JoVE Logo
Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • النتائج
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

يقدم هذا البروتوكول تقنيتين لعزل المقصورات تحت الخلوية للمستقبلات الضوئية لقضيب الفئران لتحليل البروتين. تستخدم الطريقة الأولى الشبكية الحية وورق ترشيح السليلوز لفصل الأجزاء الخارجية للقضيب ، بينما تستخدم الطريقة الثانية شبكية العين المجففة بالتجميد والشريط اللاصق لتقشير طبقات القضبان الداخلية والخارجية.

Abstract

المستقبلات الضوئية رود هي خلايا عصبية حسية عالية الاستقطاب مع مقصورات متميزة. قضبان الماوس طويلة (~ 80 ميكرومتر) ورقيقة (~ 2 ميكرومتر) ويتم تعبئتها أفقيا في الطبقة الخارجية من شبكية العين ، طبقة المستقبلات الضوئية ، مما يؤدي إلى محاذاة المقصورات تحت الخلوية المماثلة. تقليديا ، تم استخدام التقسيم العرضي للشبكية المسطحة المجمدة لدراسة حركة وتوطين البروتينات داخل مقصورات قضيب مختلفة. ومع ذلك ، فإن الانحناء العالي لشبكية العين الفأر المهيمنة على القضيب يجعل التقسيم العرضي أمرا صعبا. بدافع من دراسة انتقال البروتين بين المقصورات ، قمنا بتطوير طريقتين للتقشير تعزلان بشكل موثوق الجزء الخارجي للقضيب (ROS) والمقصورات تحت الخلوية الأخرى للبقع الغربية. توفر تقنياتنا السريعة والبسيطة نسبيا كسور غنية ومحددة تحت الخلايا لقياس توزيع وإعادة توزيع بروتينات المستقبلات الضوئية المهمة في القضبان العادية كميا. علاوة على ذلك ، يمكن أيضا تكييف تقنيات العزل هذه بسهولة لعزل تكوين البروتين للطبقات الخلوية الأخرى والتحقيق فيه كميا داخل كل من شبكية العين السليمة والمتدهورة.

Introduction

تعد خلايا المستقبلات الضوئية القضيبية ، المعبأة بإحكام في الطبقة الخارجية من شبكية العين العصبية ، جزءا لا يتجزأ من رؤية الضوء الخافت. للعمل كعدادات فوتون مخلصة ، تستخدم القضبان مسار إشارات قائم على بروتين G ، يسمى النقل الضوئي ، لتوليد استجابات سريعة وتضخيمية وقابلة للتكرار لالتقاط فوتون واحد. تؤدي هذه الاستجابة للضوء في النهاية إلى حدوث تغيير في التيار في غشاء البلازما ويتم الإشارة إليها لاحقا إلى بقية النظام البصري1. كما يوحي اسمها ، فإن كل خلية قضيب لها شكل مميز يشبه القضيب وتظهر مورفولوجيا خلوية شديدة الاستقطاب ، تتكون من جزء خارجي (OS) ، وجزء داخلي (IS) ، وجسم خلية (CB) ، ومحطة متشابكة (ST). تحتوي كل حجرة تحت الخلية على آلات بروتين محددة (مرتبطة بالغشاء وقابلة للذوبان) ، وميزات جزيئية حيوية ، ومجمعات بروتينية تلعب أدوارا حاسمة مثل النقل الضوئي البصري ، والتدبير المنزلي العام وتخليق البروتين ، والانتقال المشبكي 2,3.

منذ أكثر من 30 عاما ، لوحظت لأول مرة الحركة المتبادلة المعتمدة على الضوء للبروتينات دون الخلوية ، وتحديدا transducin (بعيدا عن نظام التشغيل) و arrestin (نحو نظام التشغيل) ، 4،5،6،7. في وقت مبكر، تم استقبال هذه الظاهرة المرصودة بتشكك، ويرجع ذلك جزئيا إلى ضعف الكيمياء النسيجية المناعية لإخفاء الظهارة8. في أوائل عام 2000 ، تم تأكيد نقل البروتين المعتمد على التحفيز باستخدام تقنية تقسيم فيزيائية صارمة وشاقة9. كشف التقسيم العرضي التسلسلي لشبكية القوارض المجمدة المسطحة المثبتة متبوعة بالنشاف المناعي أن transducin9,10 و arrestin11,12 و recoverin13 كلها تخضع لإعادة توزيع تحت الخلايا استجابة للضوء. ويعتقد أن النقل المدفوع بالضوء لبروتينات الإشارات الرئيسية هذه لا ينظم فقط حساسية سلسلة النقل الضوئي9،14،15 ، ولكن قد يكون أيضا واقيا عصبيا ضد تلف الضوء16،17،18. نظرا لأن نقل البروتين المدفوع بالضوء في القضبان يبدو مهما جدا لبيولوجيا الخلية وعلم وظائف الأعضاء ، فإن التقنيات التي تسمح بعزل المقصورات تحت الخلوية المختلفة لتحديد توزيع البروتين هي أدوات بحثية قيمة.

حاليا ، هناك عدد قليل من الطرق التي تهدف إلى عزل المقصورات تحت الخلوية قضيب. ومع ذلك ، يمكن أن تكون هذه الطرق طويلة ويصعب استنساخها ، أو تتطلب كمية كبيرة من عزل الشبكية. على سبيل المثال، تستخدم مستحضرات الجزء الخارجي للقضيب (ROS) عن طريق الطرد المركزي بتدرج الكثافة19 لفصل ROS عن تجانس الشبكية. تستخدم هذه الطريقة على نطاق واسع للبقع الغربية ، ولكن الإجراء يستغرق وقتا طويلا للغاية ويتطلب ما لا يقل عن 8-12 شبكية العين الفئران20. من ناحية أخرى ، تم تنفيذ التقسيم العرضي التسلسلي للفئران المجمدة وشبكية العين الفئران بنجاح في عزل OS ، IS ، CB ، و ST9,11,13. ومع ذلك ، فإن هذه الطريقة صعبة تقنيا بسبب ضرورة تسطيح شبكية العين الفئرانية الصغيرة والمنحنية للغاية بالكامل لمحاذاة طبقات الشبكية قبل التقسيم العرضي. نظرا لوجود عدد كبير من نماذج الفئران والفئران المعدلة وراثيا التي تلخص أمراض الجهاز البصري ، فإن إنشاء تقنية تفصل بشكل موثوق وسريع وسهل بين مقصورات القضبان الفردية يبشر بالخير في الكشف عن العمليات الفسيولوجية التي تحدث في كل حجرة متخصصة والآليات التي تكمن وراء العمليات البصرية في الصحة والمرض.

لتسهيل هذه التحقيقات ، نصف طريقتين للتقشير تعزلان المقصورات تحت الخلوية للقضيب بسهولة أكبر من البروتوكولات الحالية. تستخدم طريقة التقشير الأولى، المقتبسة من تقنية لفضح الخلايا ثنائية القطب المصنفة بالفلورسنت لتسجيل مشبك التصحيح21، ورق ترشيح السليلوز لإزالة ROS بالتتابع من شبكية العين الفئرانية الحية والمعزولة (الشكل 1). الطريقة الثانية، المقتبسة من إجراء يعزل طبقات خلايا الشبكية الأساسية الثلاث من شبكية العين chick22 و frog23، تستخدم شريطا لاصقا لإزالة الجزء الداخلي من ROS وقضيب (RIS) من شبكية العين المجففة بالتجميد (الشكل 2). يمكن إكمال كلا الإجراءين في 1 ساعة وهما سهل الاستخدام إلى حد كبير. نحن نقدم التحقق من فعالية هذين البروتوكولين للفصل للبقع الغربية من خلال استخدام شبكية العين المتكيفة مع الظلام والمعرضة للضوء من الفئران C57BL/6J لإثبات النقل الناجم عن الضوء لترانسدوكين القضيب (GNAT1) والاعتقالين (ARR1). علاوة على ذلك ، باستخدام طريقة تقشير الشريط ، نقدم أدلة إضافية على أنه يمكن استخدام تقنيتنا لفحص ومعالجة التناقضات بين بيانات توطين البروتين التي تم الحصول عليها بواسطة الكيمياء المناعية (ICC) والبقع الغربية. على وجه التحديد ، أظهرت تقنيتنا أن: 1) بروتين كيناز C-alpha (PKCα) isoform موجود ليس فقط في الخلايا ثنائية القطب ، ولكن أيضا في الفئران ROS و RIS ، وإن كان بتركيزات منخفضة24،25 ، و 2) رودوبسين كيناز (GRK1) موجود في الغالب في عينة نظام التشغيل المعزول. توضح هذه البيانات فعالية تقنيتي التقشير لدينا لفصل وتحديد كمية محددة من بروتينات القضيب والشبكية.

Protocol

تم إجراء جميع التجارب وفقا للمبادئ التوجيهية المؤسسية المحلية للجنة رعاية الحيوانات البحثية من جامعة جنوب كاليفورنيا (USC).

1. طريقة تقشير شبكية العين للخلايا الحية

  1. تحضير مخازن أميس المؤقتة، وأوراق التقشير، وطبق التشريح
    1. باستخدام مقص قزحية العين ذو الطرف الحاد (أو نوع مقص مكافئ)، قم بقص ورق ترشيح السليلوز (الصف 413) إلى مستطيلات بقياس 5 مم × 2.5 مم تقريبا. تخزين قصاصات للاستخدام في المستقبل.
    2. قم بإعداد 1 لتر من مخزن HEPES العازل من Ames من خلال الجمع بين زجاجة واحدة من Ames' Medium و 2.38 جم HEPES و 0.877 جم من كلوريد الصوديوم. قم بإذابة الكواشف في زجاجة زجاجية معقمة بالماء المقطر فائق النقاء واضبط الأسمولية والرقم الهيدروجيني إلى 280 mOsm و 7.4 ، على التوالي. مرشح للتعقيم (حجم المسام 0.2 ميكرومتر) ، وختم الغطاء مع فيلم البارافين ، وتخزينها في 4 درجة مئوية.
    3. قم بإعداد 1 لتر من عازل البيكربونات من Ames من خلال الجمع بين زجاجة واحدة من Ames' Medium و 1.9 جم من NaHCO3. قم بإذابة الكواشف في زجاجة زجاجية معقمة بالماء المقطر فائق النقاء واضبط الأسمولية والرقم الهيدروجيني إلى 280 mOsm و 7.4 ، على التوالي. مرشح للتعقيم (حجم المسام 0.2 ميكرومتر) ، وختم الغطاء مع فيلم البارافين ، وتخزينها في 4 درجة مئوية.
      ملاحظة: يمكن تحضير مخازن AMES و Ames البيكربونات مسبقا وتخزينها لمدة 1 أسبوع عند 4 درجات مئوية.
    4. في الجزء السفلي من طبق بتري 35 × 10 مم ، قم بإنشاء نمط شعري أو رقعة شطرنج باستخدام مشرط (شفرة رقم 11 ، 40 مم).
      ملاحظة: الجزء السفلي المحكم من طبق بتري يثبت العين المعزولة العائمة بحرية في مكانها أثناء تشريح الشبكية.
  2. تشريح الشبكية
    ملاحظة: بالنسبة لهذا الإجراء، يجب إحضار المخزن المؤقت والاحتفاظ به في درجة حرارة الغرفة (RT). قم بتحديث المخزن المؤقت للبيكربونات من Ames كل 15 دقيقة باستخدام المخزن المؤقت للبيكربونات من Ames الطازج أثناء التشريح. هذا يحافظ على درجة الحموضة الفسيولوجية اللازمة.
    1. قبل حوالي 15-20 دقيقة من التشريح ، قم بأكسجة مخزن HEPES المؤقت من Ames في مختبر 100 مل أو زجاجة وسائط مجهزة بمحول غطاء أنابيب وفقاعة المخزن المؤقت للبيكربونات من Ames مع 95٪ O2 و 5٪ CO2 في غرفة حضانة الأنسجة وفي مختبر 100 مل أو زجاجة وسائط مجهزة بمحول غطاء الأنابيب.
    2. القتل الرحيم لعدد متساو من كلا الجنسين من الفئران C57BL/6J (2-3 أشهر) إما عن طريق استنشاق الأيزوفلوران أو ثاني أكسيد الكربون (CO2) تليها خلع عنق الرحم. قم بنزع العينين بمقص منحني ووضع العينين في طبق بتري المحكم 35 × 10 مم المليء بعازل بيكربونات Ames الفقاعي.
    3. قم بإنشاء كوب عين (الشكل 1A) عن طريق ثقب ثقب عند تقاطع القرنية الطرفية بإبرة 18 G. قطع على طول محيط هذا التقاطع باستخدام مقص القزحية تشريح دقيق لإزالة القرنية من كل عين. افصل العدسة والفكاهة الزجاجية عن كل عين باستخدام ملاقط وتخلص منها.
    4. عزل الشبكية عن كأس العين عن طريق تقشير الظهارة المصطبغة في الشبكية (RPE)-الصلبة-المشيمية بعناية بعيدا عن الشبكية العصبية. تخلص من مجمع RPE-sclera-choroid. تأكد من عدم تلف شبكية العين أثناء التشريح من خلال التعامل مع الحواف فقط.
    5. انقل شبكية العين المعزولة باستخدام ماصة نقل واسعة التجويف إلى غطاء طبق 60 × 15 مم مملوء بمخزن بيكربونات Ames الزجاجي الفقاعي.
    6. قم بتوجيه شبكية العين على شكل نصف الكرة الأرضية مقعرة لأعلى (المستقبلات الضوئية متجهة لأسفل نحو أسفل الطبق) وقم بتقطيع كل شبكية (من خلال العصب البصري) باستخدام مقص القزحية أو مشرط (الشفرة رقم 10 ، 40 مم). قم بقص الحواف المنحنية لكل نصف شبكية العين لإنشاء مستطيلين (الشكل 1A).
      ملاحظة: إن تقليل انحناء كل شبكية منقطعة إلى النصف يسمح للشبكية بالتسطيح بشكل أفضل في خطوات التقشير اللاحقة وينتج تقشيرا دقيقا لطبقة الجزء الخارجي من القضيب (ROS).
    7. قم بتخزين الشبكية المقطعة إلى النصف في غرفة حضانة الأنسجة التي يتم فقاعتها باستمرار بنسبة 95٪ O2 و 5٪ CO2.
      ملاحظة: يمكن الاحتفاظ بالشبكية المعزولة في المخزن المؤقت للبيكربونات في Ames المكربن لمدة 24 ساعة تقريبا.
  3. جمع الجزء الخارجي من قضيب (ROS) عن طريق تقشير ورق الترشيح
    ملاحظة: قم بتحديث المخزن المؤقت ل HEPES من Ames المؤكسج RT كل 15-20 دقيقة أثناء عملية التقشير للحفاظ على درجة الحموضة الفسيولوجية اللازمة.
    1. انقل مستطيلا واحدا للشبكية من غرفة الأنسجة باستخدام ماصة نقل واسعة التجويف وقطعة من ورق الترشيح مقاس 5 مم × 2.5 مم إلى طبق بتري 35 × 10 مم مملوء بمخزن مؤقت HEPES من Ames مع فقاعات O2 بنسبة 100٪.
    2. قم بتوجيه مقعر شبكية العين المقسمة لأعلى وتأكد من أن المستقبلات الضوئية متجهة لأسفل نحو أسفل الطبق. أمسك برفق جوانب شبكية العين المقطعة إلى نصفين باستخدام ملاقط وحركها فوق ورق الترشيح. بمجرد تمركز شبكية العين على ورق الترشيح، حرك ورقة الترشيح لأعلى حتى تلمس شبكية العين المقطعة إلى النصف ورقة الترشيح لإنشاء التصاق ROS إلى ورقة الترشيح (الشكل 1B).
      ملاحظة: تأكد من أن طبقة المستقبلات الضوئية تتلامس مباشرة مع ورق التصفية.
    3. ارفع ورقة الترشيح بعناية مع شبكية العين المرفقة خارج المخزن المؤقت HEPES من Ames. ضع الجانب السفلي من ورق الترشيح (الجانب بدون شبكية العين) على منشفة ورقية وربت 2-3 مرات حتى تجف (الشكل 1B).
    4. أضف قطرة من HEPES من Ames على جانب ورقة الترشيح مع شبكية العين. ضع ورقة الترشيح على المنشفة الورقية مرة أخرى حتى تجف ، كما هو موضح للتو. كرر هذه العملية مرتين أخريين.
    5. ضع ورقة الترشيح مع شبكية العين مرة أخرى في طبق بتري. باستخدام ملاقط ، ادفع بلطف جميع حواف شبكية العين المقطعة إلى النصف لأعلى وبعيدا عن ورق الترشيح من جميع الجوانب.
    6. قشر شبكية العين بدقة بعيدا عن ورق الترشيح. المس فقط المحيط الأقصى للشبكية أثناء عملية التقشير للحفاظ على السلامة الهيكلية للشبكية.
    7. ارفع ورقة الترشيح من طبق بتري وأزل السائل الزائد على منشفة ورقية. تأكد من أن الجانب الذي كان على اتصال مع شبكية العين لا يتصل بالمنشفة الورقية.
    8. ضع ورقة الترشيح مع طبقة ROS الجزئية في أنبوب ملصق على الجليد (الشكل 1B). حافظ على شبكية العين المقشرة مغمورة في مخزن HEPES المؤقت من Ames.
    9. كرر عملية التقشير لهذه الشبكية المقطعة إلى النصف حوالي 7-8 مرات لإزالة طبقة ROS بأكملها. بعد كل تقشير ، ضع ورقة الترشيح في نفس الأنبوب ، والذي سيحتوي على ROS المعزول من شبكية العين المقطعة إلى نصفين.
      ملاحظة: احرص على عدم تمزيق الشبكية المقطعة إلى نصفين عند تقشيرها بعيدا عن ورقة الترشيح، حيث تصبح الشبكية أرق أثناء هذه العملية.
    10. ضع الأنبوب الذي يحتوي على جميع قشور ورق الترشيح من ROS المعزول على الثلج للاستخدام الفوري أو قم بتجميده مباشرة على الثلج الجاف وخزنه على درجة حرارة -80 درجة مئوية.
    11. استخدم ملاقط لنقل بقايا الشبكية المقشرة (التي تفتقر إلى ROS) إلى أنبوب يحمل علامة مناسبة. ضع الأنبوب على الثلج للاستخدام الفوري أو قم بتجميده بالثلج الجاف وخزنه على درجة حرارة -80 درجة مئوية.
    12. كرر عملية التقشير لكل شبكية مقطعة إلى نصفين وقم بتسمية كل أنبوب بدقة.

2. طريقة تقشير الشبكية المجمدة

  1. المخازن المؤقتة، ووسائط التقشير، وإعداد أطباق التشريح، وإعداد المسكنات
    1. في زجاجة تخزين سعة 1 لتر ، قم بإعداد محلول Ringer بإضافة 500 مل من الماء المقطر فائق النقاء. قم بإذابة الكواشف للوصول إلى تركيز نهائي يبلغ 130 ملليمتر كلوريد الصوديوم ، و 3.6 ملليمتر KCl ، و 2.4 ملليمتر MgCl2 ، و 1.2 ملم CaCl2 ، و 10 ملليمتر HEPES ، و 0.02 ملليمتر EDTA. اضبط الرقم الهيدروجيني على 7.4 باستخدام NaOH ، وأضف ماء فائق النقاء ليصل الحجم النهائي إلى 1 لتر ، واضبط الأسمولية على 313 mOsm.
    2. قبل الاستخدام ، قم بتصفية محلول Ringer بفلتر معقم (حجم المسام 0.2 ميكرومتر) ، وأغلق الغطاء بفيلم البارافين ، وخزنه عند 4 درجات مئوية.
    3. باستخدام مقص قزحية العين ذو الطرف الحاد (أو نوع مقص مكافئ) ، قم بقص ورق ترشيح السليلوز إلى مستطيلات بقياس 5 مم × 2.5 مم تقريبا. استخدم قلم رصاص للكتابة على جانب واحد من ورقة الترشيح لإنشاء ملصق فريد.
    4. قم بإنشاء نمط شعري أو رقعة شطرنج في الجزء السفلي من طبق بتري 35 × 10 مم باستخدام مشرط (شفرة رقم 11 ، 40 مم).
    5. قم بتشغيل lyophilizer وفقا لمواصفات الشركة المصنعة.
    6. احصل على النيتروجين السائل في قارورة ديوار أو قارورة فراغ عازلة مماثلة.
  2. تشريح الشبكية
    1. أكمل تشريح الشبكية كما هو موضح في القسم 1 من البروتوكول (الشكل 1A). استخدم حل Ringer البارد بدلا من المخزن المؤقت ل Ames.
    2. بعد التشريح ، قم بتخزين الشبكية المستطيلة إلى نصفين في طبق بتري 35 × 10 مم مملوء بمحلول رينجر البارد وضعه على الثلج.
  3. إعداد عينة شبكية العين من أجل التجفيد
    1. ضع قطعة من ورق الترشيح مقاس 5 × 2.5 مم وانقل شبكية العين المقطعة إلى النصف في طبق بتري 35 × 10 مم المملوء بمخزن Ringer العازل البارد. استخدم ماصة نقل واسعة التجويف لنقل كل شبكية بين الأطباق.
    2. استخدم الملقط لقلب شبكية العين بعناية بحيث تكون مقعرة لأعلى (المستقبلات الضوئية تشير إلى الأعلى) وحركها بحيث تستقر فوق ورقة الترشيح (الشكل 2A).
      ملاحظة: تأكد من أن المستقبلات الضوئية لا تلامس ورقة الترشيح (يجب أن تكون طبقة الخلايا العقدية الشبكية على اتصال مباشر مع ورقة الترشيح) وأن الملصق الفريد مرئي. لتحديد عزل الشبكية بسهولة وسرعة، يوصى بوضع الملصق الفريد على الجانب السفلي من ورقة الترشيح.
    3. ارفع ورق الترشيح من الحواف لأعلى حتى تلمس قطعة شبكية العين المقطعة إلى النصف ورقة الترشيح واستمر في رفع ورق الترشيح من محلول رينجر.
    4. ضع الجانب السفلي من ورقة الترشيح (الجانب بدون شبكية العين عليه) على منشفة ورقية وربت بعناية 2-3 مرات لإزالة السائل الزائد (الشكل 2A).
    5. التقط ورق الترشيح باستخدام ملاقط وأضف قطرة من Ringer البارد على جانب ورق الترشيح مع شبكية العين. ضع ورقة الترشيح على المنشفة الورقية مرة أخرى لإزالة السائل الزائد. كرر العملية مرتين أخريين.
      ملاحظة: تضمن خطوات الترطيب والتجفيف بالتناوب هذه تثبيت الأنسجة بإحكام على ورق الترشيح.
    6. قم بتخزين كل عينة من ورق الشبكية / الترشيح الملتصق في طبق بتري مملوء ب Ringer's البارد حتى يصبح جاهزا لتجميد جميع العينات. كرر هذه العملية لجميع شبكية العين المقطعة إلى النصف.
    7. احصل على طبق بتري نظيف وجاف 35 × 10 مم (أسفل فقط) وقطعة من رقائق الألومنيوم مقطعة إلى مربع 3.5 × 3.5 بوصة.
    8. ارفع كل عينة من المخزن المؤقت ل Ringer البارد باستخدام ملاقط. تأكد من أن الملقط يلامس حواف ورق الترشيح فقط ، وتجنب شبكية العين المقطعة إلى النصف.
    9. ضع الجانب السفلي من كل ورقة ترشيح (الجانب بدون شبكية العين عليها) على منشفة ورقية وقم بإزالة السائل الزائد.
    10. أضف قطرة من PBS 1x البارد (137 mM NaCl ، 2.7 mM KCl ، 10 mM Na2HPO4 ، 2 mM KH2PO4 ، الرقم الهيدروجيني 7.4) على جانب ورقة الترشيح حيث يتم التصاق شبكية العين. ضع ورقة الترشيح على المنشفة الورقية لإزالة السائل الزائد.
      ملاحظة: تأكد من إزالة الرطوبة من ورق الترشيح بشكل كاف قبل التجميد.
    11. ضع جميع قطع ورق الترشيح في طبق بتري 35 × 10 مم. استخدم مناديل ورقية خالية من الوبر للتخلص من أي سائل زائد يحيط بورق الترشيح.
      ملاحظة: لا تكدس طبق بتري بالعينات. إذا تم استخدام أكثر من أربع عيون فئران ، ففكر في استخدام طبق بتري أكبر أو عدة أطباق بتري أصغر حجما للاحتفاظ بعينات شبكية العين / ورق التصفية.
    12. لف الطبق بالكامل بإحكام بورق الألومنيوم. تأكد من تأمين حواف رقائق الألومنيوم وضغطها بسلاسة في الجزء السفلي من طبق بتري. ثقب حفنة من ثقوب 0.1-0.2 مم في غطاء رقائق الألومنيوم (الشكل 2A).
    13. باستخدام ملقط معدني ، قم بخفض طبق بتري المغطى بورق الألومنيوم تدريجيا إلى النيتروجين السائل. احتفظ بالعينات في النيتروجين السائل (<10 دقائق) حتى تصبح جاهزة للتجميد.
  4. التجفيد
    1. ضع طبق بتري المغطى بورق الألمنيوم في قارورة تجفيف بالتجميد وقم بإرفاقها بآلة lyophilizer وفقا لبروتوكول الشركة المصنعة. قم بتجميف شبكية العين لمدة 30 دقيقة.
    2. افصل القارورة عن lyophilizer وأغلق الجهاز وفقا للشركة المصنعة.
    3. قم بإزالة رقائق الألومنيوم وإما العمل مع العينات المجففة بالتجميد في نفس اليوم أو تخزينها في أنابيب الطرد المركزي الدقيقة 1 مل المصنفة بشكل صحيح. ضع هذه الأنابيب في حاوية (مثل أنبوب مخروطي سعة 50 مل) مملوء بمجفف لامائي وخزن العينات عند -80 درجة مئوية.
  5. جمع الجزء الخارجي والداخلي من قضيب عن طريق تقشير الشريط اللاصق.
    1. قم بقص شرائط من الشريط اللاصق الشفاف (1-2 سم) وقم بتخزين الشرائط على حافة موزع الشريط / مقعد المختبر / إلخ للاستخدام السريع.
    2. انقل عينة شبكية واحدة إلى غطاء طبق بتري بلاستيكي 60 × 15 مم للتقشير. تأكد من الإمساك فقط بالحواف الخارجية لورق الترشيح وتجنب لمس شبكية العين.
    3. باستخدام مقص القزحية ذو الطرف الحاد (أو نوع مقص مكافئ) ، قم بقص قطعة صغيرة مستطيلة من الشريط إلى الحجم التقريبي للنسيج (1.5 × 2.5 مم).
    4. ضع بعناية قطعة صغيرة من الشريط فوق شبكية العين المجففة بالتجميد (الشكل 2B) وقم بتطبيق ضغط طفيف مع الملقط للتأكد من ارتباطها بطبقة المستقبلات الضوئية (الطبقة العليا ذات اللون البرتقالي / الوردي).
    5. قشر الشريط ببطء. سيتم الالتزام بكل من الجزء الخارجي للقضيب (ROS) والجزء الداخلي للقضيب (RIS) بالشريط (الشكل 2B).
    6. تأكد من وجود طبقة بيضاء رقيقة على السطح المكسور. هذا هو RIS.To فصل RIS ، ووضع قطعة أخرى من الشريط ودفع الشريط لأسفل على السطح المكسور (الشكل 2B).
      ملاحظة: قد يستغرق الأمر أكثر من قطعة واحدة من الشريط لإزالة الطبقة البيضاء الرقيقة بالكامل.
    7. ضع قطعة الشريط مع الطبقة البرتقالية / الوردية فقط في أنبوب طرد مركزي دقيق يحمل علامة +ROS.
    8. ضع الشريط أو قطع الشريط مع الطبقة البيضاء الرقيقة في أنبوب طرد مركزي دقيق يحمل علامة +RIS.
      ملاحظة: يتطلب فصل شبكية العين المجففة بالتجميد بشريط تدريبي. سيؤثر مقدار الضغط المطبق على الشريط على كيفية كسر العينة المجففة بالتجميد. إذا تم وضع الكثير من الضغط على الشريط فوق العينة ، فإن شبكية العين المجففة بالتجميد بالكامل سوف تقشر ورقة الترشيح وستلتصق بالشريط. إذا تمت إضافة ضغط قليل جدا إلى الشريط ، فلن تلتصق الطبقة العليا البرتقالية / الوردية (+ROS) بالشريط.
    9. اجمع أنسجة الشبكية المتبقية (المجردة من طبقات ROS و RIS ، -OIS) الموجودة على ورق الترشيح عن طريق تقشير الطبقة البيضاء السميكة من ورق الترشيح باستخدام الشريط. ضع العزل في أنبوب يحمل علامة -OIS.
    10. كرر هذه الخطوات لكل عينة شبكية مقطعة إلى نصفين.
    11. قم بتخزين الطبقات المعزولة من شبكية العين المجففة بالتجميد إما في درجة حرارة الغرفة إذا كان إجراء قياس كمي للبروتين ، والرحلان الكهربائي الهلامي ، وبقع مناعية للبروتين في نفس اليوم ، أو تخزينها في حاوية (مثل أنبوب مخروطي 50 مل) مملوء بمجفف لامائي عند -80 درجة مئوية للاستخدام لاحقا.

3. إعداد عينة لطخة غربية لعزل التقشير

  1. إعداد المخزن المؤقت لتحلل RIPA
    1. في زجاجة تخزين 100 مل ، أضف الكواشف للحصول على تركيز نهائي من 50 mM Tris-HCl pH 7.4 ، 150 mM NaCl ، 1٪ Triton X-100 ، 1٪ Sodium deoxycholate ، 0.1٪ SDS ، و 1 mM EDTA. أضف 100 مل من الماء فائق النقاء منزوع الأيونات واخلطه جيدا.
      ملاحظة: يمكن تخزين المخزن المؤقت لتحلل RIPA عند 2-8 درجة مئوية لمدة 2-3 أسابيع. للتخزين لفترة أطول ، قم بتخزينه وتخزينه في الفريزر -20 درجة مئوية.
    2. في يوم التجربة ، أضف كوكتيل مثبط للأنزيم البروتيني (0.1 M PMSF و 1:1000 Aprotinin و 1:1000 Leupeptin) إلى مخزن RIPA العازل للتحلل واحتفظ به على الجليد.
  2. ورقة تصفية تقشير ليسات التحضير لبقعة الغربية
    1. تأكد من الحفاظ على الأنابيب التي تحتوي على قشور ورق الترشيح والشبكية المقشرة المتبقية على الجليد (للتجربة في نفس اليوم) أو إزالتها من تخزين الفريزر -80 درجة مئوية ووضعها على الجليد.
    2. قم بإزالة أي سائل زائد من أسفل أنابيب الطرد المركزي الدقيقة التي تحتوي على قشور ورق الترشيح. قم بالدوران بسرعة في جهاز طرد مركزي صغير لمدة 2-4 ثوان وتخلص من أي سائل متبقي.
    3. ماصة 45-55 ميكرولتر من المخزن المؤقت RIPA البارد في أنابيب تحتوي على ورقة تصفية معزولة.
    4. قم بتجانس كل عينة باستخدام خلاط مدقة نظيف ومعقم لمدة 1 دقيقة. تأكد من بقاء ورق الترشيح على اتصال بخلاط المدقة. احتفظ بورقة الترشيح على جانب كل أنبوب بدلا من أسفلها.
    5. باستخدام الملقط ، حرك أوراق الترشيح إلى جانب كل أنبوب وقم بالدوران في جهاز الطرد المركزي الصغير لمدة 2-4 ثوان. سيؤدي ذلك إلى إزالة المخزن المؤقت RIPA من ورقة التصفية.
    6. قم بإزالة ورق الترشيح المجفف وكرر ذلك لجميع أوراق الترشيح داخل كل أنبوب إذا لزم الأمر.
    7. انقل المتجانس إلى أنبوب جديد وقم بتسميته بشكل مناسب.
      ملاحظة: هذه هي الخطوة الأكثر استهلاكا للوقت ، وإذا لم تكتمل بشكل صحيح ، امتصاص الكثير من العينة بواسطة ورقة الترشيح.
    8. ماصة 60-80 ميكرولتر من المخزن المؤقت RIPA الباردة في الأنابيب الفردية مع بقايا شبكية العين المقشرة.
    9. قم بتجانس كل عينة باستخدام خلاط مدقة نظيف ومعقم لمدة 1 دقيقة.
  3. شريط تقشير Lysate التحضير لبقعة الغربية
    1. ضع عينات RT المجففة بالتجميد أو عينات -80 درجة مئوية على الجليد.
    2. ماصة 50-70 ميكرولتر من المخزن المؤقت RIPA البارد في كل أنبوب يحتوي على + ROS و + RIS قشور الشريط.
    3. ماصة 60-80 ميكرولتر من التحلل البارد المخزن المؤقت في أنابيب -OIS التي تحتوي على الشبكية المجمدة المتبقية ، مع إزالة ROS و RIS.
    4. تجانس كل عينة باستخدام خلاط مدقة نظيف لمدة 1 دقيقة. تأكد من أن الشريط الموجود في الأنابيب الفردية يبقى على اتصال بخلاط المدقة والمخزن المؤقت للتحليل.
    5. باستخدام ملاقط معقمة ، حرك الشريط إلى جانب الأنابيب وقم بالدوران باستخدام جهاز طرد مركزي صغير لمدة 2-4 ثوان. سيؤدي ذلك إلى إزالة السائل من الشريط. قم بإزالة الشريط المجفف من الأنابيب.
      ملاحظة: في هذه المرحلة، يمكنك الجمع بين عزلين نصف شبكية العين من نفس الشبكية إما لطريقة "تقشير ورق التصفية" أو "تقشير الشريط" لضمان حصولك على حجم كاف لإجراء فحص حمض البيتشينكونينيك (BCA).

النتائج

تم تطوير الاستراتيجيات الحالية لتوفير طرق سريعة وبسيطة نسبيا لعزل وتحليل البروتينات بين مقصورات دون خلية قضيب محددة لتحليل اللطخة الغربية. طبقنا تقنيتين متتابعتين للتقشير (الشكل 1 والشكل 2) متبوعتين بالنشاف المناعي لإثبات أنه يمكن استخدام هذه الطرق بشكل م...

Discussion

تؤثر العديد من أمراض الشبكية على خلايا المستقبلات الضوئية للقضيب ، مما يؤدي إلى موت القضيب ، وفي النهاية ، فقدان البصر الكامل37. تم تلخيص جزء كبير من الأصول الجينية والميكانيكية لتنكس الشبكية البشري بنجاح في العديد من نماذج الفئران على مر السنين. وفي هذا السياق، فإن القدرة على...

Disclosures

ويعلن صاحبا البلاغ أنه ليس لديهما مصالح متنافسة.

Acknowledgements

تم دعم هذا العمل من قبل NIH Grant EY12155 و EY027193 و EY027387 إلى JC. نحن ممتنون للدكتور سبيريدون ميشالاكيس (معهد كاليفورنيا للتكنولوجيا، باسادينا، الولايات المتحدة الأمريكية) وناتالي تشن (جامعة جنوب كاليفورنيا، لوس أنجلوس، الولايات المتحدة الأمريكية) لتدقيق المخطوطة. نود أيضا أن نشكر الدكتور سيث روفينز (USC ، لوس أنجلوس ، الولايات المتحدة الأمريكية) والدكتور يانوس بيتي بيتردي (USC ، لوس أنجلوس ، الولايات المتحدة الأمريكية) على توفير المعدات اللازمة لجمع اللقطات المقدمة من المؤلف. مادة من: كاسي روز وآخرون ، فصل مقصورات خلايا المستقبلات الضوئية في شبكية العين الفأر لتحليل البروتين ، التنكس العصبي الجزيئي ، نشر [2017] ، [Springer Nature].

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
100 mL laboratory or media bottle equipped with a tubing cap adapterN/AN/A
100% O2 tankN/AN/A
1000mL Bottle Top Filter, PES Filter Material, 0.22 μmGenesee Scientific25-235
4X SDS Sample BufferMillipore Sigma70607-3
50 mL Falcon tubeFisher Scientific14-432-22
95% O2 and 5% CO2 tankN/AN/A
Ames’ Medium with L-glutamine, without bicarbonateSigma-AldrichA1420
CaCl2 (99%, dihydrate)SigmaC-3881
Drierite (Anhydrous calcium sulfate, >98% CaSO4, >2% CoCl2)WA Hammond Drierite Co LTD21005
Falcon Easy-Grip Petri Dish (polystyrene, 35 x 10 mm)Falcon-Corning08-757-100A
Falcon Easy-Grip Tissue Culture Dish (60 x 15 mm)Falcon-Corning08-772F
Feather Scalpel (No. 10, 40 mm)VWR100499-578
Feather Scalpel (No. 11, 40 mm)VWT100499-580
KCl (99%)SigmaP-4504
Kimble Kontes pellet pestleSigmaz359971
Labconco Fast-Freeze FlasksLabconcoN/A
LN2 (liquid nitrogen) + Dewar flask or similar vacuum flaskN/AN/A
MgCl2SigmaM-9272
Milli-Q/de-ionized waterEMD MilliporeN/A
Na2HPO4 (powder)J.T. Baker4062-01
NaCl (crystal)EMD MilliporeSx0420-3
NaHCO3Amresco0865
OmniPur EDTAEMD4005
OmniPur HEPES, Free AcidEMD5320
Parafilm MSigma-AldrichP7793
Reynolds Wrap Aluminum FoilReynolds BrandsN/A
Scotch Magic Tape (12.7 mm x 32.9 m)Scotch-3MN/A
Sodium deoxycholateSigma-AldrichD67501
Spectrafuge mini centrifugeLabnet International, IncC1301
Tissue incubation chamber (purchased or custom made)N/AN/A
Tris-HClJ.T.Baker4103-02
Triton X-100Signma-AldrichT8787
VirTis Benchtop 2K Lyophilizer or equivalent machineSP ScientificN/A
VWR Grade 413 Filer Paper (diameter 5.5 cm, pore size 5 μm)VWR28310-015
Whatman Grade 1 Qualitative Filter Paper (diameter 9 cm, pore size 11 μm)Whatman/GE Healthcare1001-090
Wide bore transfer pipet, Global ScientificVWR76285-362

References

  1. Arshavsky, V. Y., Lamb, T. D., Pugh, E. N. G proteins and phototransduction. Annual Review of Physiology. 64, 153-187 (2002).
  2. Molday, R. S., Moritz, O. L. Photoreceptors at a glance. Journal of Cell Science. 128 (22), 4039-4045 (2015).
  3. Koch, K. W., Dell'Orco, D. Protein and signaling networks in vertebrate photoreceptor cells. Frontiers in Molecular Neuroscience. 8, 67 (2015).
  4. Semple-Rowland, S. L., Dawson, W. W. Cyclic light intensity threshold for retinal damage in albino rats raised under 6 lx. Experimental Eye Research. 44 (5), 643-661 (1987).
  5. Brann, M. R., Cohen, L. V. Diurnal expression of transducin mRNA and translocation of transducin in rods of rat retina. Science. 235 (4788), 585-587 (1987).
  6. Philp, N. J., Chang, W., Long, K. Light-stimulated protein movement in rod photoreceptor cells of the rat retina. FEBS Letters. 225 (1-2), 127-132 (1987).
  7. Broekhuyse, R. M., Tolhuizen, E. F., Janssen, A. P., Winkens, H. J. Light induced shift and binding of S-antigen in retinal rods. Current Eye Research. 4 (5), 613-618 (1985).
  8. Roof, D. J., Heth, C. A. Expression of transducin in retinal rod photoreceptor outer segments. Science. 241 (4867), 845-847 (1988).
  9. Sokolov, M., et al. Massive light-driven translocation of transducin between the two major compartments of rod cells: a novel mechanism of light adaptation. Neuron. 34 (1), 95-106 (2002).
  10. Lobanova, E. S., et al. Transducin translocation in rods is triggered by saturation of the GTPase-activating complex. The Journal of Neuroscience. 27 (5), 1151-1160 (2007).
  11. Strissel, K. J., Sokolov, M., Trieu, L. H., Arshavsky, V. Y. Arrestin translocation is induced at a critical threshold of visual signaling and is superstoichiometric to bleached rhodopsin. The Journal of Neuroscience. 26 (4), 1146-1153 (2006).
  12. Nair, K. S., et al. Light-dependent redistribution of arrestin in vertebrate rods is an energy-independent process governed by protein-protein interactions. Neuron. 46 (4), 555-567 (2005).
  13. Strissel, K. J., et al. Recoverin undergoes light-dependent intracellular translocation in rod photoreceptors. The Journal of Biological Chemistry. 280 (32), 29250-29255 (2005).
  14. Calvert, P. D., Strissel, K. J., Schiesser, W. E., Pugh, E. N., Arshavsky, V. Y. Light-driven translocation of signaling proteins in vertebrate photoreceptors. Trends in Cell Biology. 16 (11), 560-568 (2006).
  15. Majumder, A., et al. Transducin translocation contributes to rod survival and enhances synaptic transmission from rods to rod bipolar cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (30), 12468-12473 (2013).
  16. Fain, G. L. Why photoreceptors die (and why they don't). BioEssays. 28 (4), 344-354 (2006).
  17. Chen, J., Simon, M. I., Matthes, M. T., Yasumura, D., LaVail, M. M. Increased susceptibility to light damage in an arrestin knockout mouse model of Oguchi disease (stationary night blindness). Investigative Ophthalmology & Visual Science. 40 (12), 2978-2982 (1999).
  18. Song, X., et al. Arrestin-1 expression level in rods: balancing functional performance and photoreceptor health. Neuroscience. 174, 37-49 (2011).
  19. McConnell, D. G. The isolation of retinal outer segment fragments. The Journal of Cell Biology. 27 (3), 459-473 (1965).
  20. Tsang, S. H., et al. Role for the target enzyme in deactivation of photoreceptor G protein in vivo. Science. 282 (5386), 117-121 (1998).
  21. Walston, S. T., Chow, R. H., Weiland, J. D. Patch clamp recordings of retinal bipolar cells in response to extracellular electrical stimulation in wholemount mouse retina. Annual International Conference of the IEEE Engineering in Medicine and Biology Society. 2015, 3363-3366 (2015).
  22. Guido, M. E., et al. A simple method to obtain retinal cell preparations highly enriched in specific cell types. Suitability for lipid metabolism studies. Brain Research. Brain Research Protocols. 4 (2), 147-155 (1999).
  23. Hayashi, F., et al. Phosphorylation by cyclin-dependent protein kinase 5 of the regulatory subunit of retinal cGMP phosphodiesterase. II. Its role in the turnoff of phosphodiesterase in vivo. The Journal of Biological Chemistry. 275 (42), 32958-32965 (2000).
  24. Wolbring, G., Cook, N. J. Rapid purification and characterization of protein kinase C from bovine retinal rod outer segments. European Journal of Biochemistry. 201 (3), 601-606 (1991).
  25. Williams, D. S., et al. Characterization of protein kinase C in photoreceptor outer segments. Journal of Neurochemistry. 69 (4), 1693-1702 (1997).
  26. Watson, A. J., Aragay, A. M., Slepak, V. Z., Simon, M. I. A novel form of the G protein beta subunit Gbeta5 is specifically expressed in the vertebrate retina. The Journal of Biological Chemistry. 271 (45), 28154-28160 (1996).
  27. Makino, E. R., Handy, J. W., Li, T., Arshavsky, V. Y. The GTPase activating factor for transducin in rod photoreceptors is the complex between RGS9 and type 5 G protein beta subunit. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 96 (5), 1947-1952 (1999).
  28. Chen, J., Shi, G., Concepcion, F. A., Xie, G., Oprian, D. Stable rhodopsin/arrestin complex leads to retinal degeneration in a transgenic mouse model of autosomal dominant retinitis pigmentosa. The Journal of Neuroscience. 26 (46), 11929-11937 (2006).
  29. Chen, C. K., et al. Abnormal photoresponses and light-induced apoptosis in rods lacking rhodopsin kinase. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 96 (7), 3718-3722 (1999).
  30. Zhang, H., et al. Mistrafficking of prenylated proteins causes retinitis pigmentosa 2. FASEB Journal. 29 (3), 932-942 (2015).
  31. Weiss, E. R., et al. Species-specific differences in expression of G-protein-coupled receptor kinase (GRK) 7 and GRK1 in mammalian cone photoreceptor cells: implications for cone cell phototransduction. The Journal of Neuroscience. 21 (23), 9175-9184 (2001).
  32. Zhao, X., Huang, J., Khani, S. C., Palczewski, K. Molecular forms of human rhodopsin kinase (GRK1). The Journal of Biological Chemistry. 273 (9), 5124-5131 (1998).
  33. Newton, A. C., Williams, D. S. Involvement of protein kinase C in the phosphorylation of rhodopsin. The Journal of Biological Chemistry. 266 (27), 17725-17728 (1991).
  34. Pinzon-Guzman, C., Zhang, S. S., Barnstable, C. J. Specific protein kinase C isoforms are required for rod photoreceptor differentiation. The Journal of Neuroscience. 31 (50), 18606-18617 (2011).
  35. Sokal, I., et al. Identification of protein kinase C isozymes responsible for the phosphorylation of photoreceptor-specific RGS9-1 at Ser475. The Journal of Biological Chemistry. 278 (10), 8316-8325 (2003).
  36. Rose, K., Walston, S. T., Chen, J. Separation of photoreceptor cell compartments in mouse retina for protein analysis. Molecular Neurodegeneration. 12 (1), 28 (2017).
  37. Wright, A. F., Chakarova, C. F., Abd El-Aziz, M. M., Bhattacharya, S. S. Photoreceptor degeneration: genetic and mechanistic dissection of a complex trait. Nature Reviews. Genetics. 11 (4), 273-284 (2010).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

178

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved