Uso de la pantalla de fagos para desarrollar moduladores de variantes de ubiquitina para ligasas E3

Resumen

La ubiquitinación es una proteína crítica de modificación post-traduccional, cuya desregulación se ha implicado en numerosas enfermedades humanas. Este protocolo detalla cómo se puede utilizar la visualización de fagos para aislar nuevas variantes de ubiquitina que pueden unirse y modular la actividad de las ligasas E3 que controlan la especificidad, la eficiencia y los patrones de ubiquitinación.

Resumen

La ubiquitina es una pequeña proteína de 8,6 kDa que es un componente central del sistema ubiquitina-proteasoma. En consecuencia, puede unirse a una amplia gama de proteínas con alta especificidad pero baja afinidad. A través de la visualización de fagos, las variantes de ubiquitina (UbV) pueden diseñarse de tal manera que exhiban una afinidad mejorada sobre la ubiquitina de tipo salvaje y mantengan la especificidad de unión a las proteínas objetivo. La pantalla de fagos utiliza una biblioteca de fagomides, mediante la cual la proteína de la capa pIII de un bacteriófago filamentoso M13 (elegido porque se muestra externamente en la superficie del fago) se fusiona con UbV. Los residuos específicos de ubiquitina de tipo silvestre humano son blandos y aleatorizados (es decir, existe un sesgo hacia la secuencia de tipo silvestre nativo) para generar UbV de modo que se eviten cambios perjudiciales en la conformación de proteínas al tiempo que se introduce la diversidad necesaria para promover nuevas interacciones con la proteína objetivo. Durante el proceso de visualización de fagos, estos UbV se expresan y muestran en las proteínas de la capa de fagos y se comparan con una proteína de interés. Los UbV que exhiben interacciones de unión favorables con la proteína objetivo se conservan, mientras que los aglutinantes pobres se eliminan y se eliminan del grupo de la biblioteca. Los UbV retenidos, que están unidos a la partícula de fago que contiene la fagomida correspondiente del UbV, se eluyen, amplifican y concentran para que puedan ser analizados contra la misma proteína objetivo en otra ronda de visualización de fagos. Por lo general, se realizan hasta cinco rondas de visualización de fagos, durante las cuales se impone una fuerte presión de selección contra ubV que se unen débilmente y / o promiscuamente para que aquellos con afinidades más altas se concentren y enriquezcan. En última instancia, los UbV que demuestran una mayor especificidad y / o afinidad por la proteína objetivo que sus contrapartes de tipo salvaje se aíslan y se pueden caracterizar a través de experimentos adicionales.

Introducción

Comprender los detalles moleculares de las interacciones proteína-proteína es fundamental para delinear los mecanismos de transducción de señales de los procesos biológicos, particularmente aquellos que contribuyen a enfermedades clínicamente importantes. En los últimos años, la visualización de fagos se ha utilizado como un método práctico y accesible para aislar proteínas / péptidos con una unión mucho mejor a una proteína objetivo deseada1,2,3,4, que a su vez se puede utilizar como sondas intracelulares de interacciones proteína-proteína.....

Protocolo

1. Preparación de reactivos

1. PBS (solución salina tamponada con fosfato): Mezcle 50 ml de 10 x solución de PBS con 450 ml de _H2O ultrapuro. Esterilice por filtración y almacene a 4 °C o temperatura ambiente (~20-25 °C).
2. BSA al 10% (albúmina sérica bovina): Agregue lentamente 1 g de BSA a 7 ml de _H2O ultrapuro y mezcle hasta que se disuelva por completo (sin grumos). Recarga con _H2O ultrapuro hasta que el volumen final sea de 10 mL. Esterilizar por filtración y conservar a 4 °C.
3. Tampón de PB (PBS suplementado con 1% de BSA): Agregue lentamente 5 g de BSA a 400 ml de _H2O ultrapuro y 50 ml de PBS y ....

Resultados

Los aglutinantes producidos a partir de la pantalla de fagos se pueden verificar y analizar de muchas maneras. Se recomienda proceder primero a la secuenciación del fago con cebadores que flanqueen el inserto diversificado en la biblioteca de fagomides. Un experimento de visualización de fagos ideal mostrará un claro sesgo hacia varias secuencias (Figura 1). Otras secuencias también estarán presentes pero con un recuento más bajo, apareciendo más como ruido de fondo. En el ejemplo pro.......

Discusión

Como se mencionó en el paso 2.1 (preparación de proteínas), se puede utilizar una variedad de métodos para evaluar la concentración de proteínas, y cada uno tendrá beneficios e inconvenientes únicos basados en la proteína objetivo específica utilizada para la visualización de fagos. Anteriormente se ha proporcionado una fuente de descripciones y protocolos detallados para métodos ^populares11.

El uso del fago retenido por una ronda anterior de visualización .......

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
Axygen Mini Tube System (0.65 mL, sterile, 96/Rack, 10 Racks/pack)	Fisher Scientific	14-222-198	Culturing phage outputs after phage display.
BD Difco Dehydrated Culture Media: LB Broth, Miller (Luria-Bertani)	Fisher Scientific	DF0446-17-3	Preparing plates for titering.
Bovine Serum Albumin (BSA), Fraction V	BioShop Canada	ALB001	Buffer component.
Carbenicillin disodium salt 89.0-100.5% anhydrous	Millipore-Sigma	C1389-5G	Culturing phagemid-infected cells.
Compact Digital Microplate Shaker	Fisher Scientific	11-676-337	Shaking plates during incubation with the phage library.
Corning Microplate Aluminum Sealing Tape	Fisher Scientific	07-200-684	Sealing phage glycerol stocks.
Dehydrated Agar	Fisher Scientific	DF0140-01-0	Preparing plates for titering.
DS-11 Spectrophotometer/Fluorometer	DeNovix	DS-11 FX+	Protein concentration measurement.
Greiner Bio-One CellStar 96-Well, Non-Treated, U-Shaped-Bottom Microplate	Fisher Scientific	7000133	Storing phage glycerol stocks.
Hydrochloric Acid	Fisher Scientific	A144-500	Phage elution.
Invitrogen One Shot OmniMAX 2 T1R Chemically Competent E. coli	Fisher Scientific	C854003	Bacterial strain for phage infection.
Kanamycin Sulfate	Fisher Scientific	AAJ1792406	Culturing M13K07 helper phage-infected cells.
M13KO7 Helper Phage	New England Biolabs	N0315S	Permit phagemid packing and secretion.
MaxQ 4000 Benchtop Orbital Shaker	Fisher Scientific	11-676-076	Bacterial cell culture.
Nunc MaxiSorp 96 well microplate, flat bottom	Life Technologies	44-2404-21	Immobilizing proteins.
Phosphate Buffered Saline (PBS) 10X Solution	Fisher Scientific	BP3994	Buffer component/phage resuspension medium.
Polyester Films for ELISA and Incubation	VWR	60941-120	Covering the microplates during incubation.
Polyethylene Glycol 8000 (PEG)	Fisher Scientific	BP233-1	Phage precipitation.
Sodium chloride	Millipore-Sigma	S3014	Phage precipitation.
Sterile Plastic Culture Tubes: Translucent Polypropylene	Fisher Scientific	14-956-1D	Culturing phage inputs.
Tetracycline Hydrochloride	Fisher Scientific	BP912-100	Culturing E. coli OmniMax cells.
Tris Base	Fisher Scientific	BP1525	Neutralizing eluted phage solution.
Tryptone Powder	Fisher Scientific	BP1421-2	Cell growth media component.
Tween 20	Fisher Scientific	BP337500	Buffer component.
Yeast Extract	Fisher Scientific	BP1422-2	Cell growth media component.