 دورة في الدقيقة اهتزاز المداري.
    4. لوحة 5 ميكرولتر على لوحات منفصلة LB / الكربوهيدرات.
      ملاحظة: المبلغ مطلي متغير يعتمد على النتائج السابقة / تفضيل شخصي.

6. جولات الاختيار اللاحقة

  1. قم بإجراء جميع الجولات اللاحقة مع التحضير كما تم في الخطوتين 3 و4 على التوالي، مع ذكر الاختلافات أدناه.
    1. استخدم الإدخال الذي تم إنتاجه في الجولة السابقة كمصدر phage بدلا من مكتبة. معطف 4 آبار لكل بروتين الهدف مع 100 ميكرولتر من مدخلات phage المكتسبة من الجولة السابقة. تخزين مدخلات phage المتبقية عند 4 °C.
    2. جعل خطوة الغسيل في 4.5.1 أكثر صرامة مع كل جولة من الاختيار. الجولة الأولى تتطلب الغسيل 4 مرات، الجولة الثانية تتطلب 6 مرات، الجولة الثالثة تتطلب 8 مرات، والجولات الرابعة والخامسة كلاهما يتطلب الغسيل 10 مرات.
    3. تقليل بعض الأحجام مقارنة بتلك المستخدمة في الجولة الأولى لأن الجولات اللاحقة تغطي أربعة آبار فقط بدلا من ثمانية. على سبيل المثال، في الخطوة 4.5.5 فقط 45 ميكرولتر من 10٪ BSA يضاف إلى إخراج phage، وفي الخطوة 5.3.1 يتم استخدام 250 ميكرولتر فقط من إخراج phage لتطعيم الخلايا.

7. بعد معالجة الاختيار والعزل phage

  1. Titer حلول المدخلات والمخرجات للجولتين الرابعة والخامسة.
    1. إذا لم يكن قد تم بالفعل في الخطوة 5.4 ، اتبع نفس الخطوات لجولات titer أربعة وخمسة مخرجات phage ، مما ينتج بشكل مثالي مجموعة من 30-300 مستعمرة عبر بضع لوحات.
  2. الثقافة وعزل phage.
    1. Aliquot 450 ميكرولتر من 2YT / carb / M13K07 في كل أنبوب من مربع ثقافة أنبوب صغير 96.
    2. اختر مستعمرات معزولة جيدا من أي من الصفائح من الخطوة 7.1 لتطعيم كل أنبوب.
      ملاحظة: استخدم النصف العلوي من المربع للجولة أربعة مخرجات والنصف السفلي للجولة خمسة مخرجات.
    3. احتضان بين عشية وضحاها في 37 درجة مئوية مع اهتزاز مداري 200 دورة في الدقيقة.
    4. جهاز طرد مركزي عند 1200 × غرام لمدة 10 دقائق عند 4 درجات مئوية.
    5. نقل أكبر قدر ممكن من supernatant إلى مربع جديد ثقافة أنبوب صغير 96 دون إزعاج بيليه الخلية والتخلص من القديم. يخزن عند درجة حرارة 4 درجات مئوية.
    6. من المربع الجديد، نقل 100 ميكرولتر من كل أنبوب إلى 96 لوحة غير ملزمة جيدا تحتوي على 100 ميكرولتر من 50٪ الجلسرين في جميع الآبار. تخلط جيدا وتخزينها في -80 درجة مئوية كمخزون احتياطية.

النتائج

يمكن التحقق من الموثقات المنتجة من عرض phage وتحليلها بطرق عديدة. فمن المستحسن أن المضي قدما أولا مع تسلسل phage مع التمهيديات التي تحيط إدراج متنوعة في مكتبة phagemid. سوف تظهر تجربة عرض phage المثالية تحيزا واضحا نحو عدة تسلسلات (الشكل 1). تسلسل أخرى ستكون موجودة أيضا ولكن مع عدد أقل، ...

Discussion

كما ذكر في الخطوة 2.1 (إعداد البروتين)، يمكن استخدام مجموعة متنوعة من الطرق لتقييم تركيز البروتين، وسيكون لكل منها فوائد وعيوب فريدة من نوعها على أساس البروتين المستهدف المحدد المستخدم لعرض الفواج. وقد تم توفير مصدر للأوصاف التفصيلية والبروتوكولات للطرق الشعبية سابقا11.

Disclosures

ولا يعلن صاحبا البلاغ عن وجود تضارب في المصالح.

Acknowledgements

تم ابتكار تقنية متغير ubiquitin في مختبر الدكتور ساشديف سيدهو (جامعة تورنتو). WZ حاليا باحث CIFAR Azrieli العالمية في البشر وبرنامج الميكروبيوم. تم تمويل هذا البحث من قبل NSERC ديسكفري المنح الممنوحة لWZ (RGPIN-2019-05721).

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
Axygen Mini Tube System (0.65 mL, sterile, 96/Rack, 10 Racks/pack)Fisher Scientific14-222-198Culturing phage outputs after phage display.
BD Difco Dehydrated Culture Media: LB Broth, Miller (Luria-Bertani)Fisher ScientificDF0446-17-3Preparing plates for titering.
Bovine Serum Albumin (BSA), Fraction VBioShop CanadaALB001Buffer component.
Carbenicillin disodium salt 89.0-100.5% anhydrousMillipore-SigmaC1389-5GCulturing phagemid-infected cells.
Compact Digital Microplate ShakerFisher Scientific11-676-337Shaking plates during incubation with the phage library.
Corning Microplate Aluminum Sealing TapeFisher Scientific07-200-684Sealing phage glycerol stocks.
Dehydrated AgarFisher ScientificDF0140-01-0Preparing plates for titering.
DS-11 Spectrophotometer/FluorometerDeNovixDS-11 FX+Protein concentration measurement.
Greiner Bio-One CellStar 96-Well, Non-Treated, U-Shaped-Bottom MicroplateFisher Scientific7000133Storing phage glycerol stocks.
Hydrochloric AcidFisher ScientificA144-500Phage elution.
Invitrogen One Shot OmniMAX 2 T1R Chemically Competent E. coliFisher ScientificC854003Bacterial strain for phage infection.
Kanamycin SulfateFisher ScientificAAJ1792406Culturing M13K07 helper phage-infected cells.
M13KO7 Helper PhageNew England Biolabs N0315SPermit phagemid packing and secretion.
MaxQ 4000 Benchtop Orbital ShakerFisher Scientific11-676-076Bacterial cell culture.
Nunc MaxiSorp 96 well microplate, flat bottomLife Technologies44-2404-21Immobilizing proteins.
Phosphate Buffered Saline (PBS) 10X SolutionFisher ScientificBP3994Buffer component/phage resuspension medium.
Polyester Films for ELISA and IncubationVWR60941-120Covering the microplates during incubation.
Polyethylene Glycol 8000 (PEG)Fisher ScientificBP233-1Phage precipitation.
Sodium chlorideMillipore-SigmaS3014Phage precipitation.
Sterile Plastic Culture Tubes: Translucent PolypropyleneFisher Scientific14-956-1DCulturing phage inputs.
Tetracycline HydrochlorideFisher ScientificBP912-100Culturing E. coli OmniMax cells.
Tris BaseFisher ScientificBP1525Neutralizing eluted phage solution.
Tryptone PowderFisher ScientificBP1421-2Cell growth media component.
Tween 20Fisher ScientificBP337500Buffer component.
Yeast ExtractFisher ScientificBP1422-2Cell growth media component.

References

  1. Karlsson, O. A., et al. Design of a PDZbody, a bivalent binder of the E6 protein from human papillomavirus. Scientific Reports. 5 (1), 9382 (2015).
  2. Veggiani, G., et al. Engineered SH2 domains with tailored specificities and enhanced affinities for phosphoproteome analysis. Protein Science. 28 (2), 403-413 (2019).
  3. Kaneko, T., et al. Superbinder SH2 domains act as antagonists of cell signaling. Science Signaling. 5 (243), (2012).
  4. Wiechmann, S., et al. Site-specific inhibition of the small ubiquitin-like modifier (SUMO)-conjugating enzyme Ubc9 selectively impairs SUMO chain formation. Journal of Biological Chemistry. 292 (37), 15340-15351 (2017).
  5. Ernst, A., et al. A strategy for modulation of enzymes in the ubiquitin system. Science. 339 (6119), 590-595 (2013).
  6. Zhang, W., et al. Potent and selective inhibition of pathogenic viruses by engineered ubiquitin variants. PLOS Pathogens. 13 (5), 1006372 (2017).
  7. Zhang, W., et al. System-wide modulation of HECT E3 ligases with selective ubiquitin variant probes. Molecular Cell. 62 (1), 121-136 (2016).
  8. Gabrielsen, M., et al. A general strategy for discovery of inhibitors and activators of RING and U-box E3 ligases with ubiquitin variants. Molecular Cell. 68 (2), 456-470 (2017).
  9. Brown, N. G., et al. Dual RING E3 architectures regulate multiubiquitination and ubiquitin chain elongation by APC/C. Cell. 165 (6), 1440-1453 (2016).
  10. Gorelik, M., et al. Inhibition of SCF ubiquitin ligases by engineered ubiquitin variants that target the Cul1 binding site on the Skp1-F-box interface. Proceedings of the National Academy of Sciences. 113 (13), 3527-3532 (2016).
  11. Goldring, J. P. D. Protein quantification methods to determine protein concentration prior to electrophoresis. Protein Electrophoresis. 869, 29-35 (2012).
  12. Zhang, W., Sidhu, S. S. Generating intracellular modulators of E3 ligases and deubiquitinases from phage-displayed ubiquitin variant libraries. The Ubiquitin Proteasome System: Methods and Protocols. 1844, 101-119 (2018).
  13. Sheehan, J., Marasco, W. A. Phage and yeast display. Microbiology Spectrum. 3 (1), 1-17 (2015).
  14. Lowman, H. B., Wells, J. A. Monovalent phage display: A method for selecting variant proteins from random libraries. Methods. 3 (3), 205-216 (1991).
  15. Lowman, H. B., Bass, S. H., Simpson, N., Wells, J. A. Selecting high-affinity binding proteins by monovalent phage display. Biochemistry. 30 (45), 1-7 (1991).
  16. Beaber, J. W., Tam, E. M., Lao, L. S., Rondon, I. J. A new helper phage for improved monovalent display of Fab molecules. Journal of Immunological Methods. 376 (1-2), 46-54 (2012).
  17. Galán, A., et al. Library-based display technologies: where do we stand. Molecular BioSystems. 12 (8), 2342-2358 (2016).
  18. Huang, S., et al. Ribosome display and selection of single-chain variable fragments effectively inhibit growth and progression of microspheres in vitro and in vivo. Cancer Science. 109 (5), 1503-1512 (2018).
  19. Yamaguchi, J., et al. cDNA display: a novel screening method for functional disulfide-rich peptides by solid-phase synthesis and stabilization of mRNA-protein fusions. Nucleic Acids Research. 37 (16), 1-13 (2009).
  20. Mochizuki, Y., Kumachi, S., Nishigaki, K., Nemoto, N. Increasing the library size in cDNA display by optimizing purification procedures. Biological Procedures Online. 15 (1), 1-5 (2013).
  21. Odegrip, R., et al. CIS display: In vitro selection of peptides from libraries of protein-DNA complexes. Proceedings of the National Academy of Sciences. 101 (9), 2806-2810 (2004).
  22. Reiersen, H., et al. Covalent antibody display--an in vitro antibody-DNA library selection system. Nucleic Acids Research. 33 (1), 1-9 (2005).
  23. Houlihan, G., Gatti-Lafranconi, P., Lowe, D., Hollfelder, F. Directed evolution of anti-HER2 DARPins by SNAP display reveals stability/function trade-offs in the selection process. Protein Engineering Design and Selection. 28 (9), 269-279 (2015).
  24. Zhang, W., et al. Generation and validation of intracellular ubiquitin variant inhibitors for USP7 and USP10. Journal of Molecular Biology. 429 (22), 3546-3560 (2017).
  25. Teyra, J., et al. Structural and functional characterization of ubiquitin variant inhibitors of USP15. Structure. 27 (4), 590-605 (2019).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

174

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved