Usando o Phage Display para desenvolver moduladores variantes de Ubiquitin para Ligases E3

Resumo

A ubiquização é uma modificação pós-translacional de proteínas críticas, que tem sido implicada em inúmeras doenças humanas. Este protocolo detalha como o display phage pode ser utilizado para isolar novas variantes de ubiquitina que podem ligar e modular a atividade de ligaduras E3 que controlam a especificidade, eficiência e padrões de ubiquização.

Resumo

Ubiquitin é uma pequena proteína de 8,6 kDa que é um componente central do sistema ubiquitin-proteasome. Consequentemente, pode se ligar a uma variedade diversificada de proteínas com alta especificidade, mas baixa afinidade. Através do display de phage, as variantes de ubiquitina (UbVs) podem ser projetadas de tal forma que exibem maior afinidade sobre a ubiquitina wildtype e mantêm a especificidade de ligação às proteínas-alvo. O display phage utiliza uma biblioteca phagemid, pela qual a proteína pIII coat de um bacteriophage m13 filamentoso (escolhido porque é exibido externamente na superfície da praga) é fundido com UbVs. Resíduos específicos do tipo selvagem humano ubiquitin são macios e randomizados (ou seja, há um viés em relação à sequência de tipo silvestre nativo) para gerar UbVs para que mudanças deletérias na conformação proteica sejam evitadas ao introduzir a diversidade necessária para promover novas interações com a proteína alvo. Durante o processo de exibição de phage, esses UbVs são expressos e exibidos em proteínas de revestimento de phage e garimpados contra uma proteína de interesse. Os UbVs que exibem interações vinculantes favoráveis com a proteína alvo são retidos, enquanto os aglutinantes pobres são lavados e removidos da piscina da biblioteca. Os UbVs retidos, que são anexados à partícula de phage contendo o phagemid correspondente da UbV, são elucidos, amplificados e concentrados para que possam ser garimpados contra a mesma proteína alvo em outra rodada de exibição de phage. Normalmente, são realizadas até cinco rodadas de exibição de phage, durante as quais uma forte pressão de seleção é imposta contra UbVs que se ligam fracamente e/ou promiscuamente para que aqueles com maiores afinidades sejam concentrados e enriquecidos. Em última análise, os UbVs que demonstram maior especificidade e/ou afinidade com a proteína alvo do que suas contrapartes do tipo selvagem são isolados e podem ser caracterizados através de outros experimentos.

Introdução

Compreender os detalhes moleculares das interações proteína-proteína é fundamental para delinear os mecanismos de transdução de sinais dos processos biológicos, particularmente aqueles que contribuem para doenças clinicamente importantes. Nos últimos anos, a exposição phage tem sido utilizada como um método prático e acessível para isolar proteínas/peptídeos com uma ligação muito melhor a uma proteína alvo ^{desejada1,2,3,4}, que por sua vez pode ser usada como sondas intracelulares de interações proteína-proteína.

A....

Protocolo

1. Preparação do reagente

1. PBS (salina tampão fosfato): Misture 50 mL de solução PBS de 10x com 450 mL de ultrapure _H2O. Esterilizar por filtragem e armazenar a 4 °C ou temperatura ambiente (~20-25 °C).
2. 10% BSA (albumina de soro bovino): Adicione lentamente 1 g de BSA a 7 mL de _H2O ultrapure e misture até dissolver totalmente (sem aglomerados). Cubra com _H2O ultrauso até que o volume final seja de 10 mL. Esterilize por filtragem e armazene a 4 °C.
3. Tampão PB (PBS complementado com 1% de BSA): Adicione lentamente 5 g de BSA a 400 mL de _H2O ultrapure e 50 mL de PBS e misture até dissolver totalmente....

Resultados

As pastas produzidas a partir do display phage podem ser verificadas e analisadas de muitas maneiras. Recomenda-se primeiro proceder com o sequenciamento do phage com primers que flanqueiam a inserção diversificada na biblioteca phagemid. Um experimento ideal de exibição de phage mostrará um viés claro em relação a várias sequências (Figura 1). Outras sequências também estarão presentes, mas com uma contagem mais baixa, aparecendo mais como ruído de fundo. No exemplo fornecido,.......

Discussão

Como mencionado na etapa 2.1 (preparação de proteínas), uma variedade de métodos pode ser usado para avaliar a concentração de proteínas, e cada um terá benefícios e desvantagens únicas com base na proteína alvo específica usada para exibição de phage. Uma fonte de descrições detalhadas e protocolos para métodos populares foi fornecida ^{anteriormente11}.

O uso do phage retido por uma rodada anterior de exibição de phage como a entrada para uma rodada su.......

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
Axygen Mini Tube System (0.65 mL, sterile, 96/Rack, 10 Racks/pack)	Fisher Scientific	14-222-198	Culturing phage outputs after phage display.
BD Difco Dehydrated Culture Media: LB Broth, Miller (Luria-Bertani)	Fisher Scientific	DF0446-17-3	Preparing plates for titering.
Bovine Serum Albumin (BSA), Fraction V	BioShop Canada	ALB001	Buffer component.
Carbenicillin disodium salt 89.0-100.5% anhydrous	Millipore-Sigma	C1389-5G	Culturing phagemid-infected cells.
Compact Digital Microplate Shaker	Fisher Scientific	11-676-337	Shaking plates during incubation with the phage library.
Corning Microplate Aluminum Sealing Tape	Fisher Scientific	07-200-684	Sealing phage glycerol stocks.
Dehydrated Agar	Fisher Scientific	DF0140-01-0	Preparing plates for titering.
DS-11 Spectrophotometer/Fluorometer	DeNovix	DS-11 FX+	Protein concentration measurement.
Greiner Bio-One CellStar 96-Well, Non-Treated, U-Shaped-Bottom Microplate	Fisher Scientific	7000133	Storing phage glycerol stocks.
Hydrochloric Acid	Fisher Scientific	A144-500	Phage elution.
Invitrogen One Shot OmniMAX 2 T1R Chemically Competent E. coli	Fisher Scientific	C854003	Bacterial strain for phage infection.
Kanamycin Sulfate	Fisher Scientific	AAJ1792406	Culturing M13K07 helper phage-infected cells.
M13KO7 Helper Phage	New England Biolabs	N0315S	Permit phagemid packing and secretion.
MaxQ 4000 Benchtop Orbital Shaker	Fisher Scientific	11-676-076	Bacterial cell culture.
Nunc MaxiSorp 96 well microplate, flat bottom	Life Technologies	44-2404-21	Immobilizing proteins.
Phosphate Buffered Saline (PBS) 10X Solution	Fisher Scientific	BP3994	Buffer component/phage resuspension medium.
Polyester Films for ELISA and Incubation	VWR	60941-120	Covering the microplates during incubation.
Polyethylene Glycol 8000 (PEG)	Fisher Scientific	BP233-1	Phage precipitation.
Sodium chloride	Millipore-Sigma	S3014	Phage precipitation.
Sterile Plastic Culture Tubes: Translucent Polypropylene	Fisher Scientific	14-956-1D	Culturing phage inputs.
Tetracycline Hydrochloride	Fisher Scientific	BP912-100	Culturing E. coli OmniMax cells.
Tris Base	Fisher Scientific	BP1525	Neutralizing eluted phage solution.
Tryptone Powder	Fisher Scientific	BP1421-2	Cell growth media component.
Tween 20	Fisher Scientific	BP337500	Buffer component.
Yeast Extract	Fisher Scientific	BP1422-2	Cell growth media component.