使用噬菌体显示开发用于E3连接酶的泛素变体调节剂

摘要

泛素化是翻译后修饰的关键蛋白质，其失调与许多人类疾病有关。该协议详细介绍了如何利用噬菌体显示来分离新的泛素变体，这些变体可以结合和调节控制泛素特异性，效率和模式的E3连接酶的活性。

摘要

泛素是一种8.6 kDa的小蛋白，是泛素蛋白酶体系统的核心成分。因此，它可以与具有高特异性但低亲和力的各种蛋白质结合。通过噬菌体展示，可以设计泛素变体（UbV），使它们表现出比野生型泛素更好的亲和力，并保持与靶蛋白的结合特异性。噬菌体展示利用噬菌体文库，其中丝状M13噬菌体的pIII包衣蛋白（选择它是因为它显示在噬菌体表面上）与UbV融合。人类野生型泛素的特定残基是软的和随机的（即，偏向于天然野生型序列）以产生UbVs，从而避免蛋白质构象的有害变化，同时引入促进与靶蛋白的新相互作用所需的多样性。在噬菌体展示过程中，这些UbV在噬菌体涂层蛋白上表达和显示，并针对感兴趣的蛋白质进行平移。与靶蛋白表现出有利结合相互作用的UbV被保留，而较差的结合剂被冲走并从文库池中除去。保留的UbV附着在含有UbV相应噬菌体颗粒上的UbV被洗脱，扩增和浓缩，以便它们可以在另一轮噬菌体展示中与相同的靶蛋白平移。通常，最多进行五轮噬菌体展示，在此期间，对弱结合和/或混杂结合的UbV施加强大的选择压力，以便集中和富集具有较高亲和力的UbV。最终，分离出比野生型对应物对靶蛋白具有更高特异性和/或亲和力的UbV，并且可以通过进一步的实验进行表征。

引言

了解蛋白质 - 蛋白质相互作用的分子细节对于描绘生物过程的信号转导机制至关重要，特别是那些导致临床重要疾病的机制。近年来，噬菌体展示已被用作分离蛋白质/肽的实用且易于使用的方法，其与所需目标蛋白的结合得到了很大的改善^{1，2，3，4}，而靶蛋白相互作用又可用作蛋白 - 蛋白相互作用的细胞内探针。

泛素化是酶促活性（E1激活酶→E2偶联酶→E3连接酶）的级联反应，其共价偶联泛素（Ub）到蛋白质底物以靶向它们进行降解或介导细胞信号传导变化。此外，去泛素酶催化从蛋白质中去除泛素。因此，在细胞中，有成千上万的Ub依赖性蛋白质 - 蛋白质相互作用，其中绝大多数识别具有低亲和力但高特异性的共同表面，以允许通过大而多样化的表面进行弱相互作用。

Ernst等人将突变引入Ub的已知结合区域，以查看它们是否可以增强对目标蛋白质的结合亲和力，同时仍保持高选择性⁵。开发了一个超过100亿（7.5 x ¹⁰¹⁰）Ub变体（UbVs）的组合库，这些变体在Ub表面的位置发生了突变，介导了已知的Ub蛋白相互作用。该文库由表达融合到多样....

研究方案

1. 试剂制备

1. PBS（磷酸盐缓冲盐水）：将50 mL 10x PBS溶液与450 mL超纯_H2 O混合。通过过滤灭菌并储存在4°C或室温（〜20-25°C）。
2. 10%BSA（牛血清白蛋白）：缓慢加入1克BSA至7mL超纯_H2 O中，混合直至完全溶解（无团块）。加满超纯 _H2O，直至最终体积为 10 mL。过滤灭菌并储存在4°C。
3. PB缓冲液（补充有1%BSA的PBS）：缓慢加入5gBSA至400 mL超纯_H2O和50 mL PBS中，混合直至完全溶解（无团块）。加满超纯 _H2O，直至最终容积为 500 mL。过滤灭菌并储存在4°C。
4. PBT缓冲液（PBS补充1%BSA和0.05%吐温20）：缓慢加入5克BSA至400 mL超纯_H2O和50 mL PBS中，混合直至完全溶解（无团块）。加入250μL吐温20。加满超纯 _H2O，直至最终容积为 500 mL。过滤灭菌并储存在4°C。
5. PT 缓冲液（补充有 0.05% 吐温 20 的 PBS）：将 1 mL 吐温 20 与 400 mL PBS 混合。加满超纯_H2 O，直到最终体积为2 L.通过过滤灭菌并储存在4°C或室温（〜20-25°C）。下。
6. 2YT汤：加入16克色蛋白酮，10克酵母提取物....

结果

噬菌体展示产生的粘合剂可以通过多种方式进行验证和分析。建议首先使用引物对噬菌体进行测序，引物位于噬菌体文库中多样化插入片段的两侧。理想的噬菌体展示实验将显示对多个序列的明显偏倚（图1）。其他序列也将存在，但计数较低，更多地显示为背景噪声。在提供的示例中，在泛素变体（UbV）和野生型UBE4B之间进行噬菌体显示时，存在对序列#1-4的特别偏倚。提供.......

讨论

如步骤2.1（蛋白质制备）中所述，可以使用多种方法来评估蛋白质浓度，并且每种方法都将基于用于噬菌体显示的特定靶蛋白具有独特的优缺点。以前已经提供了流行方法的详细描述和协议的来源¹¹。

使用上一轮噬菌体展示保留的噬菌体作为后续一轮的输入，通过逐渐去除结合微弱、瞬时或偶然结合的粘结剂来丰富良好的粘结剂。到第四轮和第五轮，理想情.......

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
Axygen Mini Tube System (0.65 mL, sterile, 96/Rack, 10 Racks/pack)	Fisher Scientific	14-222-198	Culturing phage outputs after phage display.
BD Difco Dehydrated Culture Media: LB Broth, Miller (Luria-Bertani)	Fisher Scientific	DF0446-17-3	Preparing plates for titering.
Bovine Serum Albumin (BSA), Fraction V	BioShop Canada	ALB001	Buffer component.
Carbenicillin disodium salt 89.0-100.5% anhydrous	Millipore-Sigma	C1389-5G	Culturing phagemid-infected cells.
Compact Digital Microplate Shaker	Fisher Scientific	11-676-337	Shaking plates during incubation with the phage library.
Corning Microplate Aluminum Sealing Tape	Fisher Scientific	07-200-684	Sealing phage glycerol stocks.
Dehydrated Agar	Fisher Scientific	DF0140-01-0	Preparing plates for titering.
DS-11 Spectrophotometer/Fluorometer	DeNovix	DS-11 FX+	Protein concentration measurement.
Greiner Bio-One CellStar 96-Well, Non-Treated, U-Shaped-Bottom Microplate	Fisher Scientific	7000133	Storing phage glycerol stocks.
Hydrochloric Acid	Fisher Scientific	A144-500	Phage elution.
Invitrogen One Shot OmniMAX 2 T1R Chemically Competent E. coli	Fisher Scientific	C854003	Bacterial strain for phage infection.
Kanamycin Sulfate	Fisher Scientific	AAJ1792406	Culturing M13K07 helper phage-infected cells.
M13KO7 Helper Phage	New England Biolabs	N0315S	Permit phagemid packing and secretion.
MaxQ 4000 Benchtop Orbital Shaker	Fisher Scientific	11-676-076	Bacterial cell culture.
Nunc MaxiSorp 96 well microplate, flat bottom	Life Technologies	44-2404-21	Immobilizing proteins.
Phosphate Buffered Saline (PBS) 10X Solution	Fisher Scientific	BP3994	Buffer component/phage resuspension medium.
Polyester Films for ELISA and Incubation	VWR	60941-120	Covering the microplates during incubation.
Polyethylene Glycol 8000 (PEG)	Fisher Scientific	BP233-1	Phage precipitation.
Sodium chloride	Millipore-Sigma	S3014	Phage precipitation.
Sterile Plastic Culture Tubes: Translucent Polypropylene	Fisher Scientific	14-956-1D	Culturing phage inputs.
Tetracycline Hydrochloride	Fisher Scientific	BP912-100	Culturing E. coli OmniMax cells.
Tris Base	Fisher Scientific	BP1525	Neutralizing eluted phage solution.
Tryptone Powder	Fisher Scientific	BP1421-2	Cell growth media component.
Tween 20	Fisher Scientific	BP337500	Buffer component.
Yeast Extract	Fisher Scientific	BP1422-2	Cell growth media component.